高效液相色譜-熒光法測定飼料中維生素B1 和維生素B2

唐 雯， 黃 媛

（福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350015）

作為飼料添加劑， 維生素B1和維生素B2對養殖業具有至關重要的作用。 維生素B1參與營養代謝，影響動物心腦功能，同時對神經系統也有重要作用（王仁華等，2016；王寶維等，2014）。維生素B2是促進生長發育， 維持機體健康的必需微量營養物質，對禽類產蛋性能等具有很大影響（徐蕾蕾等，2019；張海濤等，2017）。因此，飼料中維生素B1和維生素B2含量的測定，對養殖業投料多寡具有極大參考價值。 目前，對其分析測定的方法主要有分光光度法（江蔓等，2016；郭亞東等，2004；李松青等，2001）、微生物法（Salvetti等，2003）、高效液相色譜法（嚴華等，2022；索德成等，2015；崔容等，2005）等。 分光光度法、微生物法都存在操作復雜，檢測耗時長的缺點。 而高效液相色譜法具有高效、快速、準確的特點，尤為適用于對飼料中維生素B1、維生素B2的測定。運用高效液相色譜法測定飼料中維生素B1、維生素B2的研究較多，但對其二者的測定方法多為紫外檢測 （張憬等，2018； 梁琳等，2016； 吳淑君，2002），且樣品前處理多采用提取液超聲提?。ǚ鹑A等，2017；邢磊等，2016）。 維生素B1的紫外吸收較弱，紫外響應小，干擾大，對儀器的性能要求高， 且對含量較低的樣品測定準確度降低；維生素B1和維生素B2的提取液不同（國家市場監督管理總局，2019； 國家市場監督管理總局，2018）， 導致同一樣品需要分批處理， 工作量增大，不利于工作的開展。 本方法利用高溫高壓法對飼料進行提取， 隨后對維生素B1進行衍生化操作，統一兩者流動相，運用熒光法測定維生素B1和維生素B2， 旨在為飼料中維生素B1和維生素B2含量監控測定提供有效保障。

1 材料與方法

1.1 儀器超高效液相色譜儀Waters ARC HPLC（配熒光檢測器），美國Waters 公司；壓力蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；Sartorius BSA 224S 電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；高速臺式離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；IKA MS 3 basic 單發渦旋振蕩器，上海滬粵明科學儀器有限公司。

1.2 試劑 維生素B1（99.09%， 斯坦福分析化學）、維生素B2（97.36%，德國DR）；甲醇、乙酸鈉、鹽酸、正丁醇、鐵氰化鉀（分析純，上海滬試化工有限公司）；氫氧化鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。 實驗用水為一級水。

1.3 色譜條件 色譜柱：中譜紅RD-C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L 乙酸鈉-甲醇=65∶35（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫： 35 ℃；檢測器：熒光檢測器；進樣量： 10 μL；波長：維生素B1（激發波長375 nm、發射波長435 nm）；維生素B2（激發波長462 nm、發射波長522 nm）。

1.4 標準溶液配制及測定 維生素B1儲備液：準確稱取維生素B1標準品0.02 g， 用0.01 mol/mL鹽酸溶液定容至25 mL。 維生素B2儲備液：準確稱取維生素B2標準品0.01 g， 用0.01 mol/mL 鹽酸溶液定容至100 mL。維生素B1、維生素B2混合中間液： 準確移取維生素B1儲備液1.00 mL，維生素B2儲備液10.00 mL，用0.01 mol/mL 鹽酸溶液定容至100 mL。維生素B1、維生素B2標準溶液圖譜見圖1 和圖2。

圖1 0.30 μg/mL 維生素B1標準溶液（衍生后）色譜圖

圖2 0.50 μg/mL 維生素B2 標準溶液色譜圖

1.5 樣品制備及測定 前處理：稱取適量樣品置于150 mL 錐形瓶中， 加入1 mL 50% 鹽酸溶液，加入80 mL 水， 搖晃錐形瓶使樣品與水混合均勻。 將混合后的樣品置于高溫滅菌鍋中121 ℃高溫提取30 min。待樣品徹底冷卻后，用150 g/L 氫氧化鉀溶液調節樣品pH 為5 ～6。 用水將樣品轉移并定容至250 mL 容量瓶，作為備用液。

