HPLC法同時測定杠板歸不同部位中5種成分的含量

胡冬青,閻兆君

(1山東中醫藥大學附屬醫院消化科,濟南 250014;2山東中醫藥大學附屬醫院身心醫學科;*通訊作者,E-mail：yzj7790@163.com)

杠板歸為蓼科植物杠板歸PolygonumperfoliatumL.的干燥地上部分,別名蛇倒退、老虎脷、犁頭刺,收載于2020年版《中國藥典》[1],性寒,味酸,歸肺經、膀胱經。一般在夏季開花時采割,曬干后全草入藥。杠板歸具有清熱解毒、利水消腫、止咳之功效,用于治療咽喉腫痛、肺熱咳嗽、小兒頓咳、水腫尿少、濕熱瀉痢、蛇蟲咬傷等[2],在民間還常用于感冒發熱、疔瘡癰腫、蛇蟲咬傷、跌仆腫痛等[3]。在我國各地均有分布,是一味資源豐富且集食、飼、藥用于一身的常用中藥[4]?，F代研究表明,杠板歸具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理作用[5,6],含有黃酮、苯丙素、有機酸、生物堿等多種化學成分[7]。目前,對于杠板歸有效成分的含量測定研究相對較少,僅有少數學者對其進行了薄層色譜定性鑒別和HPLC含量測定研究[8,9],且研究主要集中在全草或炮制品[10],對其不同部位的有效成分含量測定和比較研究較少,深入開展杠板歸不同部位中有效成分的含量測定研究,對進一步開發利用杠板歸資源具有重要意義。因此,本研究以綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素為指標成分,建立杠板歸不同部位(莖、葉、根)中5種成分的HPLC含量測定方法,初步闡明杠板歸不同部位之間有效成分的含量差異,以期為杠板歸的臨床應用、質量控制和資源開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀(含PAD檢測器,Empower工作站,美國Waters公司);Luna?-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱(廣州潤知生物科技有限公司);CPA225D型十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);KQ-500DE型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品綠原酸(批號110735-200806,純度99.3%,中國藥品生物制品檢定所)、咖啡酸(批號2110809-201205,純度98.9%,中國藥品生物制品檢定所)、蘆丁(批號100080-200708,純度99.6%,中國食品藥品檢定研究院)、阿魏酸(批號C12085951,純度98.8%,上海麥克林生化科技有限公司)、槲皮素(批號100081-201608,純度99.2%,中國食品藥品檢定研究院)。磷酸、乙腈均為色譜純(美國ThermoFisher公司);其他試劑均為分析純。杠板歸及其不同部位莖、葉、根(批號20220713,產地為江西)購自江西上饒澤信堂藥店。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 以Luna?-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱;乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動相,梯度洗脫(0～12 min,5%→20%A;12～26 min,20%→30%A;26～40 min,30%→42%A)。流速為1.0 mL/min,檢測波長320 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素對照品適量,加甲醇超聲溶解,得綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素質量濃度分別為4.6,21.2,5.5,8.4,11.4 μg/mL的混合對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取杠板歸莖、葉、根各1.0 g,精密稱定,置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入60%甲醇25 mL,精密稱定,超聲處理30 min,放冷至室溫,精密稱定并用60%甲醇補足減失質量,搖勻,過濾,經0.45 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得供試品溶液。

1.3.4 線性關系的考察 精密吸取1.3.2項下的混合對照品溶液0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 mL置于10 mL的容量瓶中,加入甲醇定容至刻度。按1.3.1項下的色譜條件進行進樣分析,以峰面積Y對進樣濃度X計算回歸方程。

1.3.5 精密度試驗 取1.3.2項下混合對照品溶液,按1.3.1項下的色譜條件連續進樣6次,記錄各成分峰面積,計算相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)。

1.3.6 重復性試驗 取杠板歸莖樣品6份,按1.3.3項下方法制備供試品溶液,按1.3.1項下的色譜條件進樣測定,記錄各成分峰面積,計算RSD。

1.3.7 穩定性試驗 取杠板歸莖供試品溶液,按1.3.1項下的色譜方法分別于0,2,4,8,12,24 h進樣分析,記錄各成分峰面積,計算RSD。

1.3.8 加樣回收率試驗 取杠板歸莖樣品6份,每份約0.5 g,加入等量的綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素對照品,按1.3.3項下方法制備供試品溶液,按1.3.1項下方法進樣分析,計算加樣回收率及RSD。

