副溶血性弧菌引起食源性疾病暴發事件調查與病原特征分析

李 榮,陳家良,王 洋,楊紅霞*,商永超,孫珊珊,張文軍

(1山西省陽泉市疾病預防控制中心疾病檢驗科,陽泉 045000;2中國疾病預防控制中心;3山西省疾病預防控制中心;*通訊作者,E-mail：bevy119@126.com)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是一種革蘭陰性嗜鹽菌,廣泛存在于海水和海產品中,能夠導致急性胃腸炎甚至敗血癥等,是一種重要的食源性病原菌[1]。陽泉地區近年來檢測出的副溶血性弧菌株,主要來自于食品中的貝類和魚類。近些年來,我國流行菌株的優勢血清型多為O3：K6、O4：KUT等[2-5],多數攜帶毒力基因tdh。自2020年以來,我國開始出現O10：K4血清型菌株,并在全國流行并成為優勢血清型[6]。本文針對副溶血性弧菌引起食源性暴發事件進行流行病學及病原特征分析,分析暴發時間、發生場所及發生事件原因,找出關鍵防控點,為食源性疾病的防控和臨床用藥提供可靠的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 2022年8月13日接到陽泉市郊區疾病預防控制中心報告,轄區醫院從8月13日5∶00—6∶00時,陸續接診25例有腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐等消化道癥狀的患者,患者均為P煤業公司職工,發病前均在該公司食堂進餐,患者臨床檢查提示為細菌性感染,初步懷疑為一起食源性疾病暴發事件。

1.1.2 實驗室培養基與試劑 磺胺增菌液、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、木糖賴氨酸脫氧膽鹽培養基、哥倫比亞培養基、麥康凱瓊脂培養基均購自北京路橋技術股份有限公司,沙門氏菌顯色培養基、弧菌顯色培養基均購自上海欣中生物工程有限公司,梅里埃API20E腸桿菌科鑒定試劑盒、微量生化鑒定管均購自北京路橋技術股份有限公司,副溶血性弧菌tlh/tdh/trh基因核酸檢測試劑盒、細菌核酸提取試劑盒均購自江蘇碩世生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流行病學調查 病例均為P煤業公司職工,發病前均在大食堂就餐。發病人群年齡最大59歲,最小25歲;男性24例(廚師1例),女性1例。

1.2.2 食品加工環節衛生調查 通過食品衛生學調查,發現消毒不到位,部分餐具未在保潔柜內存放,冷藏柜內生熟食品混放。切配食材用案板3塊,生熟不分,且靠近清洗池。

1.2.3 樣本采集和實驗室檢測 現場采集6份食品樣品、4份飲用水樣品、8份環境樣品、25份患者便標本,結合病例的臨床表現和流行病學特征,根據《食品安全事故流行病學調查技術指南》(2012年版)、《2022年國家食品污染物和有害因素風險監測工作手冊》和《2022年國家食源性疾病監測工作手冊》,確定檢測項目為：沙門氏菌、志賀氏菌、致瀉大腸桿菌、副溶血性弧菌和變形桿菌。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析 按照副溶血性弧菌PFGE分子分型的快速標準實驗室規程,步驟如下：副溶血性弧菌在哥倫比亞平板上培養,制備菌懸液濃度為4.5麥氏單位以及包埋膠塊,細胞用蛋白酶進行裂解,清洗膠塊,膠塊內的DNA使用NotⅠ限制性內切酶進行酶切,首選內切酶NotⅠ的電泳參數為脈沖時間10～35 s,電泳時間19 h,膠塊進行染色30 min,Gel Doc2000凝膠成像儀讀取電泳圖譜,BN軟件對PFGE圖譜進行分析校準。

1.2.5 基因組測序和分析 使用細菌全基因組核酸提取試劑盒(江蘇碩世生物科技股份有限公司)提取分離菌株的DNA進行細菌全基因組測序。使用二代測序質量控制軟件FastQC和生信軟件Trimmomatic(測序數據質控)對下機原始數據進行質量評估,使用軟件SPAdes(基因組組裝軟件)、GapFiller(基因組組裝軟件)和ArrayVision(基因芯片綜合分析軟件)對質控后的數據進行拼接和序列矯正。用BLAST將拼接好的序列與病原菌的毒性因子(virulence factors of pathogenic bacteria,VFDB)數據庫和綜合抗生素抗藥性數據庫(the comprehensive antibio-tic resistance database,CARD)進行比對得到耐藥基因和毒力因子的注釋結果。用快速全基因組相似度估計軟件FastANI比對序列間的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI),使用二代重測序數據分析的一款軟件GATK檢測變異位點,使用基于最大似然法構建進化樹的軟件FastTree構建基于核心基因SNP的系統發育樹。

