生血寶合劑藥渣對新西蘭兔飼喂效果的研究

賀 宇， 于金高 ， 宋忠興， 唐志書，2 ， 段金廒，朱華旭， 劉紅娜， 周建平， 曹兆軍

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 712046；2.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省植物藥深加工工程研究中心江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；4.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043）

在中藥制藥行業(yè)， 每年會產(chǎn)生數(shù)萬噸的廢棄中藥渣。中草藥渣中不僅含有粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗纖維等多種營養(yǎng)物質(zhì)， 還包含豐富的未提取完全的萜類、黃酮類和甾類等藥用活性成分。 Saleh等（2018）發(fā)現(xiàn)，留蘭香、百里香和絲蘭等藥渣添加飼料可有效提升肉雞的生產(chǎn)性能和抗氧化應(yīng)激能力。此外，也有試驗將中草藥渣應(yīng)用到反芻動物的養(yǎng)殖上，Wang 等（2021）將黃芪添加到藏羊的飼料中， 發(fā)現(xiàn)藏羊的血清抗氧化水平和免疫因子顯著提升。

生血寶合劑是由制何首烏（Polygoni Multiflori Radix Praeparata）、 女貞子 （Ligustri Lucidi Fructus）、桑椹（Mori Fructus）、墨旱蓮（Ecliptae Herba）、白芍（Paeoniae Radix Alba）、 黃芪（Astragali Radix）、狗脊（Cibotii Rhizomi）七種中藥材制成的補益類中成藥，主要功效為滋養(yǎng)肝腎和益氣補血，臨床上用于各類貧血的治療（彭舟麗，2017）。其在制劑過程中會產(chǎn)生大量藥渣， 對其進行飼料化開發(fā)不僅可改善藥企藥渣污染問題， 還能開發(fā)新型飼料資源，促進中草藥行業(yè)及畜牧業(yè)協(xié)調(diào)發(fā)展。

本研究首先通過營養(yǎng)物質(zhì)考察及UPLCTOF-MS 活性成分測定對生血寶藥渣 （SXBR）進行成分表征。 隨后設(shè)計低、中、高比例的SXBR 添加飼料進行動物飼養(yǎng)，考察體重增長、屠宰率、滴水損失率等生產(chǎn)性能指標，并從抗氧化應(yīng)激能力、腸道菌群和骨髓造血功能等方面進行功能性考察。最后通過組織病理切片觀察、血清生化和免疫指標檢測進行潛在毒性表征， 以確定生血寶藥渣開發(fā)為優(yōu)質(zhì)動物飼料的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 UPLC-TOF-MS （Waters ACQUITY UPLC H-Class 型， 美國Waters 公司；Triple TOFTM 5600，美國AB SCIEX 公司）；UPLC（Agilent1290 型，美國Agilent 公司）； 純化水系統(tǒng)（Milli - Q，美國Millipore 公司）；全自動飼料機（YZ-160，安徽揚子工業(yè)科技有限公司）；分光測色儀（YS6060，深圳市三恩時科技有限公司）；全自動血清生化分析儀（BS-330E 型，邁瑞醫(yī)療國際有限公司）。

SXBR（09 批，清華德人西安幸福制藥有限公司）；苜蓿草（20210816，新沂市樂澤寵物用品有限公司）；濃縮飼料（PK0807T3，英國Supreme Selective 公司）；IgA ELISA 試劑盒（20210711，艾萊薩生物科技有限公司， 上海）； IgG ELISA 試劑盒（20210618， 艾萊薩生物科技有限公司， 上海）；IgM ELISA 試劑盒（20210706，艾萊薩生物科技有限公司，上海） 。

1.2 SXBR 營養(yǎng)成分含量測定 SXBR 干物質(zhì)（DM）、有機物（OM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（CFAT）、粗纖維（CF）、總碳水含量（TC）和能量（NRG） 均依照中國藥典2020 版或中華人民共和國國家標準進行測定和計算。

