飼料中添加發酵豆粕對湘云鯽生長性能、腸道及肝臟健康的影響

周良星， 趙 敏， 劉佳裕， 馮麒鳳 ， 周桂蓮， 李 勇，5， 劉天驥，劉 匆， 張遨然， 王光花， 羅 浩， 顧夕章， 王向榮， 羅 莉 ， 李洪琴

（1.新希望六和股份有限公司農業農村部飼料及畜禽產品質量安全控制重點實驗室，北京 100102；2.西南大學水產學院重慶市水產科學重點實驗室淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，重慶 400715；3.射陽六和飼料有限公司江蘇省水產生物環保飼料工程研究中心，江蘇 鹽城 224000；4.廣州希望飼料有限公司，廣東 廣州 510000；5.山東新希望六和集團有限公司青島市動物飼料安全重點實驗室，山東 青島 266061；6. 中國海洋大學，山東 青島 266072）

魚粉供應不足，價格居高不下，魚粉替代技術研究已成為水產養殖領域熱點問題 （Dossou 等，2018；Van Doan 等，2018；Hoseinifar 等，2018）。 豆粕蛋白質含量高、價格低且氨基酸分布相對平衡，是魚粉主要替代蛋白源之一（Gatlin III 等，2007），但豆粕中的抗營養因子會損傷水生動物腸道健康， 降低水生動物的生長性能 （Li 等，2017 ，Gemede 和Ratta，2014）， 限制了其在水產飼料中的應用。 微生物發酵可最大限度消除豆粕中的抗營養因子，增加豆粕中粗蛋白質、小肽和游離氨基酸含量，并產生寡肽、谷氨酸、益生菌、維生素、乳酸、 未知生長因子等生物活性物質 （張蓓莉等，2017；Mukherjee 等，2016）， 顯示出比豆粕更好的魚粉替代效應（李寧宇等，2020；Wang 等，2016）。近年來，在大口黑鱸（何明等，2020）、石斑魚（羅智等，2004）、凡納濱對蝦（劉韜等，2022）和異育銀鯽（陳萱等，2005）等水產養殖品種上的研究表明，以適宜比例發酵豆粕替代飼料中的魚粉， 可以提高動物消化酶活性、抗氧化能力以及免疫功能，改善肌肉品質， 且不會對養殖動物生長性能產生不利影響。

湘云鯽是由二倍體母本和異源四倍體父本雜交培育而來的三配體淡水新品種，具有食性廣、生長迅速、抗逆性強、耐低氧、耐低溫等優點，是目前國內個體最大的優質鯽魚，市場潛力巨大，然而目前鮮有發酵豆粕在湘云鯽飼料中的應用效果報道?；诖?，本試驗以發酵豆粕替代湘云鯽飼料中的部分魚粉和豆粕，研究其對湘云鯽生長性能、腸道及肝臟健康的影響， 為發酵豆粕在湘云鯽飼料中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗飼料 以魚粉、肉粉、發酵豆粕、豆粕等為蛋白源， 大豆油為脂肪源配制成2 組等氮（37%）等脂（7.8%）的試驗飼料，對照組為魚粉組（FM 組）， 添加發酵豆粕的試驗飼料為發酵豆粕替代組（FSM 組）。 為避免限制性氨基酸差異對試驗結果的影響，FSM 組添加0.02%的蛋氨酸和0.10%的賴氨酸，使其蛋氨酸及賴氨酸含量與FM組近似相等。飼料組成及主要營養成分見表1。飼料原料均購于重慶新希望飼料有限公司， 粉碎后過60 目篩，用轉鼓式混合機混合均勻，制成直徑2.5 mm 的飼料，風干后-20 ℃保存。

表1 試驗飼料組成及主要營養成分（風干基礎） %

1.2 試驗魚飼養與管理 試驗魚購于重慶市北碚歇馬漁場，用1%食鹽消毒后，以商品飼料暫養1 周。 選擇體質健康、個體均勻、體重為（37.26±0.16）g 的試驗魚160 尾， 隨機置于8 個圓柱形水族缸（容積500 L）中，分為2 組，每組4 個重復，每個缸20 尾。

每天8：30、12：30、17：00 飽食投喂3 次，養殖周期56 d。 養殖水源為曝氣自來水，飼養期間水溫22 ～26 ℃， 溶解氧＞6.0 mg/L，pH 6.5 ～7.5，氨氮含量＜0.50 mg/L，亞硝酸鹽含量＜0.05 mg/L。

