在口腔表皮樣癌細胞中c-myc對GS和GLS表達的調控以及對癌瘤生長的裸鼠體內實驗研究

張倩倩 劉思浩 郭亞麗 王濤

谷氨酰胺(Gln)是腫瘤代謝的標志物[1],能夠彌補葡萄糖不足以滿足腫瘤細胞生長的氮源和碳源等能量需求[2],對于腫瘤細胞來說,Gln為其“必需氨基酸”,在缺乏Gln的條件下,腫瘤細胞會發生凋亡,因此阻斷Gln的代謝成為治療癌癥的選擇[3]。而Gln代謝由谷氨酰胺合成酶(GS)與谷氨酰胺酶(GLS)共同調控[4],二者分別掌控Gln的來源及去向,且二者已被認為是癌癥治療的基本靶點[5-6]。 c-myc是原癌基因myc家族中的一個重要成員,通過激活或抑制靶基因的轉錄來調控細胞的代謝、生長、分化、凋亡,進而介導腫瘤的生命活動[7-9],且前期細胞實驗證實GLS及GS高表達與c-myc相關,因此本研究追加動物實驗,并對大體標本進行觀察檢測以更直觀探索c-myc在代謝方面對GLS及GS的調控作用,本次研究由體外實驗深化到體內實驗,為通過調控口腔癌細胞代謝來抑制腫瘤進展的腫瘤治療方式提供更有力的理論基礎。

1 材料及方法

1.1 主要試劑及材料

抗GS抗體、抗GLS抗體、抗c-myc抗體(Abcam, 英國); 二抗(山羊抗兔鼠通用)、PBS 緩沖液、EDTA 抗原修復液、組化試劑盒DAB顯色劑(福州邁新生物科技有限公司); 蘇木素染色液(南京建成生物工程研究所); KB細胞(上海SHBIO); FBS(HyClone, 美國); RPMI1640、 胰酶(Gibco, 美國); TRIZOL試劑盒、 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa, 日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化檢測c-myc、GLS和GS表達 口腔癌標本石蠟包埋切片,脫蠟水化,修復抗原,滴加封閉液,分別滴入一抗抗c-myc抗體(1∶100)、抗GLS抗體(1∶200)、抗GS抗體(1∶100), 4 ℃孵育過夜,PBS沖洗,滴加二抗,室溫孵育10 min,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木精輕度復染、脫水、透明封片,光學顯微鏡觀察。

1.2.2 細胞培養 KB細胞采用RPMI1640(含10%FBS)培養液,在37 ℃、 5% CO2恒溫培養箱中培養。

1.2.3 人源性c-myc真核過表達載體構建并驗證 將KB細胞株接種到6 孔板中,每孔5×105個,細胞長至皿底80%～90%,更換培養基為Opti-MEM,繼續培養,分為三組:實驗組轉染 pEGFP-C1-myc質粒,空載體組轉染 pEGFP-C1c 質粒,設立平行對照組,轉染72 h,分別收集三組細胞,TRIzol試劑盒提取各組細胞的RNA,逆轉錄試劑盒合成cDNA,實時熒光定量PCR實驗檢測目的基因的表達,以 GAPDH為內參基因。

1.2.4 裸鼠移植瘤模型制備并檢測 培養KB細胞至細胞密度達1×108個/mL,重懸細胞,消毒裸鼠背部,正常組、空載體組及c-myc組分別皮下注射0.1 mL的 KB細胞、c-myc過表達對照細胞及c-myc過表達細胞懸液,各6 只,每5 d測量體重,并用公式V=(長度×寬度2)/2計算腫瘤體積。飼養30 d,計算生存率,分離腫瘤并稱重,免疫組化檢測腫瘤中c-myc、 GLS、 GS表達。

1.2.5 統計分析 本研究所有實驗均重復3 次,實驗數據通過GraphPad7.0軟件進行處理。樣本均數間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05被認為具有統計學差異。

2 結 果

2.1 口腔及邊緣組織中c-myc、 GLS和GS的表達

采用免疫組化(IHC)的UltraSensitiveTMS-P法檢測,使用IMAG J 軟件進行強度分析,Graphpad prism 7.0軟件進行數據處理,結果提示,與邊緣組織相比,三者在口腔鱗狀細胞癌標本中均高表達(圖1A),GLS和GS在 T2期表達量最高(P<0.05)(圖1B)。

