基于蒙脫石負載的阿糖胞苷復合物的制備

謝華松,劉澤朗,劉嘉姚,胡燕蕓,王傳嶺

(嘉應學院,廣東 梅州 514031)

阿糖胞苷(Cytosine arabinoside,Ara-c),為白色或類白色細小針狀結晶或結晶性粉末,在水中極易溶解,它屬于嘧啶核苷類抗腫瘤藥物,用于治療以急性淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤為主的各種類型的白血病[1]。目前阿糖胞苷在治療過程中存在嚴重缺陷:1)在體內容易在脫氨酶的作用下發生脫氨基反應,轉變為無活性的阿糖尿苷;2)分子水溶性大,膜透過性差;3)半衰期短,只有10～20 min;4)用于實體瘤的治療效果差;5)常出現手足綜合征(HFS)和口腔炎等副作用[2-3]。阿糖胞苷由于以上缺點導致其在臨床上應用受到限制,因此,探索開發載藥量高、安全有效的 Ara-C藥物遞送系統成為當前急需解決的問題。

天然蒙脫石(MMT)是由兩層硅氧四面體夾一層鋁(鎂)氧八面體構成的2∶1型層狀硅酸鹽黏土礦物,是組成膨潤土的主要礦物,其晶體結構中的兩個結構單元層以分子間力結合,結構比較松散,四面體中的Si4+可以被Al3+置換,八面體中的Si4+、Al3+易被Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+等置換,形成一系列復雜化學成分和層間負電荷,這些特征賦予它遇水膨脹、吸附、帶電和離子交換特性具有非常高的比表面積、較大的陽離子交換容量和可膨脹性[4]。在生物醫藥領域,蒙脫石可作為生物分子層間吸附劑[5]、藥物載體[6]和電化學生物傳感器[7]等。

近幾年來國內外大量學者研究發現蒙脫石是一種性能優良的緩控釋制劑載體,并已有多種藥物以蒙脫石作為新型緩控釋載體的研究報道,如:蒙脫石負載5 -氟尿嘧啶[8]、鹽酸異丙嗪[9]、紫杉醇[10]、布洛芬[11]等。由于蒙脫石具有良好的生物惰性、吸附性和離子交換容量,作為載體它還具備吸附量大、穩定性好、將藥物分子吸附交換至層間,延長藥物的半衰期,減少用藥劑量,起到“緩釋、控釋”的作用。本文擬設計制備阿糖胞苷-蒙脫石復合物,并測定蒙脫石對阿糖胞苷的載藥量,為后期開發具有緩釋作用的新型阿糖胞苷-蒙脫石復合物提供理論基礎。

1 實驗材料

儀器:電熱恒溫鼓風干燥箱(101-3型),上海錦屏儀器儀表有限公司;超聲波清洗機(JP-100S型),深圳市潔盟清洗設備有限公司;集熱式恒溫磁力攪拌器(DF-101S型),常州越新儀器制造有限公司;電子分析天平(AL204型),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;X-射線衍射儀(X’Pert PRO MPD型),荷蘭Panalytical公司;熱重分析儀(Q500型),美國TA公司;傅里葉紅外光譜儀(IS5/IS10型),美國Thermo Nicolet公司;高效液相色譜儀(LC-2030 plus型),島津馬來西亞工廠;離心機(GL-25M型),上海趙迪生物科技有限公司;超純水機(MING-CHE 24UV型),法國Merck Millipore公司;酸度計(PHSJ-4A型),上海精密科學儀器有限公司。

試劑:鈉基蒙脫石(上海源葉生物科技有限公司);阿糖胞苷(C9H13N3O5)(上海源葉生物科技有限公司);聚乙二醇(PEG1000)(上海源葉生物科技有限公司);高效色譜純甲醇(西隴科學股份有限公司);磷酸二氫鈉,二水(NaH2PO4·2H2O)(阿拉丁);氫氧化鈉(NaOH)(天津市福晨化學試劑廠);磷酸氫二鈉,十二水(Na2HPO4·12H2O)(阿拉丁);磷酸二氫鉀(KH2PO4)(天津市大茂化學試劑廠)。

2 實驗方法

2.1 鈉基蒙脫石有機化改性處理[12]

取市售鈉基蒙脫石(MMT) 5.0 g于40 mL蒸餾水中,在60 ℃恒溫超聲分散15 min,在恒溫磁力攪拌器中60 ℃分散2.0 h,隨后加入0.20 g PEG1000,繼續攪拌1.5 h,反應完成后加入乙醇沉淀并離心,烘干研磨即得改性蒙脫石,以下蒙脫石均采用已改性蒙脫石進行實驗。

