TXNDC12在結直腸癌生長轉移中的作用

黑 鈺,徐向榮,田淑月,陳璇羽,張 靜,王逢會*

(1延安大學醫學院醫學研究實驗中心,延安 716000;2延安市真菌資源開發與生物防治重點實驗室;*通訊作者,E-mail：wangfenghui2022@163.com)

全球癌癥的最新統計結果顯示,每年約有185萬新發結直腸癌(colorectal cancer,CRC)患者,死亡率高達46%。高發病率和病死率使CRC成為世界第三常見和第四致命的癌癥類型[1,2]。盡管CRC在臨床診斷和綜合治療方面取得較大進展,部分患者的生存期延長,但轉移的CRC患者預后仍然很差[3]。因此迫切需要尋找CRC新的分子作用機制,以開發針對CRC的潛在治療策略。

硫氧還原蛋白結構域蛋白12(thioredoxin domain-containing protein 12,TXNDC12)是一種含有硫氧還蛋白結構域的蛋白質,也被稱為ERp16、ERp18、ERp19或hTLP19,是蛋白質二硫化物異構酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族的成員,也是硫氧還原蛋白(thioredoxin,Trx)超家族的一員。該蛋白在所有組織中廣泛表達,在肝臟和胎盤中的表達最為豐富[4]。TXNDC12通過編碼一種參與催化二硫鍵形成的蛋白質,以減少細胞內各種二硫化物來維持巰基穩態并防止氧化應激[5],TXNDC12還可與激活轉錄因子6α(activating transcription factor 6α,ATF6α)形成混合二硫化物,調節未折疊蛋白反應期間ATF6α的激活,參與內質網應激[6,7]。此外,多項研究證實TXNDC12在癌癥的發生和發展中也起著重要作用[8,9],例如TXNDC12可通過FAK/ERK信號通路加速腫瘤細胞生長、遷移和侵襲促進人類胃癌的致瘤性[10];TXNDC12 58～115活性位點可以與β-catenin結合從而促進肝癌的轉移[11];在膠質瘤的研究中發現TXNDC12顯著高表達,且這種高表達與膠質瘤局部免疫微環境有關,提示該蛋白與膠質瘤患者的預后不良也相關[12]。雖然高表達的TXNDC12可在腫瘤中發揮重要作用,但有研究揭示低mRNA水平的TXNDC12也可在肺腺癌患者的不良預后中發揮提示作用[13],這與先前的研究相悖,可能與腫瘤異質性相關,同時也更加表明了TXNDC12在腫瘤發展的過程中的重要性。就目前研究而言,TXNDC12對結直腸癌的調控機制還未被觸及,因此本研究擬通過生物信息學分析、細胞實驗等探究TXNDC12在CRC中的表達,并觀察其對CRC細胞增殖、遷移和凋亡等生物學功能的影響,為CRC的臨床治療和預后等發現有效靶點或有利因素提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本與細胞 選取2021年12月至2022年5月在延安大學附屬醫院接受治療的8例結直腸癌患者組織和癌旁組織用于TXNDC12的表達測定,其癌組織標本均經臨床病理診斷為結直腸癌。本研究經延安大學醫學院倫理委員會批準(批準號：2022060),并征得所有患者同意且簽署知情同意書。

人結腸癌細胞系HT-29、HCT116、RKO及人腸黏膜上皮細胞NCM460均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS,04-001-1ACS)、DMEM高糖培養基(C3113-0500)、RPMI-1640(01-100-1ACS)、McCoy′s 5A(C3020-0500)和青霉素-鏈霉素溶液(10 mg/mL)購自以色列Biological Industries生物科技公司。Hochest 33258(RS6007)熒光染料購自西安睿思科生物技術有限公司;TXNDC12抗體(ab137035)購自美國Abcam plc公司;MMP-2(10373-2-AP)、MMP-9(10375-2-AP)、β-catenin(17565-1-AP)、N-cadherin(20874-1-AP)、Bax(50599-2-Ig)、Bcl-2(68103-1-Ig)、Caspase-3(19677-1-AP)抗體均購自武漢三鷹技術公司;β-actin(HC201-01)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(HS101-01)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠抗體(HS201-01)、RT-qPCR定量試劑盒(AQ601)購自北京全式金生物技術有限公司;反轉錄試劑盒(AE311)購自大連寶生物工程有限公司;轉染試劑購于北京百靈克生物科技有限公司;CCK-8試劑購于上海陶術生物科技有限公司;siRNA序列設計及合成由上海吉瑪制藥技術有限公司完成;RT-qPCR相關引物均由西安奧科鼎盛生物科技公司合成。

