枸杞多糖促進HL-60細胞的吞噬功能

龐洪源,李 帆,華夢晴,宋傳旺*

(1蚌埠醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院免疫教研室,蚌埠 233030;2慢性疾病免疫學基礎(chǔ)與臨床安徽省重點實驗室;*通訊作者,E-mail：bbmcscw@foxmail.com)

中性粒細胞是機體天然免疫重要的組成部分,在控制疾病發(fā)展方面發(fā)揮著重要作用[1-3]。中性粒細胞可通過活性氧和水解酶殺傷入侵體內(nèi)的病原體,因此其處于機體抵抗細菌和真菌的第一道防線[4]。吞噬作用通常指吞噬細胞攝取直徑大于0.5 μm顆粒的生物學活動,主要由中性粒細胞、巨噬細胞等專職吞噬細胞完成[5]。枸杞(Lycium bararum)是一種藥食兩用藥材,被廣泛應(yīng)用于保健食品的加工。研究表明其含有多糖類、黃酮類、花色苷類、原花青素類、生物堿類等多種化學成分,且具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、降糖調(diào)脂、降壓、抗腫瘤等藥理作用[6-8]。

枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP)是枸杞的主要活性成分,LBP在預防和治療多種疾病方面具有巨大潛力,包括促進腸道益生菌生長、保護神經(jīng)、促進造血、抗衰老、降血脂、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能[9-13]。但目前關(guān)于LBP是否對吞噬功能產(chǎn)生影響還不甚清楚。本研究以人中性粒細胞株HL-60細胞為研究對象,觀察LBP對HL-60細胞吞噬功能的影響,并對相關(guān)機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 細胞

人中性粒細胞株HL-60細胞系購自武漢普諾賽公司。

1.2 主要試劑

枸杞多糖購于Solarbio公司;GAPDH抗體購于proteintech公司;t-AKT抗體購于proteintech公司;p-AKT抗體購于Beyotime公司;HRP Goat Anti-Rabbit IgG購于Beyotime公司;HRP Goat Anti-Mouse IgG購于Beyotime公司;Wortmannin購于Beyotime公司;PE-Rat IgG2a kappa Isotype Control購于美國Invitrogen公司;PE-Rat IgG2b kappa Isotype Control購于美國Invitrogen公司;PE-Rat IgG1 kappa Isotype Control購于美國Invitrogen公司;PE-CD36抗體購于美國Invitrogen公司;PE-MACRO抗體購于美國Invitrogen公司。

1.3 細胞株的培養(yǎng)和分組

人中性粒細胞株HL-60細胞為懸浮細胞,置于二氧化碳培養(yǎng)箱,每2 d換1次培養(yǎng)液,細胞密度占瓶底近80%時,離心收集細胞,根據(jù)不同實驗,調(diào)配細胞濃度,置于相應(yīng)的孔板里,

1.4 細胞存活率的檢測

將對數(shù)生長期的HL-60細胞,以每孔1×104個/mL的細胞數(shù)接種于96孔板中,12 h后開始處理,加入不同濃度LBP,每個濃度設(shè)3個平行孔,24 h后分別取出培養(yǎng)板,倒置光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。加入20 μL CCK-8,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后在酶標儀上檢測,以空白組調(diào)零,檢測波長為450 nm,參照波長為 630 nm,測定各孔吸光度值,取3個復孔的平均吸光度值作為該濃度條件下的OD值。試驗重復3次,取平均值。計算細胞存活率,公式：細胞存活率(%)=[(實驗組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)]×100%。

1.5 流式細胞術(shù)檢測不同濃度的LBP對HL-60細胞吞噬功能的影響

取對數(shù)生長期的HL-60細胞,將細胞移入24孔板(每孔約1×105個/mL)中,設(shè)置空白組和LBP組,空白組不做任何處理,LBP組加入不同濃度的LBP(0,1,10,100,200,500 μg/mL)后,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共同孵育24 h后,按1∶10(細胞數(shù)量∶E.coli數(shù)量)加入FITC標記的E.coli,2 h后將細胞收集、離心后,加入PBS洗細胞,之后加入2%多聚甲醛固定,用流式細胞儀測定吞噬率。

