川崎病小鼠模型的超聲心動圖評估

張雪梅,郝 睿,焦富勇,婁 萍,張 丹,趙 欣,曹 玲,趙 穎,王俊香

(1陜西省人民醫院超聲診斷中心,西安 710068;2西安市第九醫院超聲醫學科;3陜西省人民醫院兒童病院兒科;*通訊作者,E-mail：994641857@qq.com)

川崎病(Kawasaki disease, KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征,是一種病因尚未明確的以變態反應性急性全身小血管炎為主的免疫系統疾病,好發于5歲以下嬰幼兒[1],可嚴重危害患兒心血管系統,最易累及冠狀動脈導致冠狀動脈擴張和冠狀動脈瘤[2],已經成為發達國家兒童后天獲得性心臟疾病的第一位基礎疾病[3]。患兒發病后,如果不及時有效地治療,則極易引發其出現心血管疾病,甚至嚴重的可導致其死亡[4]。據相關研究報道患有KD的兒童心血管后遺癥可延續到成年[5],因此早期診斷具有重要意義。但KD的發病機制及發病誘因雖然被廣泛研究,但至今尚不明確,臨床上尚無特異性檢查標準用以診斷該疾病。目前冠狀動脈病變組織樣本取材困難,且缺少公認可靠的川崎病動物模型用于血管炎性損傷和冠狀動脈瘤形成的發生機制研究。基于此符合臨床特征的KD小鼠動物模型的建立有助于進一步研究其發病機制,預防嚴重并發癥,為臨床診療方法提供重要的實驗依據。因此,本研究擬以干酪乳桿菌細胞壁成分(lactobacillus casei cell wall extract,LCWE)誘導小鼠KD模型為研究對象,利用高頻小動物心臟超聲儀,觀察誘導下小鼠冠狀動脈損傷及心功能的動態變化,評估高頻小動物超聲在小鼠KD疾病模型的診斷價值,為KD小鼠模型的制備及其功能評價提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物選擇 隨機選取BALB/c小鼠50只,體質量(17.0±0.5)g,無特定病原體,購自北京維頓利華實驗動物技術有限公司,生產許可證：SCXK(北京)2016-0006,銷售許可證：SYXK(陜西)2012-005。

1.1.2 主要試劑與儀器 乳酸菌肉湯培養基(杭州百思特生物技術有限公司);核糖核酸酶(RNAse)、脫氧核糖核酸酶(DNAse)、胰蛋白酶(Trypsin)、十二烷基硫酸鈉(SDS),均從北京索萊寶科技有限公司購買;高分辨小動物超聲儀(加拿大VISUALSONIC公司Vevo3100型),寬頻探頭(Mx400單晶片機械扇掃),聚焦深度為1.2 cm。光學電子顯微鏡(德國蔡司Zeiss Axio lab.A1);10%的甲醛溶液(天津市天力化學試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 干酪乳桿菌細胞壁提取物(LCWE)的制備 首先提取LCWE,將干酪乳酸桿菌菌種(貝納細胞生物保存管理中心,第134415號)常規在乳酸菌肉湯培養基中培養24 h,收集處于對數生長期的細菌,加入4% SDS(Sigma公司,美國)裂解,以4 000 r/min離心30 min(離心半徑8 cm),反復用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗,續貫的加入250 μg/mL RNA酶、DNA酶和胰蛋白酶,分別置于37 ℃培養箱中培養4 h,用PBS洗滌并離心后收集細菌碎片,以1 g濕重加入5 mL PBS,置于冰浴中進行超聲細胞破碎儀裂解2 h(超聲5 s,間隙5 s,功率300 W),將處理后的溶液低溫高速離心機4 ℃ 15 600 r/min離心1 h(離心半徑8 cm),收集上清即LCWE的終液。

1.2.2 KD小鼠模型的建立和實驗分組 小鼠編號后,將50只小鼠隨機分為模型組30只和對照組20只,模型組小鼠經腹腔注射LCWE的終液,單次注射0.5 mL;對照組小鼠同期不做任何處理。

1.2.3 小鼠心臟高分辨超聲心動圖檢測 將小鼠用脫毛膏去除胸前被毛,分別于造模后第15,21,30天放入密封盒中,并吸入異氟烷麻醉氣體后,待小鼠麻醉完成,將小鼠仰臥位固定在檢查臺上,同步記錄小鼠心率和呼吸。當小鼠心率保持在400～500次/min時,用超聲耦合劑涂抹于胸口,將高頻超聲探頭固定在檢查支架上進行超聲檢查。通過調節檢查支架的角度和探頭方向,進行超聲測量,選取小鼠胸骨旁左心室長軸、主動脈短軸及左心室短軸等切面進行檢查,觀察左、右冠狀動脈內徑、內膜、管壁及厚度、回聲、有無血栓、冠狀動脈瘤等情況,測量和記錄舒張末期左、右冠狀動脈主干內徑。采用M超記錄小鼠左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)和左心室收縮末期內徑(left ventricular end- systolic diameter,LVESD),并計算左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)及左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shor-tening,LVFS),選取5個連續心動周期,提取超聲參數并儲存于后臺。