1.2 方法

1.2.1 數據庫分析TXNDC12在結直腸癌組織及淋巴結轉移的結直腸癌患者中的表達情況 利用不同生物數據庫分析TXNDC12的表達情況,具體操作如下：①TCGA(https：//portal.gdc.cancer.gov/)和GTEx(https：//www.gtexportal.org)數據庫篩選結直腸癌腫瘤組織的相關數據資料,并通過GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)[14]在線分析比較TXNDC12在275例結直腸癌組織樣本和349例正常結直腸組織樣本中的表達差異,最后利用統計學方法對TXNDC12在結腸癌中的差異表達結果進行描述;②利用UALCAN(https：//ualcan.path.uab.edu/)數據庫中TCGA結腸腺癌數據集分析TXNDC12在淋巴結轉移的結直腸癌患者中的表達情況。

1.2.2 Sanger Box數據庫分析TXNDC12與結直腸癌患者免疫浸潤的關系 利用Sanger Box(http：//sangerbox.com/home.html)數據庫中的免疫浸潤分析模塊分析TXNDC12表達水平與結直腸癌免疫評分、基質評分、免疫基質聯合評分的相關性;通過免疫細胞分析(EPIC)模塊預測TXNDC12與幾種常見的免疫細胞(CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞)浸潤豐度的關系。

1.2.3 引物和siRNA的設計與合成 從NCBI數據庫查找TXNDC12(Gene ID：51060)的mRNA序列。設計合成其特異性檢測引物(序列見表1),以GAPDH作為內參基因。結合目的基因CDS區域進行小干擾RNA設計并合成2條TXNDC12 siRNA用于后續實驗,siRNA及對照(si-NC)序列見表2。

表1 TXNDC12和GAPDH引物序列

表2 TXNDC12 siRNA序列

1.2.4 細胞培養 將液氮儲存的HT-29、RKO、HCT116和NCM460細胞復蘇后使用10%胎牛血清(FBS)和1%(10 mg/mL)青鏈霉素配置的McCoy′s 5A、DMEM和RPMI-1640培養基,置于含5% CO2的37 ℃培養箱培養,待細胞長至密度達80%以上用胰酶消化傳代。細胞處于對數生長期時接種至6孔板,5% CO237 ℃培養箱中培養24 h后收集細胞提取RNA,48 h后提取蛋白,開展TXNDC12 mRNA及蛋白水平檢測。

1.2.5 敲低TXNDC12細胞模型的構建 取生長狀態良好的HT-29和RKO細胞接種于6孔板,密度達70%～80%時進行轉染,空白對照組(MOCK組)不做任何處理,對照組(NC組)轉染si-NC 150 pmol,敲低組(si-TXNDC12-2組)轉染si-TXNDC12-2 150 pmol,轉染6 h后進行換液,繼續培養相應時間進入后續實驗。

1.2.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測TXNDC12在結直腸癌細胞中的mRNA表達水平 采用Trizo1法提取各處理組細胞的總RNA,并以總RNA為模板,在37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 10 min條件下反轉錄合成cDNA;然后以cDNA為模板,利用目的基因TXNDC12 mRNA特異性引物以及GAPDH的特異性引物進行RT-qPCR檢測實驗組與對照組目的基因TXNDC12 mRNA的表達水平：RT-qPCR 20 μL的反應體系為cDNA 4 μL,2×TransStart top Green qPCR Supermix 10 μL,上下游引物各1.5 μL,無酶水3 μL;配好的反應體系經94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,循環擴增40次后得到每孔循環數值,通過相對定量法2-ΔΔCt分析實驗數值。

