大理牛街熱泉來源嗜熱纖維素酶基因的克隆、異源表達及其酶學性質研究

饒孟迪， 李文孟， 李 蕾， 普孝英， 阿周存， 尹以瑞

（大理大學農學與生物科學學院，云南 大理 671003）

纖維素酶是一類糖苷水解酶， 用于降解纖維素生成單糖或低聚糖，在生物乙醇、造紙、紡織、動物飼料、制藥、服裝等行業（鄧立康等，2022；陳燕勤等，2004）利用纖維素酶分解植物纖維素（陳偉釗，2018），是一種儲量較大的綠色可再生資源。在自然界中，許多生物都能產生纖維素酶，其中微生物來源的纖維素酶運用最為廣泛 （何芳芳等，2020）。 在實際生產中，纖維素的降解大多在高溫環境下進行， 因此對纖維素酶的熱穩定性要求較高。因此，挖掘新的嗜熱纖維素酶成為纖維素開發利用的研究熱點。 胡惠仁等（2020）以真菌里氏木霉來源的纖維素酶做發酵所用的酶， 以紙漿為發酵碳源，通過深層液體發酵的方式，來降低打漿能耗，在造紙行業起到了促進作用。

然而，由于真菌來源的酶熱穩定性較差，溫度超過55 ℃時迅速失活，限制了其應用范圍（Tenkanen 等，1992）。 嗜熱纖維素酶因能在高溫下長時間保持較高活性而備受關注， 如Aspergillus sp.DLCS-F18 所產纖維素酶最適溫度為65 ℃，在70 ℃半衰期為80 min， 這預示著該酶可能在木質纖維素水解和動物飼料生產中發揮潛在利用價值（尹以瑞等，2021）， 熱泉和地熱環境作為典型的高溫環境，則是許多嗜熱酶的重要來源。

本研究以云南大理牛街溫泉底泥為材料，進行宏基因組測序后，獲得一個新的纖維素酶基因，命名為njcel6 ，對其進行克隆、異源表達和酶學性質研究，為其在食品、飼料和纖維素乙醇發酵等方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 熱泉底泥樣品采自云南省大理白族自治州洱源縣牛街溫泉（99°2'57"E，26°3'36"N）。熱泉水表面溫度為52 ℃左右，pH 為7.4，樣品被快速冷凍于液氮罐，用于實驗室宏基因組DNA 提取。表達載體使用pET-28a （+），E.coli DH5α 和E.coli BL21 分別用于功能基因的克隆和表達。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA 提取和宏基因組測序 通過power soil Kit （MOBIO DNeasy PowerSoil Kit，USA）提取熱泉樣品總DNA， 送至杭州聯川生物技術股份有限公司， 采用HiSeq 2500 高通量測序平臺進行宏基因組測序，基于功能預測，從宏基因組數據庫中分離出纖維素酶基因序列njcel6。 將該纖維素酶基因核苷酸序列提交到GenBank， 登錄號為OP880883。

1.2.2 序列分析 使用BLASTx 和BLASTp（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 分別對njcel6 的DNA 和氨基酸序列進行比對， 并通過SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預測信號肽，利用EXPASY 工具（http：//web.expasy.org/protparam/）推導和分析氨基酸序列的一級結構，通過Clustal X（Thompson 等，1997）與密切相關的蛋白序列進行多次比對（從NCBI 數據庫檢索）。 使用MEGA 7 軟件包（Kumar 等，2016），采用最大似然（ML）方法和泊松校正模型構建系統發育樹。

1.2.3 纖維素酶基因的克隆和異源表達 對njcel6 基因進行密碼子優化后，再進行基因合成，并克隆到pET28a（+）載體上，將驗證成功的重組載體pET28a-njcel6 導入E.coli BL21（DE3）中進行纖維素酶（njcel6）的異源表達。 然后，將該菌株接種于含有50 μg/mL 卡那霉素的新鮮LB 液體培養基（pH 7.0）中，37 ℃、220 r/min 搖床中過夜培養，作為種子液。 以1%接種量，將種子液接種于含50 μg/mL 卡那霉素的200 mL LB 液體培養基中，37 ℃、180 r/min 培養2 ～3 h 至OD600≈0.7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.1 mmol，再轉入30 ℃、180 r/min 培養過夜。