1.3 SXBR 次生代謝產(chǎn)物鑒定 供試樣品配制：對SXBR 打粉， 稱取0.05 g 并加入50.0 mL 的甲醇，采用超聲法超聲提取40 min，過0.22 μm 的微孔濾膜，即得SXBR 供試品。

液相色譜條件： 以0.1%甲酸水（A） 和乙腈（B）作為流動相，使用ACQUITY UPLC HSS T3 柱進行洗脫， 洗脫條件為：0 ～25 min，2% ～10%B；25 ～75 min，10% ～24.5%B；75 ～77 min，24.5% ～40%B；77 ～97 min，40%B；97 ～102 min，40% ～48%B；102 ～132 min，48%～80%B；132 ～133 min，80% ～80.03%B；133 ～138 min，80.03% ～2%B；138 ～140 min，2%B。 設(shè)置5 μL 的進樣量，0.3 mL/min的流速及254 nm 的檢測波長。

質(zhì)譜條件： 使用超高效液相-三重四級桿高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀，電噴霧離子源（ESI），在正負離子模式下， 以IDA、DBS 和高靈敏度模式采集前10 個峰度最高的母離子。

1.4 飼料制備與動物試驗設(shè)計 濃縮飼料、苜蓿草、SXBR 打粉， 使用飼料機制備為顆粒飼料，晾干后封裝待用。 12 只90 d 的新西蘭兔隨機分為四組，即對照組（SXBRc，飼喂70%濃縮飼料+30%苜蓿草）、低比例添加組（SXBRl，飼喂5%SXBR+70%濃縮飼料+25%苜蓿草）、 中比例添加組（SXBRm， 飼喂10%SXBR+70%濃縮飼料+20%苜蓿草）及高比例添加組（SXBRh，飼喂20%SXBR+70%濃縮飼料+10%苜蓿草）， 濃縮飼料營養(yǎng)水平見表1。 每只兔子每天分4 次喂90 g 飼料，飲水自由。 60 d 后使用戊巴比妥鈉麻醉兔子，取血液以及各器官組織進行分析。

表1 濃縮飼料的營養(yǎng)水平 %

1.5 動物生產(chǎn)性能測定 每天固定時間稱量兔子體重。飼養(yǎng)期結(jié)束后，參照高鳳磊等（2021）的方法計算料重比及屠宰率，參考何長晟等（2019）的方法安裝滴水損失裝置，計算滴水損失率。

1.6 飼料功能性考察

1.6.1 生物標志物測定 采集兔子全血制備血清， 采用試劑盒檢測法分別對血清總抗氧化能力（AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量進行測定； 同時取各組新西蘭兔股骨固定進行TUNEL 檢測及骨髓造血功能考察。

1.6.2 腸道菌群測序分析 將新鮮的兔子糞便收集在冰上， 半小時內(nèi)收集完畢后在-80 ℃環(huán)境中保存。提取糞便總DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA 進行檢測 （Yu 等，2018）。 PCR 擴增16S V3 ～V4 區(qū)（細菌，引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）和ITS1 區(qū)（真菌，引物：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）， 純化后進行測序 （Wen 等，2017）， 使用UPARSE 軟件按相似度閾值為97%進行聚類，即得OTUs（Clare 等，2016）。

1.7 飼料安全性考察 飼喂周期結(jié)束后，解剖兔子，取兔子心、肝、脾、肺、腎、胃、盲腸、回腸和結(jié)腸組織固定，進行病理切片觀察。 采集兔子血液，檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、尿酸（UA）、尿素（UREA）、血糖（GLU）、肌酐（CREA）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、肌酸磷酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）等血清生化指標， 使用試劑盒檢測腸道屏障功能標志物磷酸酯多糖（LPS）和IgA、IgG、IgM 水平。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖 通過AB SCIEX Peakview 2.2軟件進行UPLC-TOF-MS 數(shù)據(jù)分析，以master view 1.1.0.0 版塊聯(lián)合中草藥成分數(shù)據(jù)庫鑒定SXBR 中的活性成分。 匹配檢索條件為： 與TCM MS/MS 庫中標準品的二級質(zhì)量碎片重合（Yao 等，2019）。

