LINC00324對黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及分子機制

馬詩淇,丁 毅,李 敏,王夢慈,張思宇,馮樹梅*

(1新疆醫科大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室,新疆地方病分子生物學重點實驗室,烏魯木齊 830011;2南京醫科大學基礎醫學院病理學教研室;3新疆第二醫學院基礎醫學院解剖學教研室;*通訊作者,E-mail：87391167@qq.com)

皮膚黑色素瘤是一種高度惡性的腫瘤,具有很強的侵襲性和轉移性[1]。與皮膚癌相比,其具有較高的死亡率(65%～70%)[2]和較低的生存期(中位生存期僅為9個月)[3]。據統計,我國惡性黑色素瘤患者5年的生存率不足10%。因此明確皮膚黑色素瘤的發病機制,有利于早期發現并預防患者從良性痣向惡性腫瘤的轉變,降低黑色素瘤患者的死亡率。

大多數長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是由RNA聚合酶Ⅱ(RNA POI Ⅱ)從獨立啟動子轉錄而來的長度大于200 bp的非編碼轉錄本[4]。與編碼蛋白質相比,lncRNAs參與幾乎所有細胞的功能。自噬是腫瘤細胞用來調節細胞壓力和新陳代謝的一種分解代謝機制,其完成依賴于正常溶酶體功能[5],抑制或激活自噬可破壞腫瘤細胞[6]。本課題組前期通過生物信息學分析得到與自噬相關的lncRNAs,其中LINC00324可作為抑癌基因發揮作用,并通過KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)和GO(gene ontology)數據庫分析推測黑色素瘤的潛在機制可能與自噬相關[7]。并且有研究表明,Bcl-2能夠通過多種途徑參與細胞自噬,例如,YAP(Yes-associated protein)通過上調Bcl-2抑制自噬從而促進人結直腸癌的發展[8]。目前在黑色素瘤中與自噬相關lncRNAs的研究鮮有報道,因此本研究以LINC00324為研究對象,探索LINC00324是否通過Bcl-2介導自噬抑制從而進一步影響黑色素瘤細胞的增殖、轉移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人源性皮膚惡性黑色素瘤細胞系(SK-MEL-2)購于武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM培養基、青霉素-鏈霉素溶液購買于美國Hyclone公司;胎牛血清購于美國Gibco公司;過表達載體由上海吉凱基因科技有限公司構建,siRNA由廣州銳博生物技術有限公司構建;LipofectamineTM3000購于美國Thermo Fisher公司;LC3B(L7543)購于美國Sigma公司;p62(ab91526)、Bcl-2(ab196495)購于美國Abcam公司;GAPDH(6004-1-lg)購于美國ProteintechGroup公司;反轉錄試劑盒、qRT-PCR檢測試劑盒購于北京全式金生物科技有限公司;Matrigel膠購于美國Corning公司。

1.2 生物信息學分析

在GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)數據庫中輸入目的基因LINC00324,分析工具欄中選擇“Boxplot”,腫瘤類型選擇黑色素瘤,log2FC臨界值定為1,P值定為0.01,分析其在黑色素瘤與癌旁組織中的表達情況。其次,在分析工具欄中選擇“Survival plot”,分組方式選擇“Median”,分析LINC00324在黑色素瘤患者中的生存相關性,評估其在黑色素瘤中的預后價值。

1.3 細胞轉染及分組

使用LipofectamineTM3000轉染試劑,將LINC00324過表達載體和siRNA轉染至鋪有SK-MEL-2細胞的6孔板或96孔板中,并標記為過表達陰性對照組(NC組)、過表達組(OE組)、沉默陰性對照組(si-NC組)和沉默組(si-LINC00324組)。將轉染細胞置于37 ℃,5% CO2培養箱中培養24 h,收集細胞,采用qRT-PCR檢測LINC00324的轉染效率以及Beclin1、LC3A/B、Bcl-2的mRNA表達水平,CCK-8檢測細胞增殖,劃痕實驗檢測細胞遷移,Transwell實驗檢測細胞侵襲,Western blot檢測LC3B、p62、Bcl-2的蛋白表達水平。