1.2.4 粗酶液的提取及酶活測定 在4 ℃下8000×g 離心10 min，收獲菌體，將菌體重懸于含有50 mL PBS 緩沖液（pH 7.4）中，進行超聲破碎（150 W；20 min） 后， 再次4 ℃下10000×g 離心20 min，取上清作為粗酶液用于酶學性質研究。取20 μL 粗酶液加入到80 μL 含有1%羧甲基纖維素鈉（CMC）的緩沖液中，在最適條件下反應30 min，以葡萄糖為標準，通過3，5-二硝基水楊酸（DNS）法確定還原糖的量（Miller，1959）。最后，取150 μL樣品置于96 孔板中， 使用酶標儀在波長540 nm處進行吸光值的測定， 所有酶學測定均設3 個試驗組，1 個對照組。

1.2.5 不同溫度和pH 對纖維素酶活性的影響在不同溫度下（25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）將50 μL 粗酶液與250 μL CMC（pH 7）進行30 min 孵育，加入450 μL（DNS）終止反應，沸水浴10 min 冷卻后，使用酶標儀在540 nm 檢測酶活（Miller，1959）。在最適反應溫度下使用pH 3 ～10 的緩沖液（pH 3 ～8 為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，8 ～10 為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液） 檢測不同pH 對粗酶液中纖維素酶活性的影響。

1.2.6 不同pH 和溫度對粗酶穩定性的影響 將100 μL 粗酶液加入200 μL 緩沖液（pH 3、4、5、6、7、8、9 和10）中，于4 ℃下分別孵育12 h 和24 h后，在標準條件下測定其殘留活性。以相同體積蒸餾水稀釋的粗酶液為陽性對照（100%），在3 個溫度（45、50、55 ℃）下培養不同的時間（0、30、60、90、120 min）后，測其殘余活性，以未處理（0 min）粗酶液為陽性對照（100%）。

1.2.7 不同金屬離子和抑制劑對纖維素酶活力的影響為測定金屬離子和抑制劑對纖維素酶的影響，在標準的反應體系中分別加入11 種不同的金屬離子（K+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+和Al3+）至終濃度為1 mmol 和10 mmol。不同抑制劑EDTA、SDS、PMSF 和DTT 至終濃度為0.1%和1%。 使用標準條件下，無添加劑的反應混合物作為陽性對照（100%）。

2 結果

2.1 序列分析 本研究從云南大理牛街溫泉底泥宏基因組數據中，預測到一個GH5 家族的纖維素酶基因（GenBanK 登錄號：OP880883），大小為1701 bp，命名為njcel6。基于氨基酸序列在NCBI Blastx 比對結果，njcel6 分別與Bryobacteraceae 菌株來源內切纖維素酶GIU77643.1 和GIU75612.1表現出95.20% 和72.88%的相似性。如圖1 所示，利用NCBI 數據庫中收集與njcel6 相似性較高的同源性序列構建系統進化樹，結果顯示，njcel6 與Bryobacterales 來源纖維素酶聚在一支， 因此，牛街熱泉宏基因組來源的njcel6 屬于Bryobacterales來源纖維素酶。

圖1 基于njcel6 氨基酸序列同源性構建的系統進化樹

2.2 SDS-PAGE 電泳分析 經SDS-PAGE 電泳分析可得， 誘導后重組子E.coli BL21 （DE3）-pET28a-njcel6 在61 kDa 處有較為明顯的差異條帶，結果如圖2 所示，與理論預測的蛋白分子量基本一致，說明其為重組的目的蛋白條帶。

圖2 SDS-PAGE 膠圖分析重組njcel6 纖維素酶

2.3 纖維素酶njcel6 的最適反應溫度和pH 纖維素酶njcel6 粗酶液最適反應溫度為50 ℃（圖3A），最適pH 為5.0（圖3B）。 纖維素酶njcel6 在溫度50 ～65 ℃表現出95%以上的相對活性，在pH 5.5 ～6.0 表現出超過80%的相對活性， 表明該纖維素酶njcel6 系嗜熱、耐酸纖維素酶。

圖3 溫度（A）和pH（B）對纖維素酶njcel6 活性的影響

2.4 纖維素酶njcel6 的穩定性 如圖4A 所示，纖維素酶njcel6 粗酶液在45、50 ℃和55 ℃下進行孵育2 h，整體相對酶活保持在80%以上。在45 ℃下孵育2 h，其活性被激活，具有120%左右的相對活性；在最適溫度50 ℃下孵育2 h，保持100%的相對活性；在55 ℃下孵育2 h，仍保持80%的相對活性。這說明該酶具有較強的熱穩定性。此外，在最適反應溫度下， 纖維素酶在pH 3 ～10 分別反應12 h 和24 h， 整體相對酶活保持在75%以上，24 h 處理后仍有80%以上的活性， 表明該纖維素酶具有較強的耐酸堿能力（圖4B）。

