人參皂苷Rb1通過激活AMPK減輕大鼠創傷性骨關節炎

康飛科,孫 強,陳永鋒,漆 偉,王遠瑞

(空軍軍醫大學第一附屬醫院骨科,西安 710032;*通訊作者,E-mail：531890893@qq.com)

創傷后骨關節炎(post-traumatic osteoarthritis, PTOA)是骨關節炎(osteoarthritis, OA)的一種亞型,占所有OA病例的近12%[1],并且多發于年輕人[2]。可能導致PTOA的危險因素包括前十字韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)損傷、半月板撕裂、盂肱關節不穩定、髕骨脫位和踝關節不穩定[3]。在這些危險因素中,ACL損傷的發生率最高[4]。另外,許多ACL損傷膝蓋伴有半月板損傷[5]。目前,臨床中缺乏PTOA的有效治療方法。人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1,G-Rb1)是人參屬植物中富含的皂甙成分之一,具有多種活性[6-8]。現有文獻證明,G-Rb1可防止骨軟骨破壞[9],促進骨形成[10],預防股骨頭缺血性壞死[11]。另外,G-Rb1可以減輕OA大鼠的軟骨損傷和變性[12]。然而,目前尚不清楚G-Rb1治療PTOA的機制。AMP活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase, AMPK)是一種主要的能量傳感器,調節細胞能量平衡[13]。此外,AMPK激活通過抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路對軟骨細胞具有抗炎作用[14]。OA中炎癥細胞因子升高會導致軟骨細胞中AMPK去磷酸化和抑制[15]。目前,AMPK在軟骨細胞能量穩態和炎癥調節中的關鍵作用使其成為OA的潛在治療靶點[16]。多項文獻表明G-Rb1是AMPK的激活劑[17-19]。因此,本研究從AMPK活化的角度探討了G-Rb1對PTOA大鼠模型的治療作用,旨在揭示G-Rb1治療PTOA的效果和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

80只雄性SD大鼠(7～8周齡,270～330 g)由空軍軍醫大學第二附屬醫院骨科實驗室提供,大鼠在屏障環境(25 ℃、55%濕度、12 h光/12 h暗循環照明)中飼養。

1.2 實驗試劑

人參皂苷Rb1(貨號：WKQ-0000463,純度≥98%)購自四川省維克奇生物科技有限公司。AMPK抑制劑Compound C(貨號：HY-13418A,純度99.91%)購自美國MCE公司。白介素-1β(IL-1β)(貨號：SEKR-0002)、IL-6(貨號：SEKR-0005)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(貨號：SEKR-0009)ELISA試劑盒、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：G1120)、改良番紅O/固綠軟骨染色試劑盒(貨號：G1371)、TUNEL細胞凋亡試劑盒(綠色熒光)(貨號：T2196)均購自北京索萊寶科技有限公司。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(貨號：RR047A)、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(貨號：RR820A)購自日本TaKaRa公司。p-AMPKα(Thr172)(貨號：AF3423)、AMPKα(貨號：AF6423)和GAPDH(貨號：AF7021)一抗、IgG(H+L)HRP二抗(貨號：S0001)均購自美國Affinity公司。

1.3 PTOA大鼠建模

采用前十字韌帶切斷加半月板部分切除法建立PTOA大鼠模型[20]。大鼠經異氟醚吸入麻醉后仰臥固定于手術臺,髕骨外側做切口,暴露右膝關節腔,切斷前交叉韌帶并切除1/3內側半月板,然后縫合切口并消毒。

1.4 實驗分組和藥物處理

將大鼠分為假手術組、模型組、低、中、高劑量組和抑制劑組(每組12只)。假手術組大鼠切開髕骨外側皮膚后立即縫合傷口,其余4組均為PTOA模型大鼠。建模完成2 h后,假手術組和模型組大鼠灌胃2 mL生理鹽水。低、中、高劑量組大鼠分別灌胃2 mL濃度為10,20,40 mg/(kg·d)的G-Rb1溶液[21,22]。抑制劑組大鼠灌胃2 mL濃度為40 mg/(kg·d)的G-Rb1溶液,同時腹腔注射20 mg/(kg·d)的AMPK抑制劑Compound C[23]。各組大鼠均處理4周。