1.4 qRT-PCR檢測LINC00324以及Beclin1、LC3A/B、Bcl-2的mRNA表達

采用Trizol法從細胞中提取總RNA,利用反轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA,然后采用PerfectStart Green qPCR SuperMix試劑盒對cDNA進行擴增。β-actin為內參基因進行歸一化處理。反應條件∶94 ℃預變性30 s;94 ℃變性5 s,退火延伸60 ℃ 30 s,40個循環。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖能力

在96孔板中轉染LINC00324過表達載體和siRNA,培養24 h后,去除舊培養基,每孔加入100 μL新鮮完全培養基以及10 μL CCK-8試劑,在37 ℃含有5% CO2恒溫箱中培養2 h,使用酶標儀檢測在450 nm波長處的光密度(OD)值。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將細胞接種于6孔板中(3×105個/孔),當細胞匯合度達到95%左右時,使用200 μL無菌槍頭垂直劃線,PBS清洗3次并在無血清培養基中孵育,倒置顯微鏡下觀察0 h和24 h細胞的遷移情況并拍照。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

將處理后的細胞分別接種于Matrigel基質膠處理和未處理的Transwell小室上室中(8×104個/孔),下室加入700 μL含有10%胎牛血清的完全培養基,于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養36 h,加入4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色15 min,使用倒置顯微鏡觀察拍照。

1.8 Western blot檢測LC3B、p62、Bcl-2的蛋白表達

將細胞裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑混合物加入轉染24 h后的細胞中裂解30 min,提取細胞總蛋白,BCA法定量總蛋白。采用SDS-PAGE分離蛋白,轉移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,一抗4 ℃搖床孵育過夜,抗體及稀釋比例為：LC3B(1∶2 000)、p62(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、GAPDH(1∶10 000)。二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,使用ECL試劑盒發光顯影。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 黑色素瘤組織中LINC00324的表達及與患者預后的關系

GEPIA數據庫分析顯示,與癌旁組織相比,LINC00324在黑色素瘤組織中表達下調(P<0.01,見圖1A)。生存分析結果顯示,LINC00324低表達患者具有更短的生存時間(見圖1B)。

圖1 LINC00324在黑色素瘤組織中的表達和生存分析Figure 1 Expression of LINC00324 in melanoma tissues and survival analysis

2.2 LINC00324在黑色素瘤細胞中成功轉染

qRT-PCR檢測結果顯示,與NC組相比,OE組SK-MEL-2細胞中LINC00324顯著上調(P<0.001,見圖2A);與si-NC組相比,si-LINC00324組細胞中LINC00324下調(P<0.01,見圖2B),認為轉染成功。

注：與NC組相比,***P<0.001;與si-NC組相比,##P<0.01。圖2 黑色素瘤細胞SK-MEL-2中LINC00324的轉染效率Figure 2 Transfection efficacy of LINC00324 in melanoma cell SK-MEL-2

2.3 LINC00324抑制SK-MEL-2細胞的增殖和遷移能力

劃痕實驗結果顯示,與NC組相比,OE組細胞遷移能力明顯受到限制(P<0.001);與si-NC組相比,si-LINC00324組細胞遷移能力顯著上調(P<0.01)。CCK-8實驗結果顯示,與NC組相比,OE組細胞增殖能力降低(P<0.001);與si-NC組相比,si-LINC00324組細胞增殖能力升高(P<0.01,見圖3)。

2.4 LINC00324抑制腫瘤細胞的侵襲能力

Transwell實驗結果顯示,與NC組相比,OE組細胞侵襲能力被抑制(P<0.01,見圖4)。

2.5 LINC00324抑制黑色素瘤細胞的自噬能力

qRT-PCR結果顯示,在OE組細胞中,Beclin1、LC3A/B顯著下調(P<0.01,見圖5)。Western blot檢測結果顯示,與NC組相比,OE組細胞中,LC3BⅡ的表達下調,p62的表達上調(均P<0.05);與si-NC組相比,si-LINC00324組細胞中LC3BⅡ上調,p62下調(均P<0.05,見圖5)。以上結果提示,在黑色素瘤細胞中,LINC00324抑制細胞自噬。

注：與NC組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與si-NC組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。圖5 LINC00324對黑色素瘤細胞SK-MEL-2自噬能力的影響Figure 5 Effect of overexpression of LINC00324 on autophagy ability in SK-MEL-2 cells

