基于氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料的無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建及應(yīng)用

趙麗芳,于曉菲,滕龍,齊云,劉鵬飛,侯斌,張娟*

(1.山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院,山東 濟(jì)南 250100; 2.山東省環(huán)科院環(huán)境工程有限公司,山東 濟(jì)南 250109;3.濱州市檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山東 濱州 256600)

對(duì)腫瘤標(biāo)志物的高靈敏度、高準(zhǔn)確度的檢測(cè)是目前癌癥診斷的重要課題。該領(lǐng)域采用各種技術(shù)和檢測(cè)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè),包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、表面等離子體共振法、石英晶體微平衡法、各種發(fā)光和熒光技術(shù)等。然而,這些技術(shù)和方法通常需要復(fù)雜的樣品處理過(guò)程,耗時(shí)長(zhǎng),不能滿足日益增長(zhǎng)的快速檢測(cè)的需求。因此,亟需開(kāi)發(fā)一個(gè)簡(jiǎn)單、可靠的技術(shù)和方法。這一需求在超低濃度的生物標(biāo)志物檢測(cè)方面尤為明顯,如甲胎蛋白的檢測(cè)。

免疫傳感器以抗原或抗體作為敏感元件,能夠?qū)崿F(xiàn)傳感與換能的同步進(jìn)行,可以達(dá)到定量的監(jiān)測(cè),也能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)傳感器界面反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。免疫傳感器的結(jié)構(gòu)與其他生物傳感器相類似,主要是由接收器、轉(zhuǎn)換器和電子放大器三部分組成的[1]。免疫傳感器的敏感元件是抗原、抗體,將抗原或抗體固定在載體表面用以構(gòu)建敏感膜,即傳感器的敏感膜[2]。抗原與抗體在敏感膜上特異性結(jié)合產(chǎn)生信號(hào),這些信號(hào)被傳送到轉(zhuǎn)換器。通過(guò)轉(zhuǎn)換器的轉(zhuǎn)化將接收到的信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào),同時(shí)進(jìn)行信號(hào)的放大和數(shù)字化[3]。免疫傳感器是可以將輸出結(jié)果數(shù)字化的精密換能器,它在達(dá)到定量檢測(cè)的同時(shí),也能夠?qū)崿F(xiàn)傳感器表面抗原-抗體反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),這對(duì)免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析是非常有利的[4]。

電化學(xué)免疫傳感器則是指由抗原或抗體為敏感元件,電極作為轉(zhuǎn)換元件,以電勢(shì)或電流為特征檢測(cè)信號(hào)的傳感器[5]。目前大量的電化學(xué)免疫傳感已應(yīng)用在生物技術(shù)、食品工業(yè)、臨床檢測(cè)、醫(yī)藥工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析等領(lǐng)域[6-10]。

為了構(gòu)建免疫傳感器,酶通常被固定在電極表面,作為催化活性位點(diǎn)以產(chǎn)生信號(hào),在使用免疫傳感器時(shí),必須考慮到酶的實(shí)際穩(wěn)定性和復(fù)雜的預(yù)處理過(guò)程。而酶的穩(wěn)定性受環(huán)境影響較大,因此無(wú)酶型免疫傳感器越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

本文構(gòu)建了一種新的電化學(xué)免疫傳感器,能夠無(wú)酶檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)。利用金@鉑納米粒子和氨基化石墨烯的作用替代傳統(tǒng)的過(guò)氧化氫酶,進(jìn)行無(wú)酶檢測(cè)。本方案中,以氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子修飾電極表面,氨基化石墨烯具有良好的導(dǎo)電性和電催化活性,能夠促進(jìn)材料與電極間的電子轉(zhuǎn)移,改善電極的性能;金@鉑納米粒子對(duì)過(guò)氧化氫具有高催化性能,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)甲胎蛋白(AFP)的快速檢測(cè)。本研究的目的是證明利用這種新穎、簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì),可以開(kāi)發(fā)出無(wú)酶、快速、可靠的電化學(xué)免疫傳感器。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

氯金酸(HAuCl4)、氯鉑酸(H2PtCl6),均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司。石墨粉于飛世爾科學(xué)公司購(gòu)買。其他化學(xué)試劑均為分析純或更高質(zhì)量等級(jí),均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司。

所有電化學(xué)測(cè)量均在CHI760D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)上進(jìn)行。透射電鏡(TEM)由H-800透射掃描電鏡(日本)獲得。