1.2.4 病理檢查 對照組及造模后第15,21,30天模型組分別處死1只小鼠并取出心臟標本,立即置于體積分數為10%的甲醛溶液固定。常規脫水、透明、石蠟包埋、4 μm連續切片,蘇木素-伊紅(HE)染色及彈力纖維染色(EVG),使用光學電子顯微鏡進行組織學形態觀察。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況比較

模型組小鼠單次腹腔注射LCWE 12 h后,小鼠皮毛雜亂,無光澤,進食量和進水量均明顯減少。對照組小鼠無上述類似表現。

2.2 超聲心動圖檢查結果

對照組小鼠造模后15,21,30 d超聲心動圖顯示冠狀動脈血管壁無明顯變化,呈纖細線狀回聲,回聲強度低于主動脈根部;冠狀動脈血管內緣光滑,管壁外緣與周圍鄰近組織分界清楚,未見冠狀動脈瘤樣擴張改變。模型組小鼠超聲心動圖觀察到造模后15 d冠狀動脈管壁內膜模糊、毛糙,動脈管壁及其周圍鄰近組織回聲不清晰,出現明顯高回聲;造模后21 d冠狀動脈管壁及其周圍回聲較造模后15 d增強,部分血管外緣呈片狀回聲增強且與周圍回聲不清,血管壁內膜明顯毛糙,部分管腔形態不規則;造模后30 d冠狀動脈管壁及其周圍組織回聲仍增強,部分存在冠狀動脈管壁彌漫性增厚,血管壁內膜明顯毛糙,管腔不規則,官腔狹窄(見圖1)。

注：A.造模后15 d模型組小鼠表現為左冠狀動脈血管內膜模糊;B.造模后21 d模型組小鼠表現為左冠狀動脈管壁和管壁周圍回聲增強;C.造模后30 d模型組小鼠表現為左冠狀動脈管壁和管壁周圍仍有回聲增強,管壁彌漫性增厚,管腔狹窄;D.造模后15 d模型組右冠狀動脈血管內膜明顯模糊、毛糙;E.造模后21 d模型組右冠狀動脈管壁和管壁周圍回聲增強,部分呈冠狀動脈瘤樣擴張改變;F.造模后30 d模型組右冠狀動脈管壁和管壁周圍仍有回聲增強,管壁彌漫性增厚,管腔狹窄。圖1 模型組左、右冠狀動脈的超聲心動圖Figure 1 Echocardiogram of left and right coronary artery in model group

2.3 冠狀動脈內徑值

對照組超聲心動圖顯示冠狀動脈形態正常,3個時間節點冠狀內徑無明顯差異(見表1)。造模后21 d,模型組雙側冠狀動脈內徑明顯大于對照組(均P<0.05);造模后15,30 d,左右冠狀動脈內徑與對照組比較差異均無統計學意義(均P<0.05,見表1)。

表1 造模后不同時點兩組小鼠冠狀動脈內徑值比較

2.4 左心功能指標

造模后15 d模型組小鼠LVEDD、LVESD、LVEF及LVFS低于對照組(P<0.05);造模后21 d模型組小鼠LVEF及LVFS低于對照組(P<0.05);造模后30 d模型組小鼠LVEDD、LVEF及LVFS低于對照組(P<0.05,見表2)。

表2 造模后不同時點模型組與對照組心臟功能比較

2.5 病理檢查結果

對照組小鼠心臟組織結構正常,間質無充血、出血及炎細胞浸潤,肌壁間小型冠狀動脈結構清楚,管壁無增厚,官腔無狹窄,腔內無血栓形成,內膜完整光滑無增厚,平滑肌細胞排列整齊,彈性纖維無斷裂(見圖2A)。模型組造模后15 d,小鼠心外膜間質水腫,可見少量淋巴細胞浸潤及纖維結締組織彌漫輕度增生,局部心肌纖維結締組織增生并伴有固體鈣鹽沉著,其內的右冠狀動脈管腔擴張及少量心肌細胞壞死崩解(見圖2B);造模后21 d,小鼠心外膜局部可見多量淋巴細胞、嗜酸粒細胞、單核細胞浸潤為主(見圖2C);造模后30 d小鼠右冠狀動脈管壁增厚,彈力纖維不連續,內膜輕度增厚,局部玻變,周圍少數淋巴細胞浸潤及纖維結締組織增生,心外膜血管擴張,間質水腫,可見淋巴細胞浸潤及纖維結締組織彌漫輕度增生(見圖2D)。

A.對照組 B.造模后15 d C.造模后21 d D.造模后30 d圖2 對照組及模型組小鼠的心臟組織病理結果Figure 2 Pathological changes of heart tissue in control group and model group