2.6 Bcl-2介導LINC00324誘導的自噬抑制

qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示,與NC組相比,OE組Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平顯著上調(P<0.01);與si-NC組相比,si-LINC00324組Bcl-2的mRNA以及蛋白表達水平顯著下調(P<0.01,見圖6)。以上結果提示,Bcl-2可能介導了LINC00324誘導的自噬抑制。

注：與NC組相比,**P<0.01;與si-NC組相比,##P<0.01,###P<0.001。圖6 過表達和沉默LINC00324對SK-MEL-2細胞中Bcl-2表達的影響Figure 6 Effect of overexpression and siRNA of LINC00324 on Bcl-2 expression in SK-MEL-2 cells

3 討論

lncRNAs功能的獲得和喪失可以影響細胞發育和疾病發生[9]。LINC00324是一個2082 bp的基因間非編碼RNA,位于人染色體17p13.1上,其被發現在多個腫瘤內異常表達,并與腫瘤的增殖、遷移、侵襲、凋亡和預后較差有關[10]。例如,在肺腺癌組織中LINC00324高表達,其異常表達能夠促進肺腺癌增殖并抑制其凋亡[11]。Sharma等[12]研究發現,LINC00324在食管鱗狀細胞癌中顯著上調,并確定其可以通過靶向miR-493-5p激活MAPK信號通路從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移。目前,LINC00324在黑色素瘤中的研究鮮有報道,其作用及具體機制尚不明確。因此,有必要進一步探討LINC00324在黑色素瘤中的表達以及對黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及分子機制,旨在為黑色素瘤患者提供新的診療思路。

本研究通過數據庫分析顯示,LINC00324在黑色素瘤細胞和組織中低表達,且低表達與患者預后較差有關,進一步通過轉染LINC00324過表達載體和siRNA,利用CCK-8實驗、劃痕實驗和Transwell實驗檢測,證明其可以抑制黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。以上結果提示LINC00324可能作為黑色素瘤治療中新的分子靶點。

自噬是一種在進化上高度保守、用于降解和回收利用細胞內生物大分子和受損細胞器的過程[5]。自噬通過抑制良性腫瘤的發展和促進惡性腫瘤的進一步惡化在癌癥中發揮雙重作用[13]。在癌癥早期,自噬在維持細胞動態平衡階段抑制腫瘤生長,隨著腫瘤發展,癌細胞表現出高度自噬依賴性,自噬對細胞具有促進作用[6]。當自噬發生時,胞漿型LC3-Ⅰ會被酶解掉一小段多肽,轉變為膜型LC3-Ⅱ;p62作為泛素化結合蛋白,與泛素化的蛋白質結合后,與自噬小體內的LC3-Ⅲ結合形成復合物并一同在自噬溶酶體內降解。因此LC3-Ⅱ增多、p62減少常常被認為是自噬流通暢的標志[14]。本研究通過qRT-PCR和Western blot實驗檢測,結果顯示,過表達LINC00324后自噬相關的mRNA水平和蛋白水平均顯著降低,提示自噬被抑制。并且,還有研究表明,抗凋亡基因Bcl-2是與自噬相關的細胞死亡的重要調節因子,且Bcl-2的過表達不會促進細胞增殖但阻止細胞死亡[15]。例如,Zhang等[16]研究顯示,Bcl-2相互作用蛋白3(BNIP3)在缺氧條件下可以通過抑制Bcl-2與BECN1結合來激活自噬從而促進乳腺癌腫瘤發生;Liu等[17]研究顯示,在宮頸癌中,過表達MiRNA-211可以通過抑制Bcl-2誘導細胞自噬,并進一步抑制宮頸癌細胞的增殖。本研究中,過表達LINC00324后Bcl-2顯著上調,沉默后則相反。因此推測Bcl-2可能介導了黑色素瘤細胞內的自噬抑制,并進一步影響黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述,本研究初步證實了LINC00324在黑色素瘤細胞中低表達且與患者預后相關,過表達LINC00324可以抑制黑色素瘤細胞的自噬水平以及增殖、遷移和侵襲能力,同時,研究顯示抗凋亡基因Bcl-2上調,推測其參與了該過程。但是本研究仍存在局限性,缺少對自噬和Bcl-2的回復實驗以及體內實驗。因此,后續會進一步通過自噬激活劑以及基因敲除Bcl-2更深層次的對本研究論點進行驗證,為黑色素瘤的治療提供新的視角和靶點。