1.2.7 Western blot檢測TXNDC12、遷移相關蛋白以及凋亡相關蛋白的表達水平 各組細胞轉染48 h后提取蛋白,用預冷PBS洗凈細胞表面培養基后,加入細胞裂解液(裂解液與蛋白酶抑制劑比例為100∶1),將細胞收集在離心管中,置于冰上10 min,劇烈震蕩30 s,重復5次后,14 000 r/min離心15 min,上清即為提取的蛋白質。收集好的蛋白通過BCA法檢測其濃度,調整各組上樣量至30 μg。經高溫變性,SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉后,進行TXNDC12(1∶2 000)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、β-catenin(1∶3 000)、N-cadherin(1∶2 000)、Bax(1∶5 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)和內參β-actin(1∶4 000)的一抗孵育,用TBST清洗一抗,然后將膜與稀釋的兔二抗或鼠二抗(1∶4 000)室溫孵育1.5 h,洗去膜上殘余二抗后進行曝光顯影,通過Image J軟件對條帶進行統計分析。

1.2.8 CCK-8法檢測結直腸癌細胞的增殖能力 取對數生長期的細胞以3 000個/孔鋪于96孔板中。每組設置5個復孔,培養24 h后轉染(此時為0 h),然后繼續培養24,48,72 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃避光孵育2 h在450 nm處測定其吸光度,并計算細胞增殖率,細胞增殖率=(si-TXNDC12-2組吸光度-背景值吸光度)/(NC組吸光度-背景值吸光度)×100%,最后采用GraphPad 7.00軟件繪制細胞增殖曲線。

1.2.9 克隆形成實驗檢測結直腸癌細胞的集落形成能力 各處理組細胞轉染24 h后以1 000個/孔接種到12孔板中,每組3個復孔,置于含5% CO2的37 ℃培養箱中培養,每隔3～4 d換液,培養約10 d出現肉眼可見的細胞集落即形成克隆,停止培養,PBS洗凈培養基后4%多聚甲醛固定30 min,然后使用0.1%結晶紫染色30 min,用PBS緩沖液將染料清洗晾干,晾干后采集圖像。

1.2.10 劃痕實驗檢測結直腸癌細胞的遷移能力 將各組細胞以4×104個/孔接種于6孔板中,24 h后轉染,轉染后6～8 h沿孔的中間劃痕(此時為0 h),用PBS沖洗脫落的細胞,然后在1%血清培養基中繼續培養24,48,72 h,顯微鏡下觀察細胞遷移情況,并用Image J軟件對劃痕圖片進行統計分析。

1.2.11 Hochest染色檢測結直腸癌細胞凋亡情況 各處理組細胞以1 000個/孔鋪于6孔板中,轉染48 h后用預冷PBS洗凈細胞表面培養基,然后用4%多聚甲醛固定30 min,將1∶100稀釋后的Hoechst染料500 μL加入6孔板中染色3～5 min,最后使用PBS洗滌2～3次,每次3～5 min,熒光顯微鏡下觀察拍攝。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 TXNDC12在結直腸癌中的表達

GEPIA在線工具分析結果顯示,相較于正常結直腸組織,TXNDC12在結直腸癌組織中表達顯著升高(P<0.05,見圖1A)。且UALCAN數據庫分析結果表明,與正?；颊呦啾?TXNDC12在不同N分期患者中的表達也升高(見圖1B)。延安大學附屬醫院病理組織樣本的Western blot結果證實,與癌旁組織相比,結直腸癌組織中TXNDC12高表達(見圖1C)。以上結果表明TXNDC12在結直腸癌中高表達,且TXNDC12的高表達與結直腸癌患者淋巴結轉移相關。