1.2 氨基化石墨烯的合成

該方法采用Hummers法[11]制備氧化石墨烯(GO),然后用三聚氰胺對(duì)氧化石墨烯進(jìn)行還原處理[12]。

將0.6 g的石墨粉和3.6 g高錳酸鉀混合,放入帶有磁子的500 mL的三口瓶中,將360 mL∶40 mL(9∶1,體積比)濃硫酸和磷酸的混合液加入以上三口瓶中,冷卻至30～40 ℃,將三口瓶放入油浴,加熱到50 ℃,反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束,將樣品倒入到40 mL的冰上,將磁子放入冰水混合物上,加入300 μL的過(guò)氧化氫,磁力攪拌0.5 h。反應(yīng)結(jié)束后,得到的混合物在8 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心0.5 h,然后分別用30 mL 0.2 mol·L-1的鹽酸、乙醇分別離心洗滌三次,棄去上清液。最后用乙醚離心洗滌,干燥24 h,制得棕黃色固體粉末為氧化石墨烯。

稱取0.15 g氧化石墨烯,加水50 mL,超聲20 min得到均勻氧化石墨烯水溶液(3 mg/mL),將25 mg三聚氰胺加入至水溶液中,60 ℃油浴,攪拌反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應(yīng)釜中,200 ℃反應(yīng)5 h。將反應(yīng)釜冷卻至室溫,離心洗滌黑色反應(yīng)物三次。在氬氣氛圍中850 ℃煅燒3 h,制得氨基化石墨烯納米材料。

1.3 金@鉑納米粒子的制備

將1 mL 10 mg/mL PVA溶液與190 mL 0.25 mmol/L HAuCl4溶液混合,劇烈攪拌2 h后,滴加11 mL 0.1 mol/L新配制得檸檬酸三鈉溶液,攪拌反應(yīng)2 h,生成金膠體[13]。

將1.5 mL 20 mmol/L H2PtCl6逐滴加入到制得的金膠體溶液中,并攪拌。將10 mmol/L的抗壞血酸溶液在4 ℃條件下緩慢加入上述溶液中,混合物的顏色在幾分鐘內(nèi)會(huì)變成黑色。加入抗壞血酸溶液后,連續(xù)攪拌30 min。將得到的溶液離心并用水洗滌三次[14]。將制備的金@鉑納米粒子分散至10 mL超純水中,超聲30 min,備用。

1.4 氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料的制備

稱取3.6 mg制備的氨基化石墨烯,溶于5 mL超純水中超聲60 min后,加入2 mL金@鉑納米粒子溶液,振蕩3 h,使氨基化石墨烯表面固載金@鉑納米粒子,將得到的溶液離心并用水洗滌三次。最后將氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料分散至2 mL超純水中,超聲30 min,備用。

1.5 電化學(xué)免疫傳感器的制備

用Al2O3粉末拋光直徑為4 mm玻碳電極,用超純水沖洗干凈電極表面。將6 μL氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料溶液滴涂在電極表面,在4 ℃條件下晾干。然后依次在電極上滴加甲胎蛋白抗體(Ab1)溶液、牛血清白蛋白(BSA)溶液、甲胎蛋白抗原(Ag)溶液,孵化4 h,并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈,即制得一種用于甲胎蛋白檢測(cè)的無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器。

1.6 腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白的測(cè)定

使用的電化學(xué)工作站為三電極體系,即參比電極、對(duì)電極和工作電極。在電解池中加入10 mL的磷酸鹽緩沖溶液(含H2O25 mmol/L),采循環(huán)伏安法或差分脈沖法測(cè)定。

設(shè)定電位范圍為-0.2～0.6 V,采用差分脈沖法測(cè)定工作電極對(duì)不同濃度的甲胎蛋白的電流響應(yīng);根據(jù)所得電流響應(yīng)與甲胎蛋白溶液濃度的關(guān)系,繪制工作曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

圖1氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料的透射電鏡圖像,顯示制備的氨基化石墨烯片為單層薄片狀,表面有大量的褶皺,使其比表面積增大;金@鉑納米粒子直徑約為10 nm,尺寸均勻,且均勻地分散在氨基化石墨烯表面。