1.3 樣品采集 養殖試驗結束后， 停食24 h，MS-222（0.01%）麻醉，分別計數、稱重。 每重復隨機取5 尾魚測定體重、體長，從尾靜脈抽取靜脈血于EDTA-Na 抗凝管中，靜置后4000 g 離心10 min，取上層血漿存于-80 ℃冰箱中保存待用。 每重復隨機取5 尾魚，于冰盤中解剖，分離腸道、肝臟、肌肉，液氮速凍后于-80 ℃保存備用。 此外，每重復隨機取3 尾魚，取前腸、肝臟于4%多聚甲醛中固定備用，用于石蠟切片的制備。

1.4 指標測定

1.4.1 生長指標及形體指標測定 采用以下公式計算生長性能和生物學性狀：

增重率（WG）/%=（W2-W1）/W1×100；

特定生長率 （SGR）/（%/d）=（LnW2-LnW1）/t×100；

餌料系數（FCR）=D/（W2-W1）；

干物質沉積率（DRR）/%=100×（W2×W2d-W1×W1d）/（Wd×Wdd）；

蛋白質沉積率 （PRR）/%=100×（W2×W2p-W1×W1p）/（Wd×Wdp）；

脂肪沉積率（LRR）/%=100×（W2×W2l-W1×W1l）/（Wd×Wdl）；

肥滿度（CF）/（g/cm3）=100×W2/L3；

臟體比（VSI）/%=內臟團重/W2×100；

肝體比（HSI）/%=肝臟重/W2×100。

式中：W1為起始均重，g；W2為終末均重，g；Wd為尾均攝食飼料總量，g；W2d為終末魚全魚干物質含量；W2p為終末魚全魚粗蛋白質含量；W2l為終末魚全魚粗脂肪含量；Wdd為飼料干物質含量；Wdp 為飼料粗蛋白質含量；Wdl為飼料粗脂肪含量；W1d為初始魚干物質含量；W1p為初始魚粗蛋白質含量；W1l為初始魚粗脂肪含量；L 為體長，cm；D 為尾均攝食量，g；t 為飼喂天數。

1.4.2 試驗飼料、全魚、肌肉常規營養成分的測定水分、 粗蛋白質、 粗脂肪、 粗灰分含量分別采用105 ℃烘箱干燥法（GB/T 6435-2006）、凱氏定氮法（GB/T 6432-1994）、索氏抽提法（GB/T 6433-1994）、550℃灼燒法（GB/T 6438-1992）進行測定。

1.4.3 石蠟組織切片制樣 多聚甲醛固定后，乙醇梯度脫水，置于二甲苯中透明，用低熔點的石蠟包埋成蠟塊， 用Leica UC7 RT 切片機連續切片，厚度為4 μm，展片后HE 染色，中性樹膠封片。

1.4.4 酶活及生化指標的測定 消化酶： 淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶、Na+-K+-ATPase 活性，抗氧化指標：總抗氧化能力（T-AOC），總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，血漿生化指標：谷丙轉氨酶（ALT）活性、谷草轉氨酶（AST）活性、甘油三酯（TG）含量、總膽固醇（TCHO）含量、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量、溶菌酶（LMZ）活性，均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，免疫球蛋白M（IgM）含量、二胺氧化酶（DAO）活性、內毒素（LPS）含量指標采用上海優選Elisa 試劑盒測定。

1.5 數據分析 采用SPSS 22.0 對數據采用獨立樣本T 檢驗比較分析組間差異， 顯著水平為P＜0.05。 試驗結果以“平均值±標準差”（Mean±SD）形式表示。

2 結果

2.1 發酵豆粕對湘云鯽生長性能的影響 由表2可知，FM 組與FSM 組間湘云鯽的終末均重、增重率、特定生長率、尾均攝食量、餌料系數、肥滿度、臟體比、肝體比、干物質沉積率、蛋白質沉積率和脂肪沉積率均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 發酵豆粕對湘云鯽生長性能的影響

2.2 發酵豆粕對湘云鯽體組成的影響 由表3可知，與FM 組相比，FSM 組湘云鯽肌肉粗蛋白質含量顯著提高（P＜0.05）， 粗灰分含量顯著降低（P＜0.05）。FM 組與FSM 組間湘云鯽全魚粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分以及肌肉粗脂肪含量均無顯著差異（P＞0.05）。

表3 發酵豆粕對湘云鯽體組成的影響（鮮樣） %

2.3 發酵豆粕對湘云鯽腸道健康的影響

2.3.1 發酵豆粕對湘云鯽腸道形態結構的影響由圖1 可觀察到兩組腸道絨毛結構均完整， 無絨毛脫落現象。由表4 可知，FM 組與FSM 組腸道絨毛數目與高度均無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 發酵豆粕替代魚粉對湘云鯽腸道形態結構的影響

