九肽-1/依克多因經皮共遞送納米脂質體美白修復功效研究

王 曦,陳 丹,羅 丹,陳 璇,馬佳月升,張亮韜,劉 衛2,Δ

[1.武漢百思凱瑞生物科技有限公司,湖北 武漢 430075;2.華中科技大學國家納米藥物工程技術研究中心,湖北 武漢 430075;3.華中科技大學生命科學與技術學院,湖北 武漢 430074;4.樣美生物科技(北京)有限公司,北京 100020]

九肽-1是一種含有9個氨基酸的小分子肽,通過競爭性方式與黑色素皮質素受體1相結合,阻礙酪氨酸酶活化,進而抑制黑色素的生成[1]。依克多因能阻止應激因子損傷細胞,隔離紫外線輻射、變應原、污染物等對皮膚的損害,1.0%依克多因能有效防止皮膚細胞損傷,皮膚自愈修復速度提升了2～3倍[2-3]。利用納米脂質體包載技術,可以改善皮膚功效活性成分的穩定性,促進活性成分進入靶細胞,有效提高活性成分的生物利用率[4-5]。本研究探討了九肽-1/依克多因經皮共遞送納米脂質體(Non/Ect-NLPs)的皮膚美白和修復作用,以期為研制具有美白修復功效的護膚品提供理論和技術基礎。

1 資料與方法

1.1主要試劑與細胞 九肽-1購自南京萊昂生物科技公司;依克多因購自濟南華熙生物科技公司;卵磷脂購自上海太偉藥業公司;聚乙二醇-40(PEG-40)氫化蓖麻油購自德國巴斯夫公司;1,3-丙二醇、1,2-己二醇、甘油購自國藥集團公司。DMEM高糖培養基、胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA購自美國Gbico公司;L-多巴、酪氨酸、TritonX-100、3% H2O2、α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)購自美國Sigma-Aldrich公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)、活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司;人源水通道蛋白-3(AQP3)、絲聚合蛋白(FLG)、緊密連接蛋白1(Claudin-1)的酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自江蘇酶免生物科技公司。人角質形成細胞(HaCaT)、小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)購自中國科學院昆明細胞庫。

1.3方法

1.3.1Non/Ect-NLPs的制備及粒徑等測定 稱取處方量卵磷脂、膽固醇、PEG-40氫化蓖麻油和1,3-丙二醇為A相,另稱取處方量九肽-1、依克多因、1,2-己二醇和甘油等溶于適量超純水中為B相,于40 ℃水浴混勻,將A相和B相混合,繼續攪拌,高壓均質機均質溶液3次后,得到Non/Ect-NLPs。取適量Non/Ect-NLPs,稀釋適當倍數,測定粒徑、多分散性指數(PDI)和Zeta電位。

1.3.2觀察細胞攝取行為 采用異硫氰酸熒光黃(FITC)代替活性成分制備FITC標記的納米脂質體(FITC-NLPs),與游離FITC中熒光標記水平相同。將B16F10細胞以3×105/mL的密度接種于共聚焦皿,每皿2 mL,培養24 h,棄上清液,加入含游離FITC、FITC-NLPs(FITC均為1 μg/mL)的培養基,置于細胞培養箱攝取4 h,棄去培養基,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,采用組織固定液固定細胞,在避光環境下,依次用羅丹明B(RhoB)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(均為1 μg/mL)染色各15 min,采用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.3.3細胞安全性評價 將1.5×105/mL的HaCaT細胞加入96孔板,每孔100 μL,培養24 h,每孔分別加入100 μL含有62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/mL Non/Ect-NLPs(Non/Ect-NLPs組)及游離成分溶液(游離成分溶液組,與Non/Ect-NLPs組中活性成分水平相同)的DMEM完全培養基,對照組僅加100 μL DMEM完全培養基。每組3個平行孔,重復3次。繼續培養24 h,于450 nm波長處測吸光度,計算細胞存活率。