1.6 Western blot檢測p-Akt蛋白的表達

取對數(shù)生長期的HL-60細胞,將細胞移入6孔板(每孔約50×105個/mL)中,設(shè)置對照組和LBP組,對照組不作任何處理,LBP組加入LBP(200 μg/mL),繼續(xù)刺激24 h,收集細胞后,加入新配制的細胞裂解液,在冰上裂解后收集上清并進行蛋白樣本制備。將樣品加入電泳孔進行SDS-PAGE電泳,200 mA條件下轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上,后加入5%快速封閉液室溫封閉2 h,滴加一抗p-Akt(1∶1 000),Akt(1∶1 000),GAPDH(1∶50 000),4 ℃孵育過夜,TBST清洗3次,每次10 min,滴加對應(yīng)辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔和羊抗鼠二抗(1∶1 000),室溫封閉2 h,TBST清洗3次,每次10 min,ECL試劑盒顯影,以GAPDH為內(nèi)參照,使用Image J軟件對圖像的灰度值進行分析。

1.7 流式細胞術(shù)檢測PI3K/Akt信號通路與吞噬功能的關(guān)系

取對數(shù)生長期的HL-60細胞,將其接種于24孔板(每孔約1×105個)中,設(shè)置對照組、LBP組和LBP+Wortmannin組。對照組不作任何處理,LBP組加200 μg/mL LBP,LBP+Wortmannin組首先加入PI3K特異性抑制劑Wortmannin(1 μmol/L)2 h后,再加入200 μg/mL LBP繼續(xù)刺激24 h,之后按1∶10(細胞數(shù)量∶E.coli數(shù)量)加入FITC標記的E.coli,2 h后將細胞收集、離心后,加入PBS重懸細胞,之后加入2%多聚甲醛固定,用流式細胞術(shù)測定吞噬率。

1.8 流式細胞術(shù)檢測HL-60細胞表面受體表達情況

取對數(shù)生長期的HL-60細胞,將其接種于24孔板中(每孔約1×105個),設(shè)置對照組、同型對照組和LBP組,對照組和同型對照組未加LBP,LBP組加200 μg/mL LBP,然后置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h,之后將各組細胞收集到離心管中,調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL,吸取100 μL重懸液到流式管中,同型對照組分別加入PE-Rat IgG2a kappa Isotype Control、PE-Rat IgG2b kappa Isotype Control、PE-Rat IgG1 kappa Isotype Control,LBP組分別加入PE-CD36、PE-CD204、PE-CD209、PE-Dectin、PE-MARCO抗體冰上避光孵育30 min,PBS洗滌2遍,然后2%多聚甲醛固定,流式細胞術(shù)檢測細胞表面受體表達情況。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的LBP處理對HL-60細胞存活率的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示,使用不同濃度的LBP作用于HL-60細胞24 h后,與0 μg/mL LBP相比,1,10,100,200,500 μg/mL LBP對細胞存活率無明顯影響(P>0.05,見圖1)。因此上述濃度的LBP可以用于后續(xù)實驗,不會產(chǎn)生細胞毒性。

圖1 CCK-8法檢測不同劑量LBP對HL-60細胞存活率的影響Figure 1 Effect of different concentrations of LBP on the viability of HL-60 cells assessed by CCK-8 assay

2.2 LBP促進HL-60細胞吞噬E. coli

采用不同濃度的LBP刺激HL-60細胞24 h后,與0 μg/mL相比,1,10,100,200 μg/mL HL-60細胞吞噬E.coli的功能明顯增強(見圖2)。當LBP的刺激濃度為200 μg/mL時,HL-60細胞吞噬E.coli功能最強(P<0.01,見圖2)。

圖2 LBP促進HL-60細胞吞噬E. coli功能Figure 2 LBP promotes the phagocytosis of E. coli in HL-60 cells

