輻照植物性中藥材熱釋光鑒定方法研究

馬雙,李樂,王芳,郗存顯

(1.重慶化工職業學院,重慶 400112;2.重慶海關技術中心,重慶 400020)

1 概述

通過電離輻射(一般指60Coγ射線、加速器產生的電子束或X射線)對食物、中藥材等進行輻照處理,通過電離輻射可消滅產品中的細菌和寄生蟲,起到保鮮防腐、殺菌、殺蟲、延緩成熟、抑制發芽和提高衛生質量的目的。輻照滅菌的原理類似于利用太陽光殺菌,是一種高效、安全的殺菌技術[1-3]。目前,世界上沒有發生因食用輻射食物引起的人類健康問題的情況報道。用輻照技術滅菌的中藥材主要是在保存過程中易產生霉變的中藥,由于輻照具有很好的滅菌效果,而且滅菌時間短,因此反復輻照、超劑量輻照的現象時常發生。按照GMP標準,藥材在生產過程需要嚴格進行質量控制,再用合適的滅菌方法進行處理。但是,由于中藥的品種很多,藥材生產過程難以實現規模化操作,有些生產單位為了節約成本,放松了對生產過程的質量控制,導致產品微生物超標嚴重,這時候他們往往會采取大劑量輻照來殺滅微生物,致使輻照劑量遠遠大于安全劑量,有的甚至會使部分中藥材中的有效或功效成分含量降低,較少或失去部分藥用價值,給消費者的切身利益造成了嚴重的影響,甚至會危害到消費者的健康。

《鈷60輻照中藥滅菌劑量標準》(內部試行)的通知(衛藥發〔1997〕38號),明確規定鈷60輻照僅僅作為中藥滅菌的輔助手段,通知還對不同中藥材生產過程中輻照劑量作了進一步明確規定,防止輻照滅菌濫用。198種中藥材、70種中成藥允許進行輻照滅菌, 5種中藥材品種允許使用低劑量(3 kGy)輻照滅菌, 2種中藥材品種不允許輻照滅菌。《標準》中還明確規定,未列明在《通知》中的中藥品種是原則上不允許使用輻照進行滅菌。

目前我國現行標準中熱釋光法鑒定輻照產品的方法現有農業部的兩個行業標準,分別是NY/T 1390—2007《輻照新鮮水果、蔬菜熱釋光鑒定方法》和NY/T 1207—2006《輻照香辛料及脫水蔬菜熱釋光鑒定方法》,缺少對中藥材是否經過輻照的鑒定方法。為了滿足中藥材質量檢驗監管需要,建立適用中藥材輻照的鑒定方法非常有必要和緊迫。

2 輻照鑒定技術研究進展

目前輻照鑒定的方法主要化學法、物理法、發光法和電子自旋法等,但由于檢測原理不同,具有各自的特點和局限性。

2.1 化學法

1)2-烷基-環丁酮法:經過不同劑量伽馬射線輻照的脂質樣品會生成不同量的2-烷基-環丁酮,該物質可以作為輻照的指標。這種方法適用于脂肪含量較高的脂肪、黃油、油和堅果等樣品[4-5]。

2)鄰酪氨酸法:經過輻照的樣品蛋白質的側鏈會發生變化,產物之一就是與鄰酪氨酸類似的結構。通過測定樣品中鄰酪氨酸類似結構的含量的變化情況,可以判斷樣品是否經過輻照。該方法適用于含有豐富蛋白質的肉類、魚類、豆類等樣品。

3)DNA法:經過輻照的樣品中,DNA的堿基會受到損傷而導致鏈斷裂。通過測定樣品中DNA鏈斷裂的量,可以判斷樣品是否經過輻照。該方法適用于含有豐富DNA的肉類、魚類、蔬菜等樣品[6]。

4)過氧化物法:經過輻照的樣品會產生過氧化物。通過測定樣品中過氧化物的含量的變化情況,可以判斷樣品是否經過輻照。該方法適用于含有豐富脂肪和油脂的堅果、植物種子等樣品。

2.2 物理法

1)黏度法:食品經過輻照后一些高分子物質會發生降解,從而導致黏度降低。通過測定食品的黏度變化情況,可以判斷食品是否經過輻照。該方法適用于含有豐富高分子物質的淀粉、果醬、果汁等樣品。