2 結果

2.1 流行病學調查結果

25例患者的主要表現為腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐,臨床癥狀和體征分布見表1。

首發病例于2022年8月12日22∶00發病,末例病例于8月13日8∶00發病。中位發病時間為8月13日2∶00,隨后病例逐漸下降。流行病學曲線顯示為點源暴露模式,發病時間自8月13日0∶00起快速進入高峰期,持續到8∶00明顯下降,首末病例發病時間間隔10 h,發病高峰期持續8 h(見圖1)。副溶血性弧菌引起的食物中毒潛伏期為2～40 h,多為14～20 h,25例患者全部進食午餐,結合發病曲線為單峰點源暴露模式,推斷可疑餐次為12日午餐。發病者潛伏期最短10 h,最長20 h,首末病例發病時間間隔10 h。

圖1 P煤業公司發生的一起食源性疾病暴發事件病例發病時間分布Figure 1 Onset time distribution of a food-borne disease outbreak in P Coal Company

2.2 實驗室培養結果

現場采集的6份食品樣品、4份飲用水樣品、8份環境樣品中未檢出可疑菌落,25份患者便標本中檢測出11株副溶血性弧菌。

2.3 生化鑒定結果

病例檢測出的11株可疑菌群經初步生化檢驗氧化酶、葡萄糖、甘露醇、賴氨酸脫羧酶反應為陽性,蔗糖、乳糖、硫化氫反應為陰性。嗜鹽性試驗：副溶血性弧菌在0%和10%氯化鈉胰胨水中不生長或微弱生長,在6%和8%氯化鈉胰胨水中生長旺盛,符合副溶血性弧菌生化反應特點。

2.4 毒力基因檢測結果

8株副溶血性弧菌分離株毒力基因為tlh和tdh,1株副溶血性弧菌分離株毒力基因為tlh、trh和tdh,1株副溶血性弧菌分離株毒力基因為tlh和trh,1株副溶血性弧菌分離株毒力基因為tlh。

2.5 脈沖場凝膠電泳檢測結果

檢測11株副溶血性弧菌菌株得到了11條脈沖場指紋圖譜,將副溶血性弧菌NotⅠ酶切電泳圖像導入BN軟件,構建系統發生樹,進行聚類分析,分析的結果顯示：11株副溶血性弧菌共形成5個分支,菌株之間的指紋圖譜相似度在64.06%～92.00%之間(見圖2)。

圖2 11株副溶血性弧菌PFGE分型圖譜聚類分析Figure 2 Cluster analysis of PFGE genotypes of 11 strains of Vibrio parahaemolyticus

2.6 藥敏實驗結果

藥敏結果顯示11株副溶血性弧菌對氯霉素、萘啶酸、四環素、美羅培南、氨芐西林、阿米卡星、厄他培南、替加環素、頭孢噻肟、頭孢他啶和環丙沙星均敏感,對多黏菌素E中度敏感,均無耐藥表型。

2.7 菌株基因組測序分析結果

對11株副溶血性弧菌核心基因組構建系統發育樹,結果顯示除編號SX22YQ0377、SX22YQ0378、SX22YQ0379外,其余菌株聚集成簇(SNP<3,見圖3)。使用resfinder數據庫鑒定耐藥基因,11株菌均只含有blaCARB耐藥基因,且未檢測到耐藥質粒。使用副溶血性弧菌血清型數據庫共鑒定到3種血清型即O10：K4、O4：K63和O5：unknown(見表2)。