圖1 TXNDC12在結直腸癌中表達Figure 1 The expression of TXNDC12 in colorectal cancer

2.2 TXNDC12 mRNA表達水平與結直腸癌免疫浸潤的關系

鑒于腫瘤組織浸潤的免疫細胞對腫瘤發生發展的重要作用,本研究通過Sanger Box網站對腫瘤微環境中的非腫瘤成分(免疫細胞、基質細胞)等進行評分,發現TXNDC12的mRNA表達水平與結直腸癌基質評分(stromal-score)、免疫評分(immune-score)以及免疫基質聯合評分(estimate-score)呈負相關(P<0.001,見圖2);此外,TXNDC12的表達水平與CD4+T細胞、巨噬細胞和非免疫細胞內皮細胞和成纖維細胞(CAFS)的浸潤豐度也呈負相關(P<0.05,見圖3)。綜上所述,TXNDC12與結直腸癌組織免疫浸潤呈負相關。

圖2 基于TCGA數據庫分析結直腸癌中TXNDC12表達水平與基質評分、免疫評分和基質免疫聯合評分之間的相關性 (n=373)Figure 2 Correlations between TXNDC12 expression and stromal-score, immune-score, and estimate-score in colorectal cancer based on TCGA database (n=373)

圖3 基于TCGA數據庫分析結直腸癌組織中TXNDC12表達水平與免疫細胞浸潤的關系 (n=373)Figure 3 Relationships between TXNDC12 expression level and immune cell infiltration in colorectal cancer tissues based on TCGA database (n=373)

2.3 TXNDC12在正常結直腸上皮細胞和結直腸癌細胞系中的表達

Western blot檢測結直腸癌細胞系中TXNDC12蛋白的表達情況,結果顯示,與正常腸上皮細胞NCM460相比,TXNDC12在HT-29、RKO和HCT116等結直腸癌細胞系中表達顯著升高(P<0.05,見圖4A)。RT-qPCR結果顯示TXNDC12在HT-29等結直腸癌細胞系中mRNA的表達量也顯著高于正常腸上皮細胞NCM460(P<0.05,見圖4B)。以上結果表明,TXNDC12在結直腸癌細胞中高表達,與上述數據庫預測的表達差異結果一致。

2.4 敲低TXNDC12結直腸癌細胞模型的建立

Western blot和RT-qPCR結果顯示,與NC組相比,si-TXNDC12-2組TXNDC12在HT-29和RKO細胞系中的蛋白和mRNA表達水平均顯著下調(P<0.05,見圖5)。因此,后續選擇HT-29和RKO細胞作為功能實驗的探究。

2.5 敲低TXNDC12對結直腸癌細胞增殖能力的影響

CCK-8結果顯示,與NC組相比,si-TXNDC12-2組HT-29和RKO細胞的增殖能力受到顯著抑制,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖6)。克隆形成實驗結果表明,相較于NC組,si-TXNDC12-2組HT-29和RKO細胞的集落形成數量顯著減少(P<0.01,見圖7)。

注：與NC組比較,**P<0.01。圖7 敲低TXNDC12對HT-29和RKO細胞克隆形成能力的影響Figure 7 Effect of TXNDC12 knockdown on clone formation in HT-29 and RKO cells

2.6 敲低TXNDC12對結直腸癌細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結果顯示,與NC組相比,si-TXNDC12-2組HT-29和RKO細胞的遷移能力受到顯著抑制(P<0.05,見圖8)。且利用Western blot輔助檢測遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9等的表達,發現與NC組相比si-TXNDC12-2組遷移相關蛋白的表達顯著降低(P<0.05,見圖9)。以上實驗結果表明,敲低TXNDC12可抑制結直腸癌細胞的遷移能力。