1.5 組織學染色檢測軟骨組織病理變化

給藥處理結束后,各組大鼠異氟醚吸入麻醉,采集大鼠腹主動脈血凍存備用,然后處死大鼠并分離大鼠膝關節和軟骨組織備用。采用4%多聚甲醛固定大鼠膝關節處理24 h,再用0.5 mol/L的EDTA溶液4 ℃下脫鈣處理2周,然后常規制作5 μm厚石蠟切片。59 ℃烘烤切片30 min,再經過脫蠟和水化處理后,按照試劑盒說明,采用HE染色評價關節軟骨形態;采用番紅O/固綠染色法評價關節軟骨退變,然后進行國際骨關節炎研究學會(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)評分(0～24分,分值越高,表明軟骨退變越嚴重)[24];采用TUNEL染色檢測軟骨細胞凋亡。

1.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清炎癥因子

已采集的各組大鼠腹主動脈血經過離心后收集上層血清,通過ELISA測定大鼠血清樣品中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.7 定量逆轉錄PCR(RT-qPCR)檢測軟骨組織中細胞凋亡、軟骨降解和骨形成相關基因的轉錄水平

表1 引物序列

1.8 蛋白質免疫印跡(Western blot)檢測軟骨組織中p-AMPKα(Thr172)和AMPKα的蛋白表達水平

使用RIPA提取軟骨總蛋白,BCA法進行蛋白定量,采用12% SDS-PAGE分離蛋白并轉移到PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,將膜與1∶1 000稀釋的p-AMPKα(Thr172)、AMPKα和GAPDH(內參蛋白)一抗于4 ℃孵育過夜。然后將膜與1∶1 000稀釋的IgG(H+L)HRP二抗室溫孵育2 h。ECL顯影。ImageJ軟件定量條帶灰度值,結果表示為p-AMPKα與AMPKα蛋白條帶灰度值的比值。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 G-Rb1對PTOA大鼠軟骨形態和軟骨退變的影響

HE染色和番紅O/固綠染色顯示,假手術組大鼠膝關節軟骨正常;模型組大鼠軟骨層變薄,表面粗糙不光滑,軟骨細胞數量減少,細胞核固縮、壞死,番紅O染色淺;與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠的軟骨形態呈G-Rb1劑量依賴性明顯改善,番紅O染色加深;與高劑量組比較,抑制劑組大鼠的軟骨損傷加重,番紅O染色淺(見圖1)。與假手術組比較,模型組大鼠的OARSI評分升高(P<0.05)。與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠的OARSI評分降低(P<0.05)。與高劑量組比較,抑制劑組大鼠的OARSI評分升高(P<0.05,見圖1)。

注：與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與高劑量組比較,&P<0.05。圖1 G-Rb1對PTOA大鼠軟骨形態和軟骨退變的影響 (×400)Figure 1 Effects of G-Rb1 on cartilage morphology and cartilage degeneration in PTOA rats (×400)

2.2 G-Rb1對PTOA大鼠軟骨細胞凋亡的影響

與假手術組比較,模型組大鼠的軟骨細胞TUNEL陽性率和Bax mRNA相對表達量升高,Bcl-2 mRNA相對表達量降低(均P<0.05,見圖2)。與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠的軟骨細胞TUNEL陽性率和Bax mRNA相對表達量劑量依賴性降低,Bcl-2 mRNA相對表達量升高(均P<0.05,見圖2)。與高劑量組比較,抑制劑組大鼠的軟骨細胞TUNEL陽性率和Bax mRNA相對表達量升高,Bcl-2 mRNA相對表達量降低(均P<0.05,見圖2)。

2.3 G-Rb1對PTOA大鼠血清炎癥因子的影響

與假手術組比較,模型組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高(P<0.05);與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均劑量依賴性降低(P<0.05);與高劑量組比較,抑制劑組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高(均P<0.05,見表2)。

表2 G-Rb1對PTOA大鼠血清炎癥因子的影響 (pg/mL)

2.4 G-Rb1對PTOA大鼠軟骨基質降解的影響

與假手術組比較,模型組大鼠軟骨組織中Collagen Ⅱ mRNA相對表達量降低,MMP-13 mRNA相對表達量升高(均P<0.05,見圖3)。與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠軟骨組織中Collagen Ⅱ mRNA相對表達量均劑量依賴性升高,MMP-13 mRNA相對表達量均劑量依賴性降低(均P<0.05,見圖3)。與高劑量組比較,抑制劑組大鼠軟骨組織中Collagen Ⅱ mRNA相對表達量降低,MMP-13 mRNA相對表達量升高(均P<0.05,見圖3)。

