益腎泄濁方對腎纖維化大鼠的治療作用及機制

胡超娜,高繼寧

(1山西中醫藥大學第三臨床學院腎病教研室,太原 030024;2山西省中西醫結合醫院腎病科;*通訊作者,E-mail：gaojining2008@126.com)

腎纖維化(renal fibrosis,RF)與腎功能減退具有高度相關性,是由多種細胞因子介導和多種信號通路轉導的復雜過程,其特征是以腎小管間質中細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度沉積,并因腎臟組織破壞導致腎功能受損[1]。RF是一種發病率很高的疾病,是多種慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)從發展到終末晚期共同的病理變化過程,是導致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的共同途徑[2]。然而,在CKD發生的慢性損傷期間,腎間質纖維化沉積不受約束,減少腎臟組織的血液供應,致腎臟功能減弱,最終走向腎衰竭[3]。據流行病學調查數據顯示,全球CKD患病率約為13%[4],中國CKD在11歲以上成年人中總體患病率約為4.6%[5,6]。一些患者最終進展為ESRD,需透析或腎移植治療,使多個系統和器官功能紊亂,出現各種并發癥,嚴重影響了身心健康[7]。因此,了解RF的發生發展及防治措施具有重大的社會意義。

RF形成主要是細胞上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的過程,研究發現分泌型糖蛋白(Wnt)/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路是細胞EMT調控中主要通道[8]。在正常腎小管上皮細胞中Wnt/β-catenin信號通路處于抑制狀態,在受到腎臟“纖維化微環境”刺激下,Wnt/β-catenin信號通路被異常激活,Wnt配體與膜受體結合,抑制β-catenin降解,從而使其處于持續活化狀態,產生大量的膠原纖維物質堆積,促進EMT的發生與發展,觸發腎小管上皮細胞間充質過渡,進而促進RF的進展[9]。前期研究證實益腎泄濁方可提高腎組織中保護性抗衰老蛋白Klotho mRNA表達,抑制TGF-β1表達,從而改善腎纖維化[10]。另外研究表明Wnt/β-catenin信號通路與TGF-β信號通路、Klotho信號通路具有相關性[11],因此本研究通過觀察益腎泄濁方對Wnt/β-catenin信號通路的影響,探討益腎泄濁方治療腎纖維化的作用機制,進而延緩CKD進展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

正常SPF級SD雄性大鼠66只,體質量(220±20)g,8周齡,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,動物合格證號：1103222200090711,生產許可證號：SCXK(京)2019-0008。大鼠塊狀飼料和刨花墊料也由該公司提供。于山西省中醫藥研究院實驗動物中心飼養,大鼠日常飲純凈蒸餾水由實驗室提供。飼養溫度20～25 ℃,相對濕度45%～55%。大鼠適應性飼養1周。

1.2 藥物及試劑

益腎泄濁方(生黃芪45 g,地黃15 g,當歸12 g,金蟬花12 g,桃仁10 g,醋鱉甲20 g,落得打30 g,大黃炭10 g,燙水蛭6 g),由山西省中西醫結合醫院中藥免煎藥房提供,免煎顆粒,規格：14.5 g/副,純凈蒸餾開水溶解;尿毒清顆粒(生產批號：20220727,廣州康臣藥業有限公司,規格：5 g×15袋/盒);腺嘌呤(批號：C14026463,上海麥克林生化科技股份有限公司,產品編號：A6279,規格：100 g);HE和Masson染色試劑、SCr和BUN測定試劑盒、mAlb和UTP測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司);一抗Wnt1抗體(批號：bs-1739R,北京博奧森生物科技有限公司)、抗β-catenin抗體(批號：bs-1165R,北京博奧森生物科技有限公司);二抗(批號：PV-9001,北京中杉金橋生物科技有限公司);DAB顯色試劑盒(批號：ZLI-9019,北京中杉金橋生物科技有限公司)。

1.3 儀器

電子秤和代謝籠(實驗室),全自動計算機圖像分析儀(美國Alpha公司),全自動血生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司,型號AU5800),尿液生化分析儀(德國科寶公司,型號Palio300),高速冷凍離心機(美國貝克曼公司,型號Avanti J-30I),切片機(美國熱電公司,型號CM1950),全自動脫水機(美國Thermo公司,型號Excelsior87),生物組織包埋機(湖北維泰公司公司,型號TB721D),烤片機(德國Leica公司,型號CM202WE),臺式離心機(美國SIGAMA公司,型號13-18K),-80 ℃超低溫冰箱(美國ThermoScientific公司,型號901)。