2.7 敲低TXNDC12對結直腸癌細胞凋亡蛋白的影響

Hochest 33258實驗結果顯示,與NC組相比,si-TXNDC12-2組HT-29和RKO凋亡細胞數增加(見圖10)。Western blot結果顯示,與NC組相比,si-TXNDC12-2組Bax、Caspase-3蛋白表達增加,而Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05,見圖11)。綜上所述,敲低TXNDC12可能通過促進結直腸癌細胞凋亡來抑制腫瘤生長。

注：紅色箭頭指示呈亮藍色熒光的細胞為凋亡細胞。圖10 Hochest 33258染色檢測HT-29和RKO細胞的凋亡水平Figure 10 Apoptosis of HT-29 and RKO cells by Hochest 33258 staining

3 討論

結直腸癌因易發生遠端轉移和侵襲經常造成患者預后不良甚至死亡,且尚無特效靶點藥物。因此要想改善此類疾病的臨床現狀,探究其精細調控機制,掌握其發生發展的規律異常重要。目前聚焦腫瘤基因層面的研究結果顯示,結直腸癌的發生發展受多種信號通路調控,比如Wnt/β-catenin、PI3K-AKT-mTOR、MAPK[15-17]等,此類通路可以被不同基因激活或抑制從而促進或抑制結直腸癌細胞的增殖、EMT等惡性表型。但目前基于此類的諸多研究,能切實用于臨床診療的并不多,所以近年來針對腫瘤的研究大多向免疫治療研究領域轉換,摒棄以往采取外源性措施直接攻擊癌細胞的治療方式,希望通過各種方式激活人體自身免疫系統來對抗腫瘤。此種新型癌癥治療方式同樣適用于結直腸癌,而且由于腸道中免疫細胞較為豐富且炎癥本身就是結直腸癌的一大誘因,因此免疫治療在結直腸癌診療中更能發揮出巨大潛能。

近年來,PDI家族已被證實在癌癥中發揮重要作用,然而其家族成員諸多且功能各不相同。TXNDC12作為PDI家族成員之一在膠質瘤、肺腺癌、乳腺癌等腫瘤中呈異常表達[12,13,18],并且參與到各腫瘤的增殖、轉移或預后等生物學進程中。再結合上述結直腸癌的臨床診療現狀,我們在細胞層面對TXNDC12在結直腸癌中的影響進行了功能分析和探索,結果發現,TXNDC12在結直腸癌組織及細胞中呈異常高表達,并且敲低TXNDC12可抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移,促進其凋亡。因此我們推斷TXNDC12可能作為癌基因在結直腸癌的發展過程中發揮重要調控作用。此外,生物數據庫分析顯示,TXNDC12與結直腸癌患者淋巴結轉移有關,深入研究或許可為解決該類疾病腫瘤細胞易轉移、侵襲的特點提供基礎理論依據和方向;針對腫瘤微環境的分析發現TXNDC12與結直腸癌組織中CD4+T細胞、NK細胞、巨噬細胞等免疫浸潤豐度呈負相關,這與現有報道結直腸癌組織中T細胞和B細胞浸潤比例低于正常組織,且在結直腸癌患者中,T細胞和B細胞的浸潤對患者的預后有積極影響[19-21]的研究一致,據此推測TXNDC12可能通過抑制CD4+T細胞對腫瘤的殺傷作用促進腫瘤生長。這一發現可為豐富結直腸癌的發展機制再添視角,也可為結直腸癌的免疫治療研究指出突破方向。

本研究利用常規腫瘤功能研究技術,從細胞層面探究了TXNDC12對結直腸細胞功能的影響,揭示了TXNDC12在結直腸癌的發生發展中可能作為癌基因的角色。然而本研究也存在一定局限性：TXNDC12具體的分子調控關系網絡尚不明確,且僅進行了細胞層面的研究,未進行動物實驗驗證。今后我們將從不同層面繼續全面探究TXNDC12對結直腸癌的具體調控機制,并且對TXNDC12在結直腸癌腫瘤免疫機制方面進行深入探討,以期為改變結直腸癌的臨床診療現狀提供有力的理論基礎和新視角。