2.2 阿糖胞苷-蒙脫石復合物的制備[13]

取阿糖胞苷0.200 0 g,加入pH值=7.6的PBS溶液50 mL,超聲分散15 min,加入0.500 0 g改性蒙脫石,于45 ℃恒溫反應3.0 h,取出,以10 000 r/min離心15 min,倒去上清液,將剩余下層沉淀烘干,待水分完全烘干后研磨成粉末狀,即得。

2.3 阿糖胞苷-蒙脫石復合物的結構表征

2.3.1 X射線衍射(XRD)表征

采用X射線粉末衍射分別對空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復合物測定,以8 °/min的速度在3°～70°范圍內進行掃描。

2.3.2 傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征

采用傅里葉紅外光譜檢測,分別對空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復合物測定,用粉體常規壓片,波長范圍400～4 000 cm-1。

2.3.3 熱重分析(TG-DTG)表征

采用熱重分析分別對空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復合物測定,測試溫度范圍為25～799 ℃,測試氣體氛圍為氮氣,升溫速率10 ℃/min。

2.4 蒙脫石對阿糖胞苷的吸附實驗

2.4.1 供試品溶液的制備

取0.200 0 g阿糖胞苷,加入pH值=7.6的PBS溶液50 mL,超聲分散15 min,加入0.500 0 g 改性蒙脫石,于45 ℃恒溫反應3.0 h,取出,以10 000 r/min離心15 min,吸取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾,取續濾液稀釋至適合濃度,即得。

2.4.2 對照品溶液的制備

取阿糖胞苷對照品適量,精密稱定,加超純水溶解并定量稀釋制成每l mL中含40 μg阿糖胞苷的溶液,作為對照品溶液。

2.4.3 色譜條件[1,14]

色譜柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠(4.6 mm×250 mm,4 μm)為填充劑;流動相:以磷酸鹽緩沖液[V(取0.010 6 mol/L磷酸二氫鈉溶液與0.010 4 mol/L磷酸氫二鈉溶液等體積混合)∶V(甲醇)=95∶5];柱溫:30 ℃;取適量阿糖胞苷標準品進行全波長掃描,確定檢測波長為271 nm;設置流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μL,洗脫時間:8 min。

2.4.4 阿糖胞苷標準曲線[1,14]

精密稱取阿糖胞苷約10 mg置于10 mL容量瓶中,分別用pH值7.6 PBS溶液溶解并定容,配成質量濃度為1 mg/mL的儲備液。精密量取儲備液50,100,200,400,600 μL置于10 mL容量瓶中,用PBS溶液稀釋并定容得質量濃度為5,10,20,40,60 μg/mL的標準溶液,各進樣10 μL,按照2.4.3項測定其峰面積,以峰面積(A)對濃度(C)作線性回歸,得阿糖胞苷標準曲線。

2.4.5 蒙脫石的載藥量[1,2]

按照2.4.1項平行制備三份供試品溶液,精密量取供試品溶液各10 μL ,注入HPLC中,記錄色譜圖,按標準曲線法計算阿糖胞苷游離量,然后以公式(1)計算蒙脫石對阿糖胞苷的載藥量。

載藥量(%)=載藥蒙脫石中阿糖胞苷含量/載藥蒙脫石的總質量×100%

(1)

3 結果與討論

3.1 阿糖胞苷-蒙脫石復合物的結構表征

3.1.1 X射線衍射(XRD)表征分析

按照2.4.1項對空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復合物進行XRD表征,見圖1,根據布拉格方程2dsinθ=nλ(n=1),可以計算出,其001晶面的層間距分別是1.560和1.718 nm,可見復合物中d001值比空白改性蒙脫石的大,說明可能由于阿糖胞苷的插入會占據原來空白改性蒙脫石晶體結構的一部分空間,使得材料的層間距(d值)增加,所以初步確定阿糖胞苷插入在蒙脫石層間;另一方面,插層后復合物的衍射峰角度比空白改性蒙脫石的要小,分析其原因可能是阿糖胞苷插入后占據了原來材料基本晶格結構中的空隙,引起晶格收縮,從而導致衍射峰角度出現左移變化。由以上兩方面綜合分析可判斷阿糖胞苷成功插入蒙脫石層間,這與郭文姬等人的文獻[15]描述相一致。