維生素B1測定：取備用液2.0 mL 于試管中，加入1.0 mL 2 mg/mL 堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混合10 s，加入5 mL 正丁醇萃取，渦旋混合10 s，靜置5 min。 取上層溶液1000 r/min 離心3 min 后，吸取上層清液上機測定。 另取標準溶液同法衍生后上機。

維生素B2測定： 取備用液過0.45 μm 濾膜后，上機測試。

2 結果與分析

2.1 線性關系及范圍 取混合中間液0.200、1.00、2.00、10.0、20.0 mL，分別用水定容至50 mL。配制為標準溶液工作曲線。 色譜結果以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，計算得到線性范圍、回歸方程、相關系數（表1）。

表1 維生素B1、維生素B2 回歸方程及線性范圍

2.2 方法檢出限及定量限 以3 倍信噪比（S/N）作為方法檢出限，以10 倍信噪比（S/N）作為方法定量限，維生素B1的檢出限為0.04 mg/kg，定量限為0.15 mg/kg；維生素B2的檢出限為0.06 mg/kg，定量限為0.18 mg/kg。

2.3 加標回收 選取已知維生素B1、 維生素B2含量的飼料為基質， 分別進行不同水平的加標回收實驗，各加標水平重復6 次實驗，維生素B1、維生素B2的平均回收率均大于90%，RSD 均小于2.5%（表2）。

表2 飼料基質中維生素B1、維生素B2加標回收結果（n=6）

3 討論

本方法與國標法的對比結果表明，國標法測定維生素B1需要根據不同的飼料類型選用不同的提取液，且配制步驟復雜，需進行pH 調節，無疑增加前處理時間，增大測試工作量。 市面上，飼料多為同時添加維生素B1、維生素B2，而國標法選用兩種方法對其進行測定， 選用不同流動相，進一步增加測試時間。 本方法選用水作為提取液，同時提取維生素B1、維生素B2，用統一的流動相， 統一的檢測方法， 大大縮短前處理時間，儀器準備時間，簡化色譜條件，從根本上提高檢測效率。

對低于15 mg/kg 的低含量飼料， 如配合飼料（梁玉樹等，2016；莫彩娜等，2015），國標法無法得到準確結果。 本方法因遠低于國標法的檢出限、定量限，可應用于各水平含量的飼料測定工作。 國標法因采用紫外檢測器分析，對上機工作液的純凈度有較高的要求， 需通過不同提取液來滿足絡合重金屬、沉淀蛋白質等除雜要求，以期得到不受干擾的色譜結果。 特別要注意的是，維生素B1的紫外吸收響應低，即使選用特定提取液提取， 對含量低的飼料依然無法完全消除雜質對色譜結果的干擾， 給測定結果帶來不確定性（圖3、圖4）。 本方法則直接選用熒光檢測器，選擇性更強，靈敏度更高，所得色譜結果不受雜質干擾，能夠得到更加準確的測定結果。本方法與國標法方法比對結果見表3。

表3 本方法與國標法方法比對結果

圖3 低含量飼料維生素B1 紫外色譜圖

圖4 低含量飼料維生素B2 紫外色譜圖

為進一步確定該方法結果是否符合要求，取6 份具有代表性的飼料，分別進行本方法及國標法測定，對兩者結果進行比較。結果見表4，本方法與國標法維生素B1、 維生素B2測定值比較相對偏差均小于5%，符合國標法規定的相對偏差不大于5% 的要求。

表4 本方法與國標法比對結果及相對偏差

4 結論

本文建立了高效液相色譜-熒光法測定飼料中維生素B1、維生素B2的方法。 本方法采用高溫高壓法進行樣品前處理，對維生素B1進行衍生化處理，最終采用熒光法測定。 本方法無需配制特定提取液，使用統一的流動相，在同臺儀器上測定，簡化了樣品前處理過程，進一步縮短了儀器準備時間，優化了色譜條件，提高了檢測效率。 熒光法因其更加靈敏的特點，擴大了飼料含量測定范圍。 色譜結果表明，本方法回收率大于90%，能滿足分別在5、 7 min 內完成對維生素B1、維生素B2的測定，適用于所有類型的飼料檢測工作。 為測定維生素B1、維生素B2提供了一種簡單、高效、準確的方法，對國標法進一步擴大檢測范圍，提高檢測效率具有現實意義。