超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定禽用飼料中蘇丹紅、羅丹明B和酸性橙II 等6 種染色劑含量

李 宏， 賀習文 ， 晁娟娟， 李 俊， 武治勇， 楊 森

（1.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站，陜西 西安 710016；2.陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測股份有限公司，陜西 渭南 714000；3.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081；4.漢中市動物疫病預防控制中心，陜西 漢中 723000 ）

蘇丹紅是一種人工合成的工業(yè)染料，主要有蘇丹紅I、II、III、IV 四種。 蘇丹紅的成分中含有萘，該物質(zhì)具有偶氮結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)決定了蘇丹紅具有致癌性，且對肝腎器官具有很強的毒性作用（高敏國等，2023；周向麗，2022；張琴等，2021）。 國際癌癥研究機構(gòu)將蘇丹紅列為三類致癌物，其部分次級代謝產(chǎn)物被列為二級致癌物（欒慶祥等，2021）。 在我國蘇丹紅被禁止作為食品添加劑， 并相繼出臺了食品、化妝品、 飼料等基質(zhì)中蘇丹紅的檢測標準（GB/T29663 -2013，2013；NY/T 1258 -2007，2007；GB/T 19681-2005，2005）。 羅丹明B 又稱玫瑰紅B，是一種人工合成的染料，在老鼠試驗中發(fā)現(xiàn)，羅丹明B會誘發(fā)皮下組織生肉瘤，被證實具有致癌性。 羅丹明B 在歐洲和我國都屬于非法添加劑，除了具有致癌作用外，還具有損害眼睛、呼吸道、皮膚等危害，對人和動物的神經(jīng)和生殖發(fā)育具有毒害作用（王偉霞等，2016；咸瑞卿等，2013）。酸性橙II 是一種化工染料，同時屬于一種指示劑，用于組織切片的染色。酸性橙II 屬于非食用色素，食品中禁止添加，人食用后會引起食物中毒，長期食用會致癌（鄒康平等，2021；趙智鋒等，2013；曾泳艇等，2012）。

蘇丹紅、 羅丹明B 和酸性橙II 具有色澤鮮艷、著色力強、價格低廉等特點，一些不法商販將這些染色劑非法加入食品、 蛋糕、 辣椒面等商品中，通過提高色澤牟利。而將這些染色劑添加在禽用飼料中，會在禽類動物體內(nèi)富集，使其產(chǎn)下的蛋中蛋黃呈現(xiàn)紅色而吸引消費者（劉寧等，2006）。由于這類染色劑對人體會造成極大的危害， 因此建立禽用飼料中蘇丹紅、羅丹明B 和酸性橙II 的檢測方法很有必要。

目前，檢測蘇丹紅、羅丹明B 和酸性橙II 的方法主要有高效液相色譜法（朱潔靈等，2022；陳潔，2021；曹濤等，2013）、分光光度法（王群，2014；占達東等，2006）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（曹美萍等，2021；梁偉龍等，2020；李首道等，2019），其中分光光度法的相關報道較少，且檢出限較高，適用性較差。高效液相色譜法具有操作簡單，使用成本低等特點， 但同樣具有靈敏度低， 易受干擾等缺點。 本研究采用UPLC-MS/MS 法，具有定性準確，靈敏度高，檢測效率高等優(yōu)點。 此外，已有的報道顯示，有能夠同時測定蘇丹紅、羅丹明B 和酸性橙II 的檢測方法，但多集中在