1.4 分組及造模

按照隨機數字表法將SD大鼠分為：空白組、模型組、尿毒組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每組11只。各組大鼠適應性喂養1周后,除了空白組灌服同等劑量的生理鹽水外,其余5組大鼠每日同一時間灌服濃度為2%的200 mg/kg腺嘌呤溶液,灌胃4周,完成造模。造模結束后,每組隨機抽取1只大鼠,腹主動脈采血后測血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平,取腎組織HE染色,光鏡下觀察并照相,鏡下觀察大鼠腎間質纖維化,大量炎性細胞浸潤,腎小球結構不完整,出現萎縮和硬化,SCr、BUN增高,腎纖維化且血肌酐水平處于133～200 μmol/L,即為腎纖維化大鼠模型造模成功[11]。整個實驗過程所有大鼠進水及飲食均不受限制。

1.5 給藥

中藥用量按照大鼠與成人標準體質量(70 kg)劑量換算表換算,每千克大鼠給中藥量等于每千克成人標準體質量的6.3倍藥量[12],其中成人等效劑量為中劑量組,1/2等效量為低劑量組,2倍等效量為高劑量組,即每組分別灌服0.65,1.3,2.6 g/(kg·d),尿毒清組灌胃給予尿毒清顆粒1.6 g/(kg·d)(0.16 mg/mL),空白組和模型組給予生理鹽水(10 ml/kg)灌胃,給藥8周。從造模結束的第1天開始,空白組給予等量生理鹽水灌服,其余組同時給予藥物,觀察并記錄大鼠的一般情況。

1.6 取材

給藥8周后,利用代謝籠收集24 h尿液,離心后,取上清液,待測24 h UTP、24 h mAlb。大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg,10 mL/kg)麻醉,開腹,腹主動脈取血,保存于一次性采血管中,靜置10 min,離心,取上清待測SCr、BUN。采血結束后摘取腎組織固定、石蠟包埋、切片,厚度2 μm備用進行HE和Masson染色和5 μm備用進行免疫組化檢測,觀察其大鼠腎臟的纖維化病理改變。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 生化指標檢測 腹主動脈取血,收集血清進行SCr、BUN的測定,收集尿液進行24 h UTP、24 h mAlb檢測。

1.7.2 腎臟組織病理性染色觀察 腎臟組織經4%的多聚甲醛固定后,切片,分別進行常規的HE和Masson染色,最后用中性樹膠封固。在光鏡下觀察腎臟組織的病理變化,并根據Masson染色的藍染膠原纖維情況,運用IPP6.0軟件進行膠原半定量分析,每組10張病理切片,每張切片隨機取3個部位拍照并取其均值,計算每張切片的膠原面積占腎臟組織切片總面積的比例,即膠原容積分數(collagen volume fraction,CVF),由此評估大鼠腎臟組織的纖維化程度。

1.7.3 免疫組織化學法檢測腎臟組織Wnt1/β-catenin表達量 取腎組織石蠟塊,切片、脫蠟和水化,修復抗原,加入適量的阻斷內源性過氧化物酶,孵育10 min,PBS沖洗,滴加一抗Wnt1、β-catenin,6 ℃過夜,滴加二抗兔增強酶標山羊抗兔IgG聚合酶,孵育15 min,PBS沖洗后DAB顯色,蘇木素復染,二甲苯透明,中性樹膠封固。鏡下400倍視野,每張切片隨機取5個視野,拍照,Image Pro Plus 6.0軟件分析各組每張照片中陽性染色面積的平均光密度值,以反映Wnt1和β-catenin表達量。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

用腺嘌呤造模4周后,空白組大鼠活動靈活,體質量增加較快,毛發順滑,有光澤,飲食可,便佳;而其余各組大鼠精神萎靡,活動狀態不佳,反應遲鈍,飲水增加,大便變稀,體質量減輕,大鼠的毛發雜亂卷曲,枯黃,尿量增加。治療8周后與模型組相比較,益腎泄濁方各組大鼠活動狀態、飲食、毛色及二便等均有好轉,高劑量組好轉更為顯著。

2.2 益腎泄濁方對腎纖維化大鼠血清SCr和BUN水平的影響

與空白組比較,模型組、尿毒清組、低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠SCr和BUN水平均升高(P<0.05);與模型組比較,尿毒清組、低劑量組、中劑量組和高劑量組SCr和BUN水平均降低(P<0.05);與尿毒清組比較,低劑量組SCr和BUN水平差異無統計學意義(P>0.05),中劑量組和高劑量組SCr和BUN水平均降低(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組和高劑量組SCr和BUN水平均降低(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組SCr和BUN水平均降低(P<0.05,見表1)。