注：與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與高劑量組比較,&P<0.05。圖3 G-Rb1對PTOA大鼠軟骨基質降解的影響Figure 3 Effect of G-Rb1 on the degradation of cartilage matrix in PTOA rats

2.5 G-Rb1對PTOA大鼠軟骨形成的影響

與假手術組比較,模型組大鼠軟骨組織中Runx2和BMP-2 mRNA相對表達量均降低(P<0.05);與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠軟骨組織中Runx2和BMP-2 mRNA相對表達量均劑量依賴性升高(P<0.05);與高劑量組比較,抑制劑組大鼠軟骨組織中Runx2和BMP-2 mRNA相對表達量均降低(均P<0.05,見圖4)。

注：與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與高劑量組比較,&P<0.05。圖4 G-Rb1對PTOA大鼠軟骨形成的影響Figure 4 Effect of G-Rb1 on chondrogenesis in PTOA rats

2.6 G-Rb1對PTOA大鼠軟骨AMPK磷酸化的影響

與假手術組比較,模型組大鼠軟骨中AMPKα相對磷酸化水平降低(P<0.05);與模型組比較,低、中和高劑量組大鼠軟骨中AMPKα相對磷酸化水平均劑量依賴性升高(P<0.05);與高劑量組比較,抑制劑組大鼠軟骨中AMPKα相對磷酸化水平降低(P<0.05,見圖5)。

3 討論

目前,文獻中討論最多的PTOA治療方法包括抗細胞因子和趨化因子治療(關節內注射IL-1Ra)[4]、抗再吸收治療(雙膦酸鹽和雷奈酸鍶等)[25]等。然而,臨床中仍缺乏有效的PTOA治療方法,因此,探索PTOA的新型療法具有重要意義。ACL和半月板損傷是導致PTOA的主要危險因素,ACL損傷后發生PTOA的發生率高達87%[4]。另外,許多ACL損傷膝蓋伴有半月板損傷[5],與單純ACL損傷的患者相比,半月板撕裂的患者更容易發生PTOA[26]。半月板損傷后會合成各種可溶性酶和炎癥介質以應對創傷,從而加速鄰近軟骨的降解[2]。因此,本研究采用ACL切斷加半月板部分切除法建立PTOA大鼠模型。目前,針對軟骨損傷和細胞凋亡的干預措施是治療PTOA的重點方向,幾乎一半的ACL損傷患者伴有股骨內側髁和外側髁的關節軟骨損傷[2]。機械沖擊會對關節軟骨造成嚴重損傷,引發軟骨細胞壞死和凋亡[27],同時也會導致軟骨細胞基質降解酶和炎癥細胞因子表達增加,進而導致軟骨細胞凋亡[3]。由于軟骨的愈合能力較差,關節軟骨表面的損傷可能直接導致PTOA的發生[4]。其他文獻報道,G-Rb1可下調兔膝關節凋亡標記物Caspase-3和Bax的表達,具有抗凋亡作用[9]。在本研究中,G-Rb1改善了PTOA大鼠軟骨形態,減輕了軟骨退變,并且抑制了軟骨細胞凋亡。表明G-Rb1可能通過抑制軟骨細胞凋亡減輕PTOA軟骨損傷。

在最初ACL創傷后,各種炎癥細胞因子大量產生會擾亂關節內的穩態,導致關節退化[2]。例如,IL-6和IL-17與IL-1β協同作用,加速軟骨細胞外基質(ECM)的降解。IL-1β、TNF-α和IL-6水平升高與潤滑素水平降低相關,潤滑素為關節軟骨提供抗粘連和軟骨保護特性,ACL損傷后滑液潤滑素的減少會增加ECM降解的風險[28]。據報道,G-Rb1在OA大鼠模型中也表現出了抗炎作用,可以降低IL-1β水平[12]。本研究觀察到G-Rb1降低了PTOA大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。推測,G-Rb1緩解PTOA進展的機制可能與其抗炎作用有關。