3 討論

KD發病機制及其病因目前尚不完全清楚,有研究認為川崎病是由免疫介導的,并由遺傳易感因素與多種感染因子相互作用引起動脈炎癥反應的結果[6]。由于患兒情況特殊,因此病理標本采集較為困難。近年來,國內外學者采用多種誘導劑構建KD動物模型[7],對深入研究KD的發病機制,發病誘因及治療具有重大意義。到目前為止,許多研究者采用鼠、幼豬、幼兔和犬等動物模型研究KD血管病理改變引起的冠狀動脈炎,但由于小鼠成本低,取材方便,所以目前國內外大多研究選擇用小鼠構建模型,用于科研實驗。干酪乳桿菌是定植在人類和哺乳動物腸道內的革蘭陽性益生菌,不會導致致病作用。早在1983年,Lehman等[8]首次利用超聲破碎法提取出LCWE,并將其單次腹腔注射于C57BL/6小鼠體內,成功誘導小鼠冠狀動脈炎模型。隨后,Noval Rivas等[9]通過多次實驗該模型,結果表明LCWE誘導模型特征概括為炎性細胞浸潤冠狀動脈,冠狀動脈中壞死性動脈炎,冠狀動脈部分或完全阻塞等3個病理過程。LCWE誘導模型也可模擬KD冠狀動脈狹窄,其特征是冠狀動脈狹窄、嚴重的冠狀動脈炎和彈性蛋白降解,且動脈腔內肌成纖維細胞增殖在冠狀動脈狹窄的形成過程中至關重要[10],這與伴有冠狀動脈瘤的KD患兒的組織學特征相似[11,12],因此我們可以得出小鼠模型是一種可靠反映KD冠狀動脈炎的良好動物模型。

KD冠脈損傷是個動態演變的過程,但對于KD小鼠模型既往研究更多側重于病理學方面,關于超聲心動圖或兩者相關性的研究很少。目前判斷小鼠KD模型是否成功主要通過病理檢測結果,這種方法因為有創且不能重復、連續、動態地觀察模型小鼠的冠脈損傷變化,因而對KD的進一步深入研究存在一定制約。超聲成像因其安全、可重復、便捷等優點是KD評價的重要檢查工具,可早期評估心臟功能,觀察冠狀動脈內徑變化,成為臨床上診斷和評估KD的首選方法,具有重大的臨床價值[13,14]。超聲成像因為空間分辨率和探查深度呈反比,在鼠類等小動物實驗中成像質量上較為清楚,不受掃描深度的影響,因此可用高分辨率超聲連續、反復、直觀地觀察小動物的心血管系統,并進一步監測冠脈內徑、心臟的大小、心室壁的厚度、室壁運動、血流速度及瓣膜活動度等一系列反映心臟結構和功能變化的指標。本研究通過單次腹腔注射LCWE建立了炎癥KD小鼠模型,并利用高頻小動物超聲心動圖動態、全面觀測及評價各階段小鼠冠狀動脈損傷情況,所有小鼠均可觀察到清晰的冠狀動脈圖像,為評估KD小鼠模型冠狀動脈損傷變化提供了有效的臨床檢查方法。

KD損害冠狀動脈初期時多表現為起始處冠狀動脈擴張,內膜增厚增強且管壁不光滑;急性期時超聲改變為內徑增大,伴管壁增厚毛糙,內膜回聲不均勻增強;亞急性期時,動脈血管炎發生,形成動脈瘤及血栓阻塞,超聲改變主要為形成較大的梭形、串珠形邊界清楚的無回聲暗區,冠狀動脈內膜毛糙增厚,呈波浪樣改變,暗區內可見有強或低回聲的血栓形成。

本研究結果顯示,腹腔注射LCWE后15 d,KD模型組小鼠冠狀動脈主干內徑與正常對照組比較無明顯變化,冠狀動脈管壁和管壁周圍回聲增強;LCWE注射后21 d其冠狀動脈主干內徑較正常對照組明顯增寬,并呈內徑增加的趨勢,管壁內膜明顯毛糙,管腔不規則;造模后30 d,KD模型組小鼠冠狀動脈主干內徑較前縮小,部分出現冠狀動脈管壁彌漫性增厚。這一結果與臨床KD患兒冠狀動脈損傷的發病特點十分相似,說明該模型可成功模擬KD對冠狀動脈血管及心臟功能的損傷作用,模型制備成功。通過高分辨小動物超聲M型功能分析檢測造模后15 d,模型組較對照組左室縮短率(FS)和射血分數(EF)顯著減低,病理檢查結果顯示小鼠心外膜間質水腫,可見少量淋巴細胞浸潤及纖維結締組織彌漫輕度增生,說明該階段模型組小鼠心臟已符合KD心肌炎表現。

綜上所述,利用LCWE誘導KD小鼠建立模型,并通過高頻小動物超聲動態觀察該模型小鼠冠狀動脈及心功能變化,模擬KD對冠脈損傷的情況及對心臟功能的影響具有可行性[15]。同時,本研究結果證實了造模后小鼠冠狀動脈的損傷及心臟功能變化的特征與患兒病程情況基本相似,可以很好地模擬KD心臟的變化,可以為KD的治療、預防提供理論基礎。