圖1 標本組織中c-myc、 GLS和GS的表達

2.2 轉染后驗證細胞c-myc表達

轉染后熒光結果示含有c-myc基因的KB細胞熒光強度高于空載組(圖2A),且c-myc mRNA表達水平高(P<0.01)(圖2B)。

2.3 成瘤情況及裸鼠存活情況

注射后第5 天,正常組和空載體組未見腫瘤形成,c-myc組見小米粒大小腫瘤形成,第10 天, 3 組均出現肉眼可見腫瘤,隨時間延長腫瘤體積逐漸增大, 30 d內, 3 組裸鼠均未死亡。

2.4 裸鼠體重變化

注射后第5 天, 3 組實驗動物體重基本保持一致(圖3A),隨著時間延長, 3 組動物體重均有增加,但無差異(圖3B)。

圖3 實驗動物的生長情況及生長分析

2.5 腫瘤體積變化

注射后每隔5 d對腫瘤的生長情況進行觀察、測量,隨著時間延長, c-myc組腫瘤體積大于空載體組,空載體組大于正常組(圖4A)。正常組、空載體組及c-myc組腫瘤體積差距不斷變大, 30 d后, c-myc組顯著增加(P<0.01)(圖4B)。

圖4 裸鼠成瘤30 d后腫瘤的體積變化及分析

2.6 腫瘤重量

飼養30 d后,測量腫瘤重量, c-myc組腫瘤質量較高,空載體組腫瘤質量次之,正常組腫瘤質量最小, c-myc組腫瘤重量顯著增加(P<0.01)(圖5),腫瘤質量約是正常組腫瘤質量的2 倍。

2.7 免疫組化結果

飼養30 d后,分離腫瘤,用UltraSensitiveTMS-P免疫組化的方法檢測腫瘤中c-myc、GLS、GS的表達情況,使用IMAG J軟件進行熒光強度分析,Graphpad prism 7.0軟件進行數據處理,結果提示c-myc組GLS和GS表達均顯著高于其他兩組(P<0.01),空載體組與正常組表達相差不大(圖6)。

圖6 實驗動物腫瘤標本中c-myc、GLS和GS表達分析

3 討 論

本研究發現口腔癌標本中c-myc、 GLS、 GS均存在高表達,這與Pai等[10]的研究結果相一致。細胞實驗證實,GLS及GS高表達與c-myc相關,c-myc可上調GLS和GS的表達,從而增強癌細胞的增殖和遷移等生物學行為,進而促進口腔腫瘤的發生發展,本次研究在細胞實驗的基礎上追加動物實驗, 并對大體標本進行觀察檢測,以更直觀探索c-myc與GS及GLS之間的關聯性。

本研究建立了c-myc穩定高表達細胞模型,顯示c-myc過表達組的熒光強度及c-myc mRNA表達水平均顯著高于空載體對照組,細胞模型構建成功。

利用裸鼠皮下成瘤成功率高、周期短的特性[11],結合細胞移植方法構建裸鼠成瘤模型[12],將c-myc穩定高表達癌細胞注射至裸鼠皮下,發現相同條件下,c-myc組的腫瘤體積及重量顯著大于正常組及空載體組,證明c-myc可促進腫瘤細胞增殖、加速成瘤。飼養30 d后,處死小鼠,分離腫瘤, 免疫組化檢測發現c-myc過表達組的GLS及GS表達均顯著高于正常組和空載體組，而c-myc低表達的正常組及空載體組其GLS及GS的表達量也明顯降低，證明c-myc可誘導GLS及GS表達，從而調控癌細胞的Gln代謝，以加速成瘤，而當c-myc表達受到抑制后GLS及GS的表達也明顯下調，從而限制Gln代謝，以抑制腫瘤的形成，因此本實驗可為從代謝角度抑制腫瘤生長提供一定的依據。

4 小 結

利用c-myc穩定高表達的口腔癌裸鼠皮下成瘤模型驗證了c-myc可誘導GLS及GS表達,從而調控癌細胞的Gln代謝,加速瘤形成。