1.3.9 樣品含量測定 取杠板歸不同部位,按1.3.3項下方法制備供試品溶液,每批樣品均平行制備3份,按1.3.1項下色譜條件對其進行含量測定。

2 結果

2.1 專屬性試驗

取混合對照品溶液和杠板歸莖、葉、根供試品溶液,按照1.3.1項下色譜條件進樣檢測,結果顯示對照品與供試品溶液5種成分色譜峰保留時間一致,各色譜峰分離度良好,方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

注：1.綠原酸;2.咖啡酸;3.蘆丁;4.阿魏酸;5.槲皮素。圖1 對照品與供試品的色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance and samples

2.2 線性關系的考察

綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素分別在0.046～4.6 μg/mL,0.212～21.2 μg/mL,0.055～5.5 μg/mL,0.084～8.4 μg/mL,0.114～11.4 μg/mL的質量濃度范圍內與峰面積呈線性關系良好,相關系數、回歸方程及線性范圍見表1。

表1 5種被測成分的線性關系和線性范圍

2.3 精密度試驗

精密度試驗結果顯示,綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素峰面積的RSD分別為1.46%,0.96%,2.16%,1.45%,2.12%(見表2),表明儀器精密度良好。

表2 5種被測成分的精密度試驗結果

2.4 重復性試驗

由表3可知,綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素峰面積的RSD分別為1.42%,1.37%,2.05%,1.57%,1.12%,表明該方法重復性良好。

表3 5種被測成分的重復性試驗結果

2.5 穩定性試驗

由表4可知,綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素峰面積的RSD分別為1.26%,1.68%,1.95%,2.31%,1.25%,表明供試品溶液在24 h內穩定。

表4 5種被測成分的穩定性試驗結果

2.6 加樣回收率試驗

由表5可知,綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素的平均加樣回收率分別為99.78%,101.63%,102.09%,97.65%,99.26%;RSD分別為1.76%,2.44%,1.89%,2.28%,2.17%。

表5 加樣回收率試驗結果 (n=3)

2.7 樣品含量測定

由表6可知,杠板歸不同部位中5種成分含量差異較大,綠原酸和咖啡酸2個成分在葉中含量高,且遠遠高于根和莖中的含量;蘆丁和阿魏酸主要存在于莖和根中,葉中未檢測到;槲皮素在莖中含量最高,葉中次之,根中最低。

表6 不同部位中5種成分的含量測定結果 (n=3, mg/g)

3 討論

3.1 指標成分的選擇

杠板歸中主要含有蘆丁、槲皮素等黃酮類成分及綠原酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸類活性成分,2020年版《中國藥典》含量測定項下以槲皮素為質量控制指標成分?，F代研究表明,綠原酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸類具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、提高免疫力等多種活性,是多種藥用植物的質控指標成分。因此,本試驗選擇綠原酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸、槲皮素5個成分進行含量測定研究。

3.2 色譜條件的考察

綠原酸、阿魏酸、咖啡酸等酚酸類成分呈弱酸性,蘆丁、槲皮素等黃酮類成分也含有酚羥基,測定該類成分時一般以酸水為流動相以改善分離度和峰型。本試驗對甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.4%磷酸水、乙腈-0.4%磷酸等流動相進行了比較,結果顯示,在以乙腈-0.1%磷酸為流動相的條件下,5種被測成分能夠完全分離且峰形較好。

3.3 不同部位成分差異分析

杠板歸通常是全草入藥,不同部位之間有效成分的含量可能存在差異。含量測定結果顯示,綠原酸和咖啡酸均在葉中含量高,遠遠高于根和莖中的含量;蘆丁和阿魏酸主要存在于莖和根中,葉中未檢測到;槲皮素在莖中含量最高,葉中次之,根中最低。

本試驗研究建立了簡便快捷、專屬性強、重現性好的HPLC法同時測定杠板歸不同部位中5種有效成分含量,并初步闡明了杠板歸不同部位之間有效成分的含量差異,為杠板歸藥材及其非藥用部位的資源開發和合理利用提供科學依據。