1.3.4酪氨酸酶活性測定 將5.0×104/mL的B16F10細胞加入24孔板,每孔500 μL,培養24 h。對照組僅加入完全培養基,模型組、游離成分溶液組及Non/Ect-NLPs組加入100 nmol/L α-MSH制備黑素高表達細胞模型。Non/Ect-NLPs組同時加入125.0、250.0、500.0 μg/mL Non/Ect-NLPs,游離成分溶液組與Non/Ect-NLPs組中活性成分水平相同,均用DMEM完全培養基配制。每組3個平行孔,重復3次。培養48 h后,棄去上清液,每孔加入1% TritonX-100的PBS 200 μL于-80 ℃冰箱裂解,取細胞裂解液離心,取各孔上清液100 μL,加入0.1% L-多巴100 μL,37 ℃放置1 h,于490 nm波長處測吸光度,計算酪氨酸酶活性[6]。

1.3.5黑色素水平測定 將5.0×104/mL的B16F10細胞加入6孔板,每孔2 mL,培養24 h。各分組及加樣方式同“1.2.4”。每組設3個平行孔,重復3次。培養48 h后,PBS清洗細胞后,每孔加入含有10%二甲基亞砜的1.0 mmol/L氫氧化鈉溶液300 μL,在90 ℃水浴裂解細胞3 h,于405 nm波長處測各孔吸光度,計算黑色素水平[6]。

1.3.6細胞抗氧化分析 將1.5×105/mL的HaCaT細胞加入96孔板,每孔100 μL,培養24 h。各分組及加樣方式同“1.2.4”,僅在造細胞氧化損傷模型時,將100 nmol/L α-MSH替換為0.8 mmol/L H2O2。每組3個平行孔,重復3次。繼續培養24 h后,于450 nm波長處測吸光度,計算細胞存活率。

1.3.7細胞遷移分析 將5.0×105/mL的HaCaT細胞加入6孔板,每孔2 mL,培養24 h。用黃色槍頭在細胞生長的中央區域劃1條線,PBS清洗細胞3次,顯微鏡拍照觀察加樣前的劃痕寬度。拍照后,對照組加入無血清培養基,其他組分別加入250.0 μg/mL Non/Ect-NLPs與游離成分溶液的無血清培養基。培養24 h后,用顯微鏡拍照觀察加樣后的劃痕寬度,計算細胞遷移率,實驗重復3次[7]。

對電力行業而言，電力生產涉及的運行工況、參數、設備運行狀態等實時生產數據，現場總線系統所采集的設備檢測數據以及發電量、電壓穩定性等方面的數據，電力企業運營和管理數據，共同構成了“電力大數據”。[1]目前，大數據分析技術在變電站生產運維和安全管控中的應用較少。而大數據技術應用到電力生產運維工作中將發揮巨大的作用和產生良好的經濟價值。[2]本文將大數據技術與最優運維策略、設備狀態趨勢預判、現場作業安全管控、順控操作時遠方視頻驗證等方面進行結合，來闡述對變電站運維模式的改進和提高運維效率的作用。

1.3.8皮膚修復相關因子檢測 將1.0×105/mL的HaCaT細胞加入24孔板,每孔500 μL,培養24 h。對照組僅加DMEM完全培養基,其他組分別加入含有125.0、250.0、500.0 μg/mL Non/Ect-NLPs與游離成分溶液的DMEM完全培養基。每組3個復孔,實驗重復3次。繼續培養48 h,檢測上清液中AQP3、FLG、Claudin-1水平。

2 結 果

2.1粒徑、PDI和Zeta電位 Non/Ect-NLPs為淡黃色透明液體,測得其粒徑為(34.3±0.1)nm,PDI為(0.195±0.007),Zeta電位為(-31.7±0.9)mV。

2.2黑素細胞攝取情況 孵育相同時間,FITC-NLPs細胞質中熒光強度明顯強于游離FITC,而游離FITC主要聚集于B16F10細胞表面。FITC-NLPs能夠被快速攝取進入B16F10細胞。見圖1。

注：Merge是將DAPI、RhoB、FITC圖片進行組合。

2.3細胞安全性比較 不同水平Non/Ect-NLPs組和游離成分溶液組中HaCaT細胞活性均在80%以上,無細胞毒性。見圖2。

注：與對照組比較,aP<0.01;與同水平游離成分溶液組比較,bP<0.01;A～E組分別為62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/mL Non/Ect-NLPs組與相應游離成分溶液組。

2.4酪氨酸酶活性比較 與游離成分溶液組比較,Non/Ect-NLPs水平為250.0、500.0 μg/mL時,其對B16F10細胞酪氨酸酶活性顯著降低(P<0.05)。Non/Ect-NLPs抑制黑素細胞酪氨酸酶的能力強于同劑量游離成分。見圖3。