圖3 副溶血性弧菌系統發育樹Figure 3 Phylogenetic tree of Vibrio parahaemolyticus

表2 11株副溶血性弧菌基因組特征

3 討論

副溶血性弧菌食物中毒事件均發生在夏季7—9月,原因為炎熱夏季海產品儲運過程無法保持低溫致使副溶血性弧菌污染食堂環境,疾控檢驗難以第一時間進入食物中毒食堂場所,而行政部門已經先期通知食堂等待接受檢驗,事發食堂第一時間已經處理食堂環境致使環境檢驗往往效果不佳。雖然實驗室未在海鮮凍品檢出副溶血性弧菌,但不能排除海產品在冷凍儲存前的交叉性污染。不論其用于生食或熟食,都可能通過案板、刀或廚師的手在廚房中造成交叉污染,這是不容小覷的食物中毒的源頭,所以我們要特別注意海鮮產品的表面污染問題。本次食源性中毒事件中,25例患者分離出11株分離菌株。現場采集6份食品樣品,采集的是冰柜中的凍存海鮮和患者食用的食品樣品,副溶血性弧菌不適于低溫生存,在低溫情況下易死亡,低溫條件下容易進入不可培養狀態,難以保藏。飲用水和環境未檢出副溶血性弧菌,可見飲用水未被副溶血性弧菌污染。環境樣品采集時,環境已經進行消毒清潔處理,未能檢測到可疑菌落。流行病學監測45人在食堂進食,其中有25人出現臨床腹瀉癥狀,采集標本,檢測出11株副溶血性弧菌。該食堂儲存食物時生熟不分,副溶血性弧菌機會性繁殖在合適的含鹽食物中也可以增殖,進而引起該起事件發生。依據病例的臨床癥狀、現場流行病學和衛生學調查以及實驗室檢測結果,參照《2022年國家食源性疾病監測工作手冊》、《2022年國家食品污染物和有害因素風險監測工作手冊》和《副溶血性弧菌食物中毒診斷標準及處理原則》[7],綜合分析該事件為一起由多種血清型副溶血性弧菌污染了食品而導致的食源性疾病暴發事件。

本事件中,PFGE聚類圖譜分析相似性,在92%～100%之間,定義為親緣關系較為相近的聚類,條帶完全相同的菌株為同一帶型,條帶之間差異較為大的為不同帶型。檢測菌株的條帶相近系數在83%～92%。SX22YQ0377和SX22YQ0379之間條帶相似為89.47%,SX22YQ0378和SX22YQ0376之間條帶相似為83.45%,剩余7株菌株之間相似度為92%。11株副溶血性弧菌分為5種帶型,有明顯的多態性,說明菌株進化來源于不同的克隆系別。各個菌株本身也存在不同程度的變異,說明在菌株進化過程中受到環境、溫度等一系列外部環境的影響,引起了基因的變異。這些突變在進行脈沖場凝膠電泳(PFGE)時表現出來,從而形成了不同的條帶。還有可能是冰柜中存放多種類型海鮮,攜帶的副溶血性弧菌型別不同。25例患者分離出的11株分離菌株血清型為O10：K4、O4：K63、O5：unknown,SX22YQ0377的血清型為O10：K4,SX22YQ0379的血清型為O5：unknown,由此可以判斷副溶血性弧菌血清學分型和PFGE之間沒有特殊相關性,即不同血清型的菌株也可以聚集成簇,且帶型一致或相似度很高。菌株基因組測序結果顯示9株菌株聚集成簇(SNP<3),SX22YQ0377的血清型與聚集成簇的菌株血清型均為O10：K4,并含有blaCARB-22耐藥基因,可以判斷副溶血性弧菌血清學分型和耐藥基因與基因組測序之間無特殊相關性,即相同血清型的菌株以及存在相同的耐藥基因不會聚集成簇。菌株的毒力基因結果顯示毒力基因和基因組測序之間有著特殊的相關性,攜帶相同毒力基因菌株核心基因組構建系統發育樹可以聚集成簇,并具有相同的ST型,屬于同一克隆群,并且其毒力、耐藥基因和藥敏表型相同。

全基因組測序技術可以獲得菌株中的所有遺傳信息,結合生物信息技術和數據庫的比對,可以快速準確地完成溯源分析[8]。兩種檢測技術結合流行病學調查,在食源性疾病暴發流行的過程中,可以起到鑒定、分析、預警等作用。有必要加大執法力度,加強對餐飲行業的衛生監督管理,同時進行食品衛生宣傳教育,杜絕一些安全隱患,最大限度地減少食物中毒的發生[9]。