圖4 溫度（A）和pH（B）對纖維素酶njcel6 穩定性的影響

2.5 不同抑制劑和金屬離子對纖維素酶活力的影響 如圖5 所示， 纖維素酶njcel6 粗酶液在4種抑制劑EDTA、SDS、PSMF 和DTT 濃度分別為0.1%（圖5A）和1%（圖5B）濃度的表現，其中DTT和PSMF 在0.1%、1%兩種濃度下仍保留90%以上相對酶活；EDTA 保留了80%以上的相對酶活，而SDS 在兩種濃度下只保留20%左右的相對酶活，對酶活力的抑制作用最為明顯。 這說明EDTA、PSMF、DTT 抑制劑對酶的抑制作用不大，但在使用njcel6 過程中要避免SDS 的存在。

圖5 不同抑制劑對纖維素酶活性影響

金屬離子濃度為1 mmol（圖6A）和10 mmol（圖6B） 時，K+、Mg2+、Fe3+、Ni2+和Co2+等11 種測試金屬離子對酶活力均無明顯的抑制作用。 在離子濃度為1 mmol 時，Co2+、Mn2+和Al3+對酶活起促進作用， 相對活性在110%以上； 在離子濃度為10 mmol 時，Mg2+、Ca2+對酶活起到較為明顯的促進作用，相對活性保持在140%以上。

圖6 不同金屬離子對纖維素酶活性影響

3 討論

纖維素是地球上存在較為廣泛的可再生資源，有效的利用纖維素資源，不僅可以減緩化石燃料造成的環境污染，還能緩解能源危機（馮雁等，2011）。目前通過微生物發酵可將各種生物質轉化為生物乙醇， 其可以單獨或與汽油混配制成乙醇汽油作為汽車燃料， 該工藝生產技術已經相當成熟，但生產成本較高，發展受到制約。 因為在生物乙醇發酵生產中起關鍵作用的是酶制劑價格，所以通過在高溫下增加酶的活性，減少酶的劑量，從而減少酶的成本已被認為是一種可行的方法。 耐熱酶具有更高的穩定性， 能減少水解所需酶的數量， 減少反應時間（Karnaouri 等，2019；Yang 等，2018）。 與來自中溫菌的酶相比，耐熱酶可以提高反應速率（Ajeje 等，2021），故可有效降低成本。

本研究中纖維素酶其反應的最適溫度和最適pH 分別為50 ℃和5.0， 且在pH 4.5 ～7 有超出90%的相對活性，50 ℃孵育120 min， 仍保持100%相對活性。 巨大芽孢桿菌XT2 所產纖維素酶最適溫度和最適pH 分別為50 ℃和6.0，K+對纖維素酶具有激活作用，Mg2+、Ca2+和Mn2+對酶活具有抑制作用（趙龍妹等，2021）。貝萊斯茅孢桿菌XH-4 來源的纖維素酶，最適溫度和最適pH 分別為50 ℃和6.0， 金屬離子Ag+對纖維素酶活性促進作用最強，Ca2+、Fe3+、K+對其活性有抑制作用（孫會剛等，2021）。根據以上研究可以得知，這些纖維素酶與本研究最適溫度和最適pH 相似， 但在穩定性和耐金屬離子方面njcel6 具有更強的金屬離子耐受性和熱穩定性。 這預示njcel6 纖維素酶在生物工程和食品行業有光明應用前景。

4 結論

本研究從大理牛街熱泉富集物中獲得一個重組耐熱的纖維素酶基因（njcel6），在大腸桿菌中成功進行異源表達，njcel6 最適反應溫度及pH 分別為50 ℃和5.0，55 ℃孵育2 h 仍保持80%以上相對活性，在pH 3 ～10 緩沖液中孵育24 h，仍能保持80%以上相對活性， 試驗測試的11 種金屬離子， 對酶活力均無明顯的抑制作用， 抑制劑SDS存在明顯抑制作用。 說明該纖維素酶是一種耐高溫耐酸環境耐金屬離子，pH 范圍廣泛的酶， 在飼料及食品加工生產中有很大的應用潛力。 綜上所述，纖維素酶njcel6 可為后續纖維素酶在食品、飼料和纖維素乙醇等方面的運用提供參考。