損傷過程中軟骨細胞基因表達的改變和各種降解酶(例如MMPs)的激活會導致進行性軟骨損失[3]。MMP水平升高會導致包括蛋白聚糖和膠原蛋白在內的關節ECM降解,并引發MMP進一步激活,從而形成正反饋循環[3]。選擇性抑制MMP會減少關節軟骨ECM的降解[2]。文獻報道,G-Rb1通過預防軟骨降解抑制絕經后大鼠單碘乙酸鹽誘導的OA[29]。G-Rb1可以降低OA大鼠MMP-13水平,減輕軟骨損傷和變性,并在體外抑制IL-1β誘導的軟骨細胞中MMP-13的表達[12]。本研究觀察到G-Rb1升高了PTOA大鼠軟骨Collagen Ⅱ基因轉錄水平,降低了MMP-13基因轉錄水平。因此,G-Rb1可能通過調節PTOA大鼠軟骨中Collagen Ⅱ和MMP-13的轉錄活性,進而抑制軟骨降解。此外,文獻報道,G-Rb1顯著上調股骨頭缺血性壞死大鼠Runx2和BMP-2蛋白的表達[11]。本研究觀察到G-Rb1升高了PTOA大鼠軟骨Runx2和BMP-2基因轉錄水平。因此,G-Rb1對PTOA的保護作用可能與促進軟骨形成有關。

已有研究證實異常的AMPK活性與OA有關[16]。在正常關節軟骨細胞中AMPKα表現為強磷酸化。然而,與正常組織相比,OA患者和動物模型的關節軟骨中時AMPKα的Thr172位點磷酸化顯著降低[30]。在用炎性細胞因子和機械損傷處理的軟骨細胞中,AMPK活性受到抑制,沉默軟骨細胞中的AMPK會加劇IL-1β和TNF-α的分解代謝反應[15]。這些數據表明AMPK活性對于維持軟骨穩態和軟骨細胞活性是不可或缺的。此外,激活AMPK可以減少炎癥并阻止OA進展。例如,選擇性AMPK激動劑AICAR顯著抑制軟骨細胞對炎癥細胞因子的分解代謝反應[15]。在體內,Li等[31]證明關節內注射二甲雙胍可改善內側半月板不穩定的小鼠膝關節破壞的嚴重程度,然而AMPKα基因缺失減弱了二甲雙胍對OA的保護作用。文獻報道G-Rb1是一種AMPK激活劑,G-Rb1通過激活AMPK途徑減少H2O2誘導的人臍靜脈血管內皮細胞功能障礙[32]。G-Rb1通過磷酸化AMPK改善糖尿病動脈硬化[33]。G-Rb1通過激活AMPK改善細胞自噬,從而提高缺氧心肌細胞的生存能力[34]。本研究觀察到G-Rb1升高了PTOA大鼠軟骨AMPKα磷酸化水平,激活了AMPK。這些結果提示G-Rb1減輕大鼠PTOA的作用機制與激活AMPK密切相關。此外,本研究使用G-Rb1和AMPK抑制劑Compound C同時處理PTOA大鼠,結果表明抑制AMPK的激活減弱了G-Rb1對PTOA大鼠的治療作用,表明G-Rb1通過激活AMPK減輕大鼠PTOA。

綜上所述,本研究表明G-Rb1通過激活AMPK減輕大鼠PTOA。G-Rb1是一種臨床治療PTOA的候選天然藥物,而AMPK是治療PTOA的潛在靶標。本研究有以下局限性：首先,雖然本研究明確了G-Rb1治療PTOA大鼠的效果,但是未與其他藥物做比較,無法確定G-Rb1在治療PTOA方面是否優于其他藥物。其次,本研究應用G-Rb1治療PTOA大鼠4周的療程中未發現明顯不良反應,但尚不清楚該藥物是否具有遠期毒副作用。最后,本研究是一項基于動物模型的實驗研究,G-Rb1治療PTOA的臨床效果還需進一步研究。因此,本課題組將在今后研究中進一步將G-Rb1與其他治療PTOA的常見藥物做療效比較,明確G-Rb1的臨床開發價值。另外,本課題組將進一步擴大研究周期,深入探討G-Rb1治療PTOA的有效性和安全性,為其臨床應用打下基礎。