表1 益腎泄濁方對腎纖維化大鼠血清SCr和BUN水平的影響

2.3 益腎泄濁方對腎纖維化大鼠尿液24 h UTP和24 h mAlb水平的影響

造模后,與空白組比較,模型組、尿毒清組、低劑量組、中劑量組和高劑量組24 h UTP和24 h mAlb水平均升高(P<0.05);治療后,與模型組比較,尿毒清組、低劑量組、中劑量組和高劑量組24 h UTP和24 h mAlb水平均降低(P<0.05);與尿毒清組比較,低劑量組24 h UTP和mAlb水平差異無統計學意義(P>0.05),中劑量組和高劑量組24 h UTP和24 h mAlb水平(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組和高劑量組24 h UTP和24 h mAlb水平均降低(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組24 h UTP和24 h mAlb水平均降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組大鼠治療前后24 h UTP和24 h mAlb的變化

2.4 益腎泄濁方對腎纖維化大鼠腎臟組織病理變化的影響

2.4.1 HE染色 鏡下觀察,空白組細胞核染色后呈現藍紫色,細胞漿、間質肌纖維、基底膜染色后呈現紅色,大鼠腎臟組織形態正常,腎小球結構完整,大小正常,腎小管和腎小球結構清晰可見,染色均勻,未見球膜擴張、粘連、萎縮,腎間質未見纖維化結構的病理改變,基底膜結構完整,未見基底膜增厚的現象(見圖1)。與空白組比較,模型組大鼠腎臟組織出現病理性的改變,腎小球結構不完整,萎縮,出現硬化,腎小球數量明顯減少,腎小管內有炎性細胞的浸潤,呈現空泡樣變,腎小管擴張和萎縮同見,腎小管內和腎間質出現棕色結晶,腎間質大量纖維化,球膜粘連,基底膜增厚,系膜增生,形成腎纖維化;與模型組比較,尿毒清組、低劑量組、中劑量組和高劑量組腎臟組織纖維化病理改變均有所恢復,腎小球數量均有所增加,炎性組織浸潤均改善,但高劑量組改善的效果最為明顯(見圖1)。

圖1 益腎泄濁方對腎纖維化大鼠腎臟組織病理變化的影響 (HE染色,×400)Figure 1 Effect of Yishen Xiezhuo decoction on pathological changes of renal tissue in rats with renal fibrosis (HE,×400)

2.4.2 Masson染色 鏡下觀察,空白組細胞核呈藍紫色,肌纖維呈紅色,只有在系膜和基底膜區域存在極其少量的膠原纖維,呈藍色,無大量的膠原纖維聚集(見圖2)。與空白組比較,模型組大鼠腎臟組織病理性纖維化明顯,病理性纖維化程度越高,其藍色越深,腎間質大量膠原纖維聚集,鏡下呈現大面積的藍色及腎臟Masson染色膠原評分明顯升高(P<0.05);與模型組比較,尿毒清組、低劑量組、中劑量組及高劑量組腎間質纖維化的病理程度均有減輕,藍色面積減少,其藍色變淡,但高劑量組腎臟組織膠原纖維面積最少,膠原評分也明顯降低(P<0.05),纖維化程度改善得最為顯著(見圖2)。

圖2 益腎泄濁方對腎纖維化大鼠腎臟組織病理變化的影響 (Masson染色,×400)Figure 2 Effect of Yishen Xiezhuo decoction on pathological changes of renal tissue in rats with renal fibrosis (Masson,×400)

2.5 益腎泄濁方對腎纖維化大鼠腎臟組織Wnt1和β-catenin蛋白表達的影響

鏡下觀察,空白組Wnt1和β-catenin蛋白低表達及平均光密度值較低,僅在腎小管上皮細胞、腎間質中有微弱的正常表達,呈淺黃色(見圖3,4)。與空白組比較,模型組Wnt1和β-catenin蛋白呈高表達及平均光密度值均升高(P<0.05),腎小管上皮細胞的胞漿和腎間質中廣泛呈棕黃色;與模型組比較,尿毒清組、低劑量組、中劑量組和高劑量組Wnt1和β-catenin蛋白表達及平均光密度值均降低(P<0.05),棕黃色變淺;與尿毒清組比較,低劑量組、中劑量組和高劑量組Wnt1和β-catenin蛋白表達及平均光密度值均降低(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量組和高劑量組Wnt1和β-catenin蛋白表達及平均光密度值均降低(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組Wnt1和β-catenin蛋白表達及平均光密度值均降低(P<0.05),顏色接近淺黃色(見圖3,4,表3)。