2.3 LBP通過PI3K/Akt途徑促進HL-60細胞吞噬E. coli

HL-60細胞受200 μg/mL LBP刺激24 h后,Western blot結(jié)果顯示p-Akt蛋白表達量明顯增加(P<0.05,見圖3),說明LBP激活了HL-60細胞PI3K信號通路。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,使用PI3K特異性阻斷劑,LBP促進HL-60細胞吞噬E.coli功能部分被抑制(P<0.05,見圖3),提示LBP通過激活PI3K/Akt通路來促進HL-60細胞吞噬E.coli。

2.4 LBP對HL-60吞噬受體表達的影響

LBP促進HL-60細胞吞噬E.coli功能升高,可能涉及LBP上調(diào)HL-60細胞吞噬相關(guān)受體,因此我們檢測了HL-60細胞表面與吞噬E.coli相關(guān)的受體。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,與對照組相比,LBP組HL-60細胞表面CD204、CD209、Dectin、CD36受體沒有明顯變化(P>0.05),但MARCO受體表達明顯升高(P<0.05,見圖4),這說明LBP促進HL-60細胞吞噬E.coli功能升高可能涉及MARCO受體。

3 討論

吞噬功能是一個高度復雜的生物學過程,它通過清除外界細菌、真菌等病原微生物,從而發(fā)揮抗感染的作用。中性粒細胞是人類血液中主要的吞噬細胞,也是遷移到炎癥部位的第一批白細胞,在機體抗感染方面發(fā)揮尤為重要的作用。

LBP因其具有多種生物學活性受到廣泛關(guān)注。目前LBP多用于抗腫瘤[14]、抗氧化[15]、抗衰老[16]、保肝[17]等方面的研究。一些研究表明LBP也具有抗感染作用,如王瑩等[18]發(fā)現(xiàn)LBP可提高RAW264.7細胞的吞噬功能;高翔[19]發(fā)現(xiàn)LBP能夠提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力,從而增強機體的免疫功能。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)LBP能促進HL-60細胞吞噬E.coli功能。研究表明PI3K/Akt信號通路參與細胞吞噬功能的調(diào)控,有研究表明胰島素樣生長因子1(IGF-1)通過激活PI3K/AKT信號通路增強小鼠BV-2小膠質(zhì)細胞的吞噬功能[20,21]。本研究發(fā)現(xiàn)LBP刺激HL-60細胞后p-Akt蛋白表達增加,并且使用PI3K阻斷劑抑制該通路后,LBP促進HL-60細胞吞噬E.coli功能被抑制,說明PI3K/Akt信號通路在HL-60細胞吞噬E.coli功能中的重要作用。

LBP促進HL-60細胞的吞噬功能,可能涉及其上調(diào)HL-60細胞吞噬相關(guān)受體的表達。吞噬相關(guān)受體主要包括C型凝集素家族成員和清道夫受體(SR)。C型凝集素受體主要包括CD209、識別β-葡聚糖的Dectin家族和識別甘露糖側(cè)鏈的甘露糖受體(MR);清道夫受體家族主要包括SR-A家族中的CD204和MARCO受體及SR-B家族成員CD36[22,23]。這兩類受體都是重要的模式識別受體,可參與介導病原體的識別與清除[24],在宿主防御病原體、脂質(zhì)代謝等方面發(fā)揮作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)LBP刺激HL-60細胞表面這兩類受體中的CD204、CD209、Dectin、CD36均無明顯變化,但清道夫受體A家族中的MARCO受體表達上調(diào),提示MARCO受體可能在LBP提升HL-60細胞吞噬E.coli過程中發(fā)揮作用。基因富集分析也發(fā)現(xiàn)MARCO受體與PI3K/AKT信號通路之間存在顯著相關(guān)性[26]。LBP上調(diào)HL-60細胞MARCO受體表達的機制還不甚清楚,有待進一步研究。

綜上所述,本研究證明LBP通過PI3K/Akt信號促進HL-60細胞吞噬E.coli,并且這種吞噬功能的提高可能與MARCO受體表達上調(diào)相關(guān)。這說明了LBP具有抗感染功能的機制,也豐富了LBP的生物學功能,對進一步開發(fā)LBP的藥用價值提供了實驗依據(jù)。