腸道菌群數(shù)據(jù)分析以物種豐度列表為基礎(chǔ)，分別利用細菌和真菌OTUs 作組間比較韋恩圖，以O(shè)TUs 豐度、 屬水平豐度數(shù)據(jù)采用R 語言軟件和在線工具進行主成分分析、 聚類熱圖分析和LefSe 分析，LDA 閾值為2，顯著性閾值設(shè)置為P＜0.05。 宏基因組功能預(yù)測使用PICRUSt2 軟件進行， 其豐度數(shù)據(jù)使用STAMP 軟件進行非參數(shù)檢驗并作圖。

其余數(shù)據(jù)采用K-W 檢驗進行組間比較，顯著性閾值設(shè)置為P＜0.05。 折線圖和柱形圖使用GraphPad Prism 9.0 制作。

2 結(jié)果

2.1 SXBR 營養(yǎng)價值 為探究SXBR 的營養(yǎng)價值， 本研究首先對SXBR 的營養(yǎng)成分含量進行測定。研究發(fā)現(xiàn)SXBR 富含碳水化合物、粗脂肪和粗纖維等物質(zhì)（表2）。 數(shù)據(jù)顯示SXBR 的DM 含量高達952.80 g/kg， 其中OM 含量為865.30 g/kg，TC 含量為703.76 g/kg， 其CP、CFAT 和CF 水平也較為可觀。 根據(jù)營養(yǎng)成分計算的總能量高達16029.38 kJ/kg。從營養(yǎng)水平來看，SXBR 具有作為飼料添加劑的潛力。

表2 SXBR 組成及營養(yǎng)水平

飼料原料或飼料添加劑中的功能性次生代謝物是其發(fā)揮保健作用的基礎(chǔ)。 SXBR 是7 味補益類藥食兩用中草藥水提取后的藥渣， 本研究應(yīng)用UPLC-TOF-MS 技術(shù)對其中殘留的次生代謝產(chǎn)物進行了鑒定（表3），結(jié)果表明在SXBR 中總共鑒定出51 種化合物，主要為三萜、黃酮、皂苷、氨基酸、維生素等小分子化學(xué)成分，這些物質(zhì)具有良好的抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群和促進消化等活性。

表3 SXBR 中功能性成分表征

以上數(shù)據(jù)表明SXBR 營養(yǎng)價值高， 活性成分豐富，有潛力開發(fā)為優(yōu)質(zhì)動物飼料。 考慮到SXBR富含粗纖維， 故本研究進一步采用草食性動物新西蘭兔驗證SXBR 的營養(yǎng)價值、 保健價值并對其安全性進行了考察。

2.2 SXBR 對新西蘭兔生產(chǎn)性能的影響 在新西蘭兔的基礎(chǔ)日糧中添加5%～20%的SXBR，在定量飼喂的條件下， 發(fā)現(xiàn)SXBR 混合飼料適口性良好，基本不影響兔子的采食量。在飼喂過程中通過各組新西蘭兔體重增加趨勢可知，SXBRh 組的體重增長速度總體高于SXBRc、SXBRh 組新西蘭兔在第44天（P =0.024）、54 天（P =0.009）和57 天（P =0.024）的體重增量， 相比SXBRh 組分別顯著提高了62.08%、72.38%、64.96%。 SXBRm 組和SXBRl 組體重增量與SXBRc 組之間無顯著差異（圖1A）。 料重比可直接反映飼料生產(chǎn)效能， 飼喂周期結(jié)束后，通過計算可知SXBRh 組新西蘭兔的料重比相比SXBRc 組顯著降低了43.85%（P=0.042）（圖1B）。