表4 發酵豆粕對湘云鯽腸道形態結構的影響

2.3.2 發酵豆粕對湘云鯽腸道黏膜通透性的影響發酵豆粕對湘云鯽腸道形態結構的影響 由表5可知， 與FM 組相比，FSM 組血漿D-乳酸含量顯著降低了21.5%（P＜0.05），而二胺氧化酶活性與內毒素含量無顯著差異（P＞0.05）。

表5 發酵豆粕對湘云鯽腸道黏膜通透性的影響

2.3.3 發酵豆粕對湘云鯽腸道消化吸收功能的影響 由表6 可知，與FM 組相比，FSM 組腸道脂肪酶活性顯著提高了10.2%（P＜0.05），然而胰蛋白酶、淀粉酶和Na+-K+-ATP 酶活性與FM 組間無顯著差異（P＞0.05）。

表6 發酵豆粕對湘云鯽腸道消化吸收功能的影響 U/mg prot

2.3.4 發酵豆粕對湘云鯽腸道抗氧化能力的影響由表7 可知，FSM 組腸道總超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量與FM 組間無顯著差異（P＞0.05）。

表7 發酵豆粕對湘云鯽腸道抗氧化能力的影響

2.4 發酵豆粕替代魚粉對湘云鯽肝臟結構功能的影響

2.4.1 發酵豆粕替代魚粉對湘云鯽肝臟形態結構的影響 發酵豆粕對湘云鯽肝臟結構影響見肝臟圖2。 FM 組和FSM 組肝細胞索明顯， 排列較整齊，肝細胞結構完整。

圖2 發酵豆粕替代魚粉對湘云鯽肝臟形態結構的影響

2.4.2 發酵豆粕對湘云鯽血漿生化指標的影響由表8 可知， 與FM 組相比，FSM 組血漿谷丙轉氨酶活性、總膽固醇含量顯著降低（P＜0.05），其中谷丙轉氨酶活性降低了11.3%，總膽固醇含量降低了23.1%，溶菌酶活性、免疫球蛋白M 含量顯著提高（P＜0.05）。FM 組與FSM 組間谷草轉氨酶活性、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇含量、HDL-C/LDL-C 無顯著差異（P＞0.05）。

表8 發酵豆粕對湘云鯽血漿生化指標的影響

2.4.3 發酵豆粕對湘云鯽肝臟抗氧化能力的影響由表9 可知，FM 組與FSM 組肝臟總抗氧化能力、總超氧化物歧化酶活性、 丙二醛含量均無顯著差異（P＞0.05）。

表9 發酵豆粕對湘云鯽肝臟抗氧化能力的影響

3 討論

經微生物發酵后，由于消除了抗營養因子，并增加了粗蛋白質、小肽和氨基酸等含量，發酵豆粕表現出更好的魚粉替代效應（Wang 等，2016）。 近年來， 發酵豆粕在水產動物飼料中引起了越來越多的關注， 尤其是在魚粉替代方面（Rahimnejad等，2019；Liang 等，2017；馮建等，2016）。發酵豆粕替代魚粉在魚類飼料中研究廣泛， 但不同物種間其添加量存在很大差異 （祝焱彬等，2018；Barnes等，2015），這可能與養殖品種、飼料組成以及微生物降解抗營養因子成功率等差異有關。 在大口黑鱸（何明等，2020）飼料中以豆粕、發酵豆粕替代魚粉的比較研究中發現，發酵豆粕可以替代30%魚粉而不影響其生長性能，而豆粕僅能替代15%的魚粉，豆粕經發酵后，干物質、粗蛋白質、總氨基酸和磷的表觀消化率顯著提高。 此外，發酵豆粕替代暗紋東方鲀飼料中的豆粕可提高其生長性能以及飼料利用能力（孔純等，2017）。 本研究發現，添加12%發酵豆粕部分替代飼料中的魚粉和豆粕對湘云鯽的生長性能及飼料利用無影響。 研究表明，發酵豆粕替代飼料中適量的魚粉不會影響水產動物的生長性能（Choi 等，2020；Rahimnejad 等，2019）。Rahimnejad 等（2021） 在以花鱸為模型的試驗發現， 低劑量發酵豆粕替代魚粉不影響花鱸生長性能，替代量過高時其增重率、攝食量、蛋白質效率隨替代水平的增加而下降， 最適魚粉替代量為26.9%～37.1%。Choi 等（Choi 等，2020）在虹鱒上的研究發現， 當發酵豆粕替代魚粉水平低于40%時，不影響虹鱒的增重率以及飼料轉化率，當替代率達到60%時，則會降低其增重率以及飼料效率。