2)電阻抗法:這是一種基于物理性質的檢測方法。樣品經過輻照會失去部分水分從而導致電阻抗發生變化。通過測定樣品的電阻抗,可以判斷樣品是否經過輻照。該方法適用于含有豐富水分的肉類、魚類、蔬菜等樣品。

2.3 發光法

1)熱釋光法:含有硅酸鹽物質的樣品經過電離輻照,硅酸鹽物質中的晶格缺陷會俘獲自由電子并儲存能量。加熱后,會從晶格缺陷中逸出,釋放出能量并發出熱釋光。通過對比熱釋光的比值大小,可以判斷食品是否經過輻照[7]。

2)化學發光法:樣品經過輻照后會產生某些化學反應,并生成激發態的產物。當這些產物回到基態時,會釋放出光子。通過測量釋放出的光子數量,可以判斷食品是否經過輻照。

2.4 電子自旋共振法(ESR法)

樣品經過輻照后,硬組織中的自由基會形成長壽命的自由基,這些自由基可以通過ESR技術進行檢測。通過檢測自由基的數量,可以判斷食品是否經過輻照。該方法適用于含有豐富硬組織的骨頭、硬果殼等樣品[8]。

目前,熱釋光(TLD)法可應用于所有能分離出硅酸鹽礦物質的樣品,應用范圍最為廣泛,目前筆者未見國內(外)文獻報道輻照中藥材的熱釋光鑒定方法。

3 材料與方法

3.1 材料與試劑

多鎢酸鈉溶液(2 g/mL):將250 g多鎢酸鈉溶于150 mL水中(美國GEO LIQUIDS,INC.);鹽酸:1 mol/L;氨水:1+11(體積比);丙酮,分析純;尼龍布。

3.2 儀器與設備

熱釋光分析儀(HARSHAW 3500 TLD,美國Thermofisher Scientific公司) ;超聲波清洗器(AS20500BDT,天津奧特賽恩斯儀器有限公司);離心機(sigma 3-30K,德國sigma公司);不銹鋼樣品盤,直徑1 cm,高0.4 cm(使用前在水中超聲清洗,再使用丙酮中超聲清洗兩到三次,烘干后儲藏在無塵的環境);旋渦振蕩器(XH-B,江蘇姜堰市康健醫療用品有限公司);烘箱(FD115,德國Binder公司)。

3.3 測定步驟

3.3.1 提取硅酸鹽

稱取20～50 g樣品到燒杯中,加入100～200 mL水,超聲提取5 min。用250 μm的尼龍濾布過濾至燒杯中,用水沖洗濾布,棄去殘渣。靜置5 min,傾去最上層,剩余部分轉移到150 mL離心管中,3 000 r/min離心1 min。傾去水層,再加入水清洗,離心,至水溶液澄清,最后用少量的水將沉淀物轉移到10 mL的離心管中,加水至10 mL,渦旋振蕩后,3 000 r/min離心2 min,棄去水層,加入5 mL多鎢酸鈉溶液,超聲5 min,將最上層的有機物和中間的多鎢酸鈉溶液去除。如果仍有有機物殘留,重復上述過程。在離心管中加水3 000 r/min離心2 min,傾去水層,重復一次。

加入1 mol/L鹽酸1～2 mL清洗沉淀,振搖均勻后靜置10 min。加入與鹽酸等量的氨水溶液中和至中性,加水至滿后靜置。傾去上層后水清洗殘留的礦物質兩次。再加入3 mL丙酮,振搖使其充分混合。如果丙酮混濁,再用丙酮進行清洗直至澄清。

將清洗干凈的礦物質轉移至不銹鋼盤上,置于50 ℃左右的烘箱中烘干過夜。

3.3.2 熱釋光的測量

3.3.2.1 儀器升溫條件

起始溫度:70 ℃;升溫速率:6 ℃/s;最終溫度:400 ℃。

3.3.2.2 熱釋光曲線1的測量

將附有硅酸鹽礦物質的不銹鋼盤放入熱釋光儀中,按上述條件進行測量。可得到熱釋光曲線,通過計算得到熱釋光曲線面積積分值,用G1表示。

3.3.2.3 熱釋光曲線2的測量

將上述測量過的附有硅酸鹽礦物質的鋼盤用1 kGy劑量的γ輻射源輻照,置于50 ℃烘箱中過夜,于熱釋光儀按上述條件再次進行測量。可得熱釋光曲線,通過計算得到熱釋光曲線面積積分值,用G2表示。