圖1 各組生產(chǎn)性能指標測試結(jié)果

屠宰率反映動物可利用部位的比率， 是衡量飼料產(chǎn)肉性能的經(jīng)濟指標。 研究發(fā)現(xiàn)各添加飼料組屠宰率均大于SXBRc 組，添加量從低到高分別比SXBRc 組的屠宰率增加了9.02%、6.54%、8.94%，當采用t 檢驗進行組間比較時，其P 均＜0.05（圖1C）。 同時，飼料中添加SXBR 后，兔肉的滴水損失率有降低趨勢，即兔肉趨于緊致，且其變化趨勢與添加比例呈正相關(guān)（圖1D）。

2.3 SXBR 對新西蘭兔抗氧化因子水平的影響鑒于SXBR 中含有調(diào)節(jié)機體代謝、抗炎、抗氧化等活性的成分， 本研究進一步考察了新西蘭兔血清中的抗氧化因子水平， 結(jié)果表明SXBR 各添加比例雖然不影響血清T-AOC 和GSH-Px 活性，但明顯增加了SOD 活力， 降低了MDA 水平 （圖2），量-效關(guān)系明顯。 SXBRh 組新西蘭兔的SOD 活力相比于SXBRc 組顯著增加了91.70%（P =0.003），MDA 含量相比SXBRc 組顯著降低了80.62%（P =0.010）。 由此可見，飼料中添加SXBR 可顯著增加新西蘭兔的血清抗氧化因子水平， 降低機體脂質(zhì)過氧化水平。

圖2 各組抗氧化指標檢測結(jié)果

2.4 SXBR 對腸道微生態(tài)的影響 腸道菌群穩(wěn)態(tài)是機體健康的基礎(chǔ)之一， 特別是腸道菌群代謝是腸道消化代謝過程的重要一環(huán)。 為探討SXBR對腸道菌群的影響， 本研究分別對各組新西蘭兔糞便樣本進行16S rRNA 以及ITS1 進行基因測序分析。 韋恩圖分析表明各處理組細菌群落大體相似，共有OTU 數(shù)量約占總數(shù)的60%（圖3A）；而真菌各組之間相差較大，可能與OTU 數(shù)量較少而個體差異較大有關(guān)（圖3B）。

圖3 各組細菌（A）和真菌（B）的OUTs 韋恩圖

SXBR 對新西蘭兔腸道細菌群落結(jié)構(gòu)影響有限，PCA 分析和聚類分析顯示（圖4A、圖4B），各組腸道菌群結(jié)構(gòu)無明顯差異。 但PICRUSt 分析（圖4C）顯示，SXBR 可減弱腸道細菌多糖代謝和次級膽汁酸代謝通路， 增強氯代烷烴和氯烯烴降解以及抗生素合成和抗藥性相關(guān)代謝通路。

圖4 各組腸道菌群細菌種屬差異分析

SXBR 對新西蘭兔腸道真菌群落影響較細菌更為明顯，PCA 分析和熱圖分析（圖5A、圖5B）表明各處理組之間群落結(jié)構(gòu)差異明顯， 特別是SXBRh 與SXBRc 的菌群輪廓完全分離。 采用LefSe 軟件分析兩組間各生物分類水平差異 （圖5C、圖5D），發(fā)現(xiàn)酵母綱（Saccharomycetes）酒精酵母屬（Zygosaccharomyces）真菌在SXBR 處理組相對富集，而散囊菌綱（Eurotiomycetes）曲霉科（Aspergillaceae）以及錘舌菌綱（Leotiomycetes）小毛盤菌屬（Cistella）真菌相對減少。

圖5 各組腸道菌群真菌種屬差異分析

2.5 SXBR 對新西蘭兔骨髓造血的影響 由前述活性成分鑒定可知，SXBR 中存留豐富的藥用成分，為考察其對新西蘭兔造血功能的影響，本研究取各處理組股骨固定并進行骨髓細胞TUNEL檢測。 由圖6 可見，隨著SXBR 的添加，新西蘭兔骨髓中造血干細胞凋亡信號（綠色）明顯減少。