腸道是營養物質消化、吸收的主要場所，其消化和吸收相關酶的活性直接影響機體對外界營養物質的消化和吸收速率。本試驗中，發酵豆粕提高了湘云鯽腸道脂肪酶活性， 而對其他消化吸收酶活性無影響。 湘云鯽腸道消化能力的提高與生長性能部分的結果趨勢一致。除此以外，腸道是機體抵御病原微生物入侵的第一道屏障， 該屏障允許吸收養分，阻止病原體入侵，其結構和功能完整性是維持養殖動物腸道健康的基礎 （Liu 等，2021；Lauriano 等，2016）。 血清D-乳酸和DAO 酶活性是用作評估腸黏膜屏障功能的間接指標（Zhang等，2018），當屏障功能受損時，細胞內的D-乳酸會釋放出來，進入血液循環系統，從而對機體產生毒害作用。在日本鱸魚（Rahimnejad 等，2019）和花鱸（Rahimnejad 等，2021）上的研究表明，血清D-乳酸含量隨發酵豆粕替代量增加而增加， 低發酵豆粕組DAO 酶活性與對照組無顯著差異。在仔豬（馮江鑫等，2020）上的研究表明，發酵飼料組腸道ZO-1、CLDN-1 基因相對表達量上調， 增強了腸道屏障功能，本試驗結果與之相似。 有研究表明，在小鼠（Li 等，2020）酒精性肝病模型中使用乳桿菌混合物后， 腸上皮通透性改善以及腸道菌群中革蘭氏陰性細菌減少導致進入門靜脈的LPS 的減少，提高了腸道屏障功能。 故在本試驗中，猜測可能是發酵飼料中的有機酸發揮了作用， 提高了湘云鯽腸道屏障功能。

血液學指標通常被用作評估魚類生理和健康狀況的關鍵診斷指標，并受季節、溫度和營養變化的影響（Van Doan 等，2017；Dawood 等，2016）。 本試驗中， 發酵豆粕替代部分魚粉和豆粕降低了血漿中總膽固醇含量， 這與花鱸 （Rahimnejad 等，2021）、虹鱒（Matsunari 等，2010）、大黃魚（馮建等，2016）中得到的結果相一致。研究表明，大豆蛋白替代動物性蛋白源可以降低養殖動物血液中的膽固醇水平， 這主要與大豆中所含異黃酮有關（Tsai 和Huang，1999），此外，大豆蛋白水解產物也通過增強肝細胞中的LDL-R 轉錄來降低血液中的膽固醇水平（Cho 等，2007）。血漿谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶是肝細胞損傷的敏感指標（Boone等，2005）。 在日本鰻鱺中（李寧宇等，2020），以發酵豆粕替代魚粉， 其血清谷丙轉氨酶活性顯著降低。 在卵形鯧鲹（李秀玲等，2019）、花鱸（Rahimnejad 等，2021）、梭魚（祝焱彬等，2018）中發現，血清谷丙轉氨酶活性隨發酵豆粕添加量的增加而上升，但低劑量組與對照組無顯著差異。 本研究中，添加發酵豆粕降低了湘云鯽血漿谷丙轉氨酶活性， 與上述研究結果相一致， 表明飼料中添加12%發酵豆粕不會對湘云鯽肝臟造成損傷， 肝臟H＆E 染色切片的結果也說明了這一點。

溶菌酶和免疫球蛋白在非特異性免疫和特異性免疫方面發揮了重要作用 （Yu 等，2018；Zhao等，2014）。 溶菌酶可以降解革蘭氏陰性菌的細胞壁，是先天免疫的重要組成部分（Ghanei-Motlagh等，2021）。 硬骨魚體液中的免疫球蛋白M 是特異性免疫系統的主要組成部分，可以作為魚類免疫應答的重要標志物 （Chen 等，2013；Dominguez 等，2004）。有研究表明，豆粕經發酵產生的低分子量肽和氨基酸可以增強機體的免疫功能 （Li 等，2021；Zhuo 等，2014）。 本試驗中，添加發酵豆粕提高了湘云鯽血漿溶菌酶活性以及IgM 含量，表明發酵豆粕可以提高湘云鯽的免疫能力。 這與在日本鱸魚（Rahimnejad 等，2019）、 凡納濱對蝦 （劉韜等，2022）、異育銀鯽（陳萱等，2005）、黑鯛（彭翔等，2012）中的結果一致。另外，發酵豆粕中包含的微生物可以作為益生菌來增強魚類的免疫反應（Zhou等，2010）。

4 小結

綜上，在等氮等脂等賴氨酸等蛋氨酸前提下，以12%發酵豆粕替代飼料中部分魚粉和豆粕，可在不影響湘云鯽幼魚生長性能及飼料利用的前提下，提高湘云鯽肌肉蛋白質含量，促進脂質代謝，增強免疫機能。