表3 益腎泄濁方對腎纖維化大鼠腎臟組織中Wnt1、β-catenin平均光密度值的變化

3 討論

腎纖維化是多種慢性腎臟病持續進展的一個共同結局,對患者的生命健康和生活質量造成了嚴重威脅,其病理變化非常復雜,其發病機制尚未完全闡明,因此對于腎纖維化的實驗及臨床研究勢在必行,中西醫相結合已經成為當下治療該病的重要手段。現代醫學認為腎纖維化是由多種細胞因子和分子介質參與,發病機制與信號通路、炎癥反應、氧化應激、細胞因子等有關,治療上多以激素、免疫抑制劑等為主,但服用這些藥物伴隨的副作用在臨床及科研上尚未得到徹底解決[13],而中醫從整體觀念出發,辨病與辨證相結合,在改善腎纖維化進展上具有顯著成就,中醫學多根據該疾病的臨床突出癥狀和病因

病機,以“水腫”“癃閉”“溺毒”“腎風”“腎勞”“虛勞”“關格”等命名[14]。中醫學認為,慢性腎臟病患者久病體虛,外邪入里,致心肝脾肺腎五臟俱虛是腎纖維化的始動因素,治療腎纖維化時倡導“以腎為主、五臟同調”大法,其內涵是腎為先天之本,在五臟中居于中心位置,誘發其病的根本在于腎氣的氣化功能失常,治腎求本關鍵在于補益腎氣,但五臟之間又是相互為用的,與咽肺、心肝、脾胃、三焦、衛氣營血關系密切,將治腎理論與治腎方法有機結合,確立了益腎泄濁方,具有五臟同調、標本兼顧、暢絡泄濁之意。臨床研究發現益腎泄濁方能明顯緩解患者乏力、腰困等癥狀,且該方用大黃炭可通過增加大便的次數,使體內的毒素排出體外,進而降低CRF早期血清中SCr、BUN的水平[15]。本研究表明,該方能顯著降低腎纖維化大鼠血清和尿液中SCr、BUN、24 h UTP、24 h mAlb水平,其降低程度與藥物濃度呈正相關性,并能改善大鼠腎臟纖維化程度,且該方可減少腎小管炎性細胞浸潤,抑制腎小球硬化進展,表明益腎泄濁方可延緩抑制大鼠腎纖維化的進展,進而對腎臟具有更好的保護作用。

Wnt/β-catenin在腎纖維化進展中是極其重要的信號傳導通路[16],腎纖維化通常呈不均一的局灶性分布,在炎癥、代謝紊亂、微血管功能障礙局部組織微環境相互作用下,受損的腎臟固有細胞、免疫細胞釋放的炎癥因子、生長因子,促進上皮細胞向間充質細胞轉化形成的肌纖維細胞外基質過量的產生,在腎間質積聚、腎基底膜沉積、腎臟組織結構破壞,是形成腎臟纖維化的關鍵環節,目前Wnt/β-catenin信號通路是調節抑制EMT的關鍵通路[17],本研究免疫組化顯示,腎纖維化與Wnt1、β-catenin蛋白表達量呈正相關,益腎泄濁方改善腎纖維化的作用機制是通過降低腎組織中Wnt1、β-catenin蛋白表達,來抑制Wnt/β-catenin信號通路的異常激活,進而減緩腎纖維化的進展,從而起到保護腎臟的作用,且減緩腎纖維化的程度與益腎泄濁方的藥物濃度呈正相關,進而體現中醫藥具有“多成分-多靶點-多層次”的整體作用機制的特點。

相比較對腎纖維化其他通路蛋白的研究(如TGF-β1蛋白、Klotho蛋白)[10,18],Wnt/β-catenin信號通路的研究成果相對較少,且在通過調節Wnt/β-catenin信號通路改善腎纖維化的研究中,對Wnt4研究較多,對Wnt1的研究不深入,而本研究益腎泄濁方干預Wnt1、β-catenin蛋白表達進而抑制腎臟纖維化正是對其探索的延續。本研究局限性在于只研究了益腎泄濁方可降低腎組織中Wnt1/β-catenin通路的蛋白表達量,而未研究是否通過調控Wnt1/β-catenin信號通路,進而調控其他通路(如Klotho mRNA/TGF-β1)表達來抑制腎纖維化的進展。今后研究將Wnt1/β-catenin信號通路與其他通路(如Klotho mRNA/TGF-β1)信號通路相結合來探討CRF早期腎纖維化的發病機制,為進一步防治該疾病提供更有力的依據。