圖6 各組股骨骨髓細胞的TUNEL 檢測

2.6 SXBR 添加飼料的安全性及對新西蘭兔各項生理功能的影響 一種新型飼料資源的開發(fā)，其安全性往往是人們特別關(guān)注的問題。 SXBR 來源于中草藥提取殘渣， 其潛在的慢性毒性問題不容忽視。 為此，本研究在60 d 飼養(yǎng)周期之后從組織病理切片、血清生化指標、血清免疫球蛋白以及LPS 幾個方面對其潛在毒性進行表征。 結(jié)果表明各組新西蘭兔組織病理切片未見異常 （圖7），血清生化結(jié)果表明除SXBRm 組 （P =0.007）和SXBRh 組 （P =0.024）UREA 含量比SXBRc 組顯著降低23.23%、20.65%外， 其余各項指標各組間均無顯著差異（表4）。 血清免疫球蛋白和LPS 測定發(fā)現(xiàn)， 各組IgA、IgG、IgM 以及反映腸道屏障功能的血清LPS 含量均無顯著差異（表5）。

圖7 各組組織病理切片顯微圖

表4 各組血清生化測定結(jié)果

表5 各組免疫功能指標測定結(jié)果

綜合以上數(shù)據(jù)， 認為在飼料中添加SXBR 并長期飼喂新西蘭兔，對其心、肝、脾、肺、腎等主要臟器功能、免疫功能、腸道屏障功能均無明顯損傷作用， 證明SXBR 作為食草動物飼料添加劑具有良好的安全性。

3 討論

3.1 SXBR 營養(yǎng)價值可觀并富含多種小分子活性成分 作為飼料原料或飼料添加劑， 需具備可觀的營養(yǎng)價值以保證動物生長，維持機體健康。蔣蘇蘇等（2017）研究表明，添加5%的由白芍、太子參、牛蒡、黨參和川芎組成的混合中草藥渣，飼料的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、磷含量明顯高于未添加組。劉倩等（2022）發(fā)現(xiàn)，通脈顆粒藥渣和咽炎片藥渣的干物質(zhì)含量分別達到了99.10%和71.86%，參茸補腎片藥渣的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量也較為可觀。 SXBR 是由七種藥食同源中藥材經(jīng)水提后的產(chǎn)物，結(jié)合此前研究結(jié)果表明，其干物質(zhì)、有機物、總能量及粗脂肪含量均大于多數(shù)常規(guī)飼料，總體與玉米相似， 具有相當可觀的營養(yǎng)價值（于金高等，2022）。中草藥渣因其來源特殊性，還殘留有一部分藥用成分，有促進動物生長、提高抗氧化應(yīng)激能力、增強免疫力和調(diào)節(jié)腸道菌群等多種作用。據(jù)文獻報道， 中草藥渣中的殘留活性成分超過30%（Lu 和Li，2021）。夏禹等（2022）采用響應(yīng)面法使溫莪術(shù)藥渣的總姜黃素產(chǎn)率提升至6.38 mg/g， 且其抗氧化活性較強。李雙等（2019）采用水提醇沉法及離子樹脂柱提取純化已經(jīng)提取過三七皂苷的工業(yè)三七藥渣中的三七素，三七素產(chǎn)率達0.72%，并且具有良好的凝血活性。 本研究結(jié)果表明，SXBR 中還富含三萜類、黃酮類等具有抗氧化、抗炎、抗菌活性的藥用成分，有開發(fā)為功能性飼料添加劑的潛力。

3.2 SXBR 可促進新西蘭兔體重增長，生產(chǎn)性能良好 動物養(yǎng)殖追求效益，以最短的時間、最少的成本換取更多的收益是增加養(yǎng)殖場利潤、 節(jié)約糧食資源的有效途徑。孫曉燕（2019）將發(fā)酵的香菇、金針菇、銀耳等八種藥渣應(yīng)用于豬的養(yǎng)殖，發(fā)現(xiàn)藥渣組豬的腹瀉率及料重比顯著降低。 Liang 等（2013）研究表明，黃芪、當歸、白術(shù)藥渣可顯著提升綿陽的體重增長水平。 從本研究結(jié)果來看，SXBR 可有效促進動物體重增加，降低料重比，增加屠宰率，大大提高生產(chǎn)效益，這可能與其可促進有氧代謝，減少糖酵解和肌內(nèi)脂肪沉積，增加肌內(nèi)蛋白水平有關(guān)。