圖1 氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料的透射電鏡圖

2.2 電化學(xué)免疫傳感器條件的優(yōu)化

在該無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建和工作過(guò)程中,為了測(cè)試構(gòu)建的無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器的性能,對(duì)傳感器的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)于催化過(guò)程,緩沖溶液的pH值和基底材料氨基化石墨烯的濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果都有很大的影響,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。圖2(A)中曲線表示的是在不同pH值條件下,構(gòu)建的無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器對(duì)同一濃度的甲胎蛋白測(cè)定的結(jié)果,顯示7.0為最優(yōu)pH值條件;圖2(B)為使用不同濃度氨基化石墨烯構(gòu)建的無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器對(duì)同一濃度的甲胎蛋白測(cè)定的結(jié)果,氨基化石墨烯溶液質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL時(shí),反應(yīng)最為靈敏。當(dāng)氨基化石墨烯濃度過(guò)低時(shí),電子傳輸能力不夠,同時(shí)金@鉑納米粒子負(fù)載量少,導(dǎo)致催化性能低,電信號(hào)放大效應(yīng)不明顯;氨基化石墨烯濃度過(guò)高時(shí),在電極表面構(gòu)成的導(dǎo)電膜過(guò)厚,阻礙電子傳遞,導(dǎo)致信號(hào)降低。

圖2 (A)緩沖溶液pH值和(B)氨基化石墨烯溶液濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.3 電化學(xué)免疫傳感器的電化學(xué)表征

為了驗(yàn)證電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建過(guò)程,使用循環(huán)伏安曲線對(duì)構(gòu)建傳感器過(guò)程中電極的界面結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行表征,進(jìn)一步說(shuō)明修飾過(guò)程。圖3為把不同材料滴加在玻碳電極上進(jìn)行免疫傳感器構(gòu)建,測(cè)定各修飾過(guò)程的循環(huán)伏安曲線圖,所用電解液為pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液(含H2O25 mmol/L)的溶液。

(a)氨基化石墨烯;(b)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料;(c)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料+Ab1;(d)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料+Ab1+BSA;(e)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料+Ab1+BSA+Ag。

從圖中各曲線可以看出,隨著電極表面的層層修飾,H2O2的氧化還原電流值相應(yīng)發(fā)生變化。圖中a曲線表示的是裸玻碳電極的循環(huán)伏安曲線。圖中b曲線為修飾上一層氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復(fù)合材料的循環(huán)伏安曲線,由于氨基化石墨烯具有良好的電子傳遞能力,金@鉑納米粒子對(duì)H2O2具有較強(qiáng)的催化性能,因此氧化還原峰值電流增大。圖中c曲線為修飾上一層Ab1以后的循環(huán)伏安曲線,氧化還原峰值電流較b曲線減小,原因是抗體不具有電化學(xué)活性,在一定程度上阻礙了電子的傳遞。接著,在已經(jīng)修飾的電極表面加入BSA,封閉電極上的非特異性結(jié)合位點(diǎn),圖中d曲線氧化還原峰值電流值明顯減小。當(dāng)將甲胎蛋白抗原(AFP)固定到電極表面后的氧化還原峰值電流值(e曲線)進(jìn)一步減小,這說(shuō)明蛋白類阻礙電子的傳遞,也進(jìn)一步驗(yàn)證了該傳感器構(gòu)建成功。

2.4 甲胎蛋白的電化學(xué)免疫分

在最佳條件下,隨著甲胎蛋白(AFP)濃度的增加,催化電流值減小,由電流值對(duì)AFP的濃度作圖,發(fā)現(xiàn)AFP質(zhì)量濃度在0.000 1～10 pg·mL-1范圍內(nèi)都能呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(圖4),檢出限為0.000 03 pg·mL-1(S/N=3),相關(guān)數(shù)據(jù)列于表1。

表1 工作曲線數(shù)據(jù)

圖4 (A)不同濃度甲胎蛋白的檢測(cè)曲線圖和(B)電化學(xué)免疫傳感器的工作標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 甲胎蛋白電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性

利用無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器對(duì)質(zhì)量濃度0.001 pg·mL的AFP進(jìn)行測(cè)試,平行做5個(gè)相同濃度的同時(shí)檢測(cè),研究了構(gòu)建的無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性(圖5)。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算,通過(guò)計(jì)算得到5次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%,在5%以內(nèi),說(shuō)明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

圖5 無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性研究

3 結(jié)論

以氨基化石墨烯作為電極基底材料,金@鉑納米粒子替代傳統(tǒng)的過(guò)氧化氫酶為催化因子,利用抗原-抗體的特異性免疫反應(yīng)構(gòu)建了無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器,并對(duì)其性能進(jìn)行了詳細(xì)研究。選用常見(jiàn)腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白的模型,驗(yàn)證了構(gòu)建的無(wú)酶型電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用性能。該傳感器具有對(duì)甲胎蛋白響應(yīng)迅速、檢測(cè)限較低、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),為設(shè)計(jì)其他腫瘤標(biāo)志物的無(wú)酶檢測(cè)提供了一種思路。