注：與模型組相比,aP<0.01;與同水平游離成分溶液組相比,bP<0.05,cP<0.01。

2.5黑色素水平比較 與游離成分溶液組比較,Non/Ect-NLPs水平為125.0、500.0 μg/mL時,其能顯著抑制B16F10細胞分泌黑色素(P<0.05)。Non/Ect-NLPs抑制黑素細胞黑色素分泌能力強于同劑量游離成分。見圖4。

注：與模型組相比,aP<0.01;與同水平游離成分溶液組相比,bP<0.05,cP<0.01。

2.6細胞抗氧化能力比較 采用0.8 mmol/L H2O2損傷HaCaT細胞后,其存活率為50.36%,細胞氧化損傷明顯。與模型組比較,Non/Ect-NLPs水平為250.0、500.0 μg/mL時,可顯著提高氧化損傷細胞的存活率(P<0.05)。與游離成分溶液組比較,Non/Ect-NLPs水平為500.0 μg/mL時,可顯著提高氧化損傷細胞的存活率(P<0.01)。Non/Ect-NLPs的細胞抗氧化功效更為顯著。見圖5。

注：與模型組相比,aP<0.01;與同水平游離成分溶液組相比,bP<0.01。

2.7細胞遷移能力比較 與對照組比較,游離成分溶液組和Non/Ect-NLPs組能顯著促進HaCaT細胞遷移(P<0.01)。與游離成分溶液組比較,Non/Ect-NLPs組能顯著促進HaCaT細胞遷移(P<0.01)。Non/Ect-NLPs促進HaCaT細胞遷移的能力優于游離成分溶液。見圖6、7。

圖6 對HaCaT細胞遷移的影響

注：與對照相比,aP<0.01;與游離成分溶液組相比,bP<0.01。

2.8皮膚修復相關因子水平比較 與對照組比較,游離成分溶液組、Non/Ect-NLPs組AQP3、FLG、Claudin-1水平顯著增高(P<0.05)。與游離成分溶液組比較,500 μg/mL Non/Ect-NLPs組AQP3、FLG水平顯著升高(P<0.05);250.0、500.0 μg/mL Non/Ect-NLPs組Claudin-1水平顯著升高(P<0.05)。Non/Ect-NLPs較相同水平游離成分溶液具有更好的皮膚保濕修復功效。見圖8。

注：與對照組相比,aP<0.05,bP<0.01;與同濃度游離成分溶液組相比,cP<0.05,dP<0.01。

3 討 論

目前,功效性化妝品產品大多存在功效成分單一、透皮吸收困難等問題。納米脂質體作為一種新型給藥遞送系統,制劑質量穩定,且所載活性成分經包裹后能有效提高成分穩定性。納米脂質體粒徑小,能增強藥物活性成分的經皮擴散速率及藥物的經皮吸收[8]。共輸送納米載體可同時負載多種美白作用機制的功效成分,實現多靶點多效護膚功效成分協同增效[6]。采用經皮給藥納米載體技術,將九肽-1和依克多因共包載于同一納米脂質體中,解決活性成分極性強、難透皮吸收、難緩釋等問題,可實現將美白修復活性成分的皮膚靶向共輸送,達到協同增效及緩釋作用[8-9]。在本團隊已完成的工作基礎上[7,10],本研究對Non/Ect-NLPs的皮膚美白和修復作用進行了探索。

本文構建的Non/Ect-NLPs平均粒徑為(34.3±0.1)nm,PDI為(0.195±0.007),Zeta電位為(-31.7±0.9)mV。Non/Ect-NLPs能促進B16F10細胞對活性成分的攝取,抑制B16F10細胞的酪氨酸酶活性和黑色素水平,緩解皮膚細胞氧化損傷,從而直接減少黑色素的產生[11-12]。Non/Ect-NLPs可促進角質形成細胞遷移,提高皮膚修復因子AQP3、FLG、Claudin-1的分泌量,提高皮膚保濕修復功能。

綜上所述,Non/Ect-NLPs具有美白皮膚和保濕修復作用,實現了不同機制活性成分的協同增效作用,在美白修復護膚品中有較好應用前景。