4 結果與分析

4.1 樣品的熱釋光檢測分析

參照國內外中草藥輻照的實際使用劑量,根據檢測儀器的準確度,設定凡是輻照劑量在0.10 kGy以上(包括0.10 kGy)的中草藥,判定為輻照過的中草藥;如果接受輻照劑量小于0.10 kGy,則判定該樣品未經輻照。所以,當樣品中提取的礦物質接受輻照劑量1 kGy后,如果其發光曲線的峰面積積分值之比G1/G2<0.10,則判定中草藥未經輻照,而且比值越小,接受劑量的可能性就越小;G1/G2如果≥0.1,則判定為經輻照樣品,輻照劑量越大則比值越大。國內外大量的實驗結果表明該方法判別正確率在95%以上。本實驗室已對上百個樣品進行檢測判斷,準確率為100%。

4.2 試驗條件的優化

4.2.1 樣品的制備

該檢測方法需要提取附著于樣品表面的泥土和灰塵,因此基本無需對樣品進行粉碎或切割,除非樣品整體體積過大,難以放入合適的容器中時,可進行簡單的切割,但不能粉碎。如根類樣品夾帶的礦物質會多,取樣量20 g就能夠滿足鑒定要求。如果是莖或花,取樣量就要增加到50 g或者更多。

4.2.2 硅酸鹽的提取、凈化

首先水洗超聲的將植物性中藥材表面附著的礦物質洗下,通過的濾網或濾布將清洗好的藥材去除,濾網或濾布的孔徑控制在250 μm以上,否則容易將礦物質過濾掉。通過反復的水清洗、離心,去除大部分有機物,但有很少的有機物無法去除,需要采用多鎢酸鈉溶液溶解混勻后離心,離心后樣品分為三層,其中有機物密度最輕,在溶液最上層,需要全部去除干凈;中間為多鎢酸鈉層;最下層為硅酸鹽礦物質,當有機物不能一次去除完全時,可以再次加入多鎢酸鈉溶液進行離心分離。此時的礦物質經過水洗后還可能含有一部分碳酸鹽與礦物黏附牢固的有機物,通過加入鹽酸溶液反應可去除,再使用丙酮進一步去除殘留的有機物。

4.2.3 熱釋光測定

首次測得硅酸鹽的發光曲線,得到發光曲線G1。然后用已知劑量的輻射源(1 kGy)再次照射得到的硅酸鹽,再次讀出發光曲線,得到發光曲線G2,通過這兩條曲線面積的積分比值來判斷樣品是否經過輻照。對于f=G1/G2的判斷閾值,依據EN 1788—2001和其他標準普遍認可的f≥0.1作為樣品經過輻照的判斷閾值,如果f<0.1,則認為樣品未經輻照。

5 樣品的鑒定

根據植物性中草藥的根、葉、花、果實藥用部分選取人參、甘草、蘇葉、菊花和山楂樣品各分成3份,1份直接按照本文建立的方法進行6個平行的處理分析,另兩份送上海輻照中心接受60Coγ輻照源1.0 kGy劑量和2.0 kGy劑量的輻射后再進行6個平行的處理分析,結果見表1,人參樣品的熱釋光譜圖見圖1。

由于輻照技術在實際應用過程中,對于消毒殺菌的輻射劑量為1～10 kGy,完全殺菌的輻照劑量更大,為25～50 kGy,因此本方法的驗證最低劑量為1.0 kGy。

表1 實驗室內驗證數據結果

圖1 人參樣品的熱釋光譜圖

6 結論

建立了輻照根、葉、花、果實類中藥材的熱釋光鑒定方法,方法靈敏度高、樣品制備簡單、檢測時間短、準確率高,且不需用參照物。可用于輻照中藥材的定性鑒別和藥材市場的有效監控。