圖1 阿糖胞苷-蒙脫石和空白改性蒙脫石的XRD譜

3.1.2 傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征分析

按照2.4.1項對空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復合物進行FT-IR表征,結果見圖2。由圖2可知,空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復合物的FT-IR表征,發現空白改性蒙脫石在3 629和3 468,1 639 cm-1處的波峰分別是由Al-OH和吸附水中的羥基振動引起的。1 096和1 036 cm-1處的波帶是由Si-O平面振動引起的,大約在915 cm-1處的波數與Al-Al-OH有關,792 cm-1和大概630 cm-1處的波數是由Si-O-Si所引起的,而大約520和470 cm-1處的波數則是由Al-O-Si的振動引起。而在3 600 cm-1處的波峰變弱,分析其變弱的原因是阿糖胞苷和蒙脫石在反應過程中,蒙脫石中的游離型-OH基團大部分轉變成了締合型-OH基團,游離型-OH基團在紅外光譜中常表現為強的吸收峰,而締合型-OH基團在紅外光譜中表現為弱的吸收峰,導致締合型的吸收峰弱于游離型,所以-OH振動峰變弱,綜合以上結果表明蒙脫石與阿糖胞苷應該形成了復合物。

圖2 阿糖胞苷-蒙脫石和空白改性蒙脫石的FT-IR譜

3.1.3 熱重分析(TG-DTG)表征分析

按照2.4.1項對空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復合物進行TG-DTG表征,見圖3、圖4。由圖3中可知,空白改性蒙脫石從室溫到200 ℃范圍內,存在較大的失重損失,有4%左右,表明吸附水逸出;隨著溫度上升,在300～500 ℃處出現明顯失重,大約4%左右,可能是由于蒙脫石晶格內羥基破壞開始釋放水;在700 ℃之后出現第三個明顯失重,可能是蒙脫石結構已造成破壞。由圖4中可知,阿糖胞苷-蒙脫石復合物有兩個比較明顯的失重臺階。從室溫到200 ℃的范圍內存在6%左右的失重,對比空白改性蒙脫石,多出了2%左右的失重,表明是部分吸附水揮發和阿糖胞苷熱分解引起的;隨著溫度的繼續升高,在300～650 ℃的范圍內,失重損失為2%左右,對比改性蒙脫石,要比蒙脫石少2%左右,說明阿糖胞苷與蒙脫石進行插層時失去了蒙脫石層間部分水,導致其失重偏小;當溫度達到700 ℃后,失重曲線回升,可能是阿糖胞苷的分解產物與蒙脫石反應引起的,表明阿糖胞苷與蒙脫石形成了復合物。

圖3 空白改性蒙脫石的TG-DTG譜

圖4 阿糖胞苷-蒙脫石的TG-DTG譜

3.2 蒙脫石對阿糖胞苷的吸附實驗

3.2.1 阿糖胞苷的最大吸收波長測定

按照2.4.2項制備對照品溶液,然后取適量阿糖胞苷對照品進行全波長掃描,結果見圖5。由圖5可知,在271 nm處有最大吸收,由此確定檢測波長為 271 nm。

圖5 阿糖胞苷全波長掃描圖

3.2.2 阿糖胞苷在3種溶液下的標準曲線

按照2.4.4項建立阿糖胞苷在pH值7.6 PBS溶液的標準曲線,結果見表1;以峰面積(A)對濃度(C)作線性回歸方程,得阿糖胞苷在相應釋放介質下的標準曲線,據標準曲線計算出線性擬合方程(y= 29 292x+ 4 870.9),相關系數為0.999 9,結果顯示標準曲線線性關系良好。

表1 阿糖胞苷在pH值7.6 PBS溶液的標準曲線測定結果

3.2.3 蒙脫石的載藥量

蒙脫石對阿糖胞苷的吸附實驗結果見表2,由表2可知,蒙脫石載藥量約為1.42%,結果表明,蒙脫石對阿糖胞苷的載藥量不是很高,后續可深入探究優化阿糖胞苷-蒙脫石復合物的制備工藝條件。

表2 蒙脫石對阿糖胞苷的吸附實驗結果

4 結論

本文設計制備阿糖胞苷-蒙脫石復合物,通過結構表征分析確定制備得到阿糖胞苷-蒙脫石復合物,其載藥量約為1.42%,研究結果為制備新型阿糖胞苷-蒙脫石緩釋制劑提供參考依據,也為其在藥理學的研究提供理論支撐。