3.3 SXBR 可增強新西蘭兔抗氧化應(yīng)激能力，調(diào)節(jié)腸道菌群， 促進骨髓造血 動物受到諸如惡劣氣候、 飼料配方改變和周圍環(huán)境污染等外界刺激時，機體會出現(xiàn)代謝失衡并產(chǎn)生大量自由基。當自由基水平高于動物自身抗氧化能力時， 過量的自由基存于組織、細胞中，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致嚴重的氧化損傷，影響采食量，危害動物健康，降低生產(chǎn)力（Chauhan 等，2021）。 因此，在畜禽養(yǎng)殖中， 提倡選擇抗氧化作用強的飼料來增加動物抗氧化應(yīng)激能力。本試驗結(jié)果表明，生血寶藥渣可顯著增強新西蘭兔血清SOD 活力， 減少血清MDA含量，可見其抗氧化應(yīng)激能力較為突出。

腸道菌群穩(wěn)態(tài)是保證動物正常進食、體重增加的基礎(chǔ)，其與動物免疫能力息息相關(guān)（Fetissov 等，2017）。 次級膽汁酸與腸道消化功能以及炎癥的發(fā)生密切相關(guān)（Sinha 等，2020），而抗生素相關(guān)代謝主要參與腸道菌群群落相互競爭相互調(diào)節(jié)，SXBR 調(diào)節(jié)細菌這些代謝功能意味著其能夠影響新西蘭兔腸道消化代謝、 腸道炎癥以及腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。酒精酵母是一種能夠利用纖維素等多糖類物質(zhì)產(chǎn)生乙醇的真菌， 能夠促進食草動物消化粗飼料。曲霉科和小毛盤菌屬真菌主要存在于植物根際土壤，曲霉科真菌常見于根腐病植物根際，有些種屬能夠產(chǎn)生劇毒的真菌毒素。這些真菌的減少可能與新西蘭兔腸道內(nèi)環(huán)境改變有關(guān)，SXBR 或可減少食草動物腸道不良發(fā)酵和食物中毒的幾率。

已有研究表明， 生血寶可用于由鐵攝入不足、營養(yǎng)不良、 術(shù)后、 妊娠、 衰老等引起的各類貧血（Zhou 等，2021）。 由骨髓細胞TUNEL 檢測結(jié)果可見，隨著SXBR 的增加，新西蘭兔骨髓凋亡細胞明顯減少，與60 d 內(nèi)動物體重增長的趨勢一致，都能說明SXBR 可以促進動物造血和機體生長。據(jù)相關(guān)文獻分析，SXBR 減弱凋亡很可能與其抗氧化作用有關(guān)（Meng 等，2020）。

3.4 SXBR 安全性良好 生血寶合劑是由七種藥食同源中藥材組成的補益類中成藥，研究表明其安全性良好，且此前課題組對生血寶合劑提取液沉淀物的飼料化開發(fā)研究也未見異常 （于金高等，2022）。 本研究與此前研究結(jié)果一致，SXBR 對新西蘭兔臟器形態(tài)、血清生化和免疫功能基本無影響。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，SXBR 營養(yǎng)價值高，含有豐富的小分子活性物質(zhì)， 有開發(fā)為優(yōu)質(zhì)動物飼料的潛力。 SXBR 作為動物飼料其生產(chǎn)性能優(yōu)良，能夠促進新西蘭兔生長， 同時有效提升動物抗氧化應(yīng)激能力、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，對機體器官形態(tài)和功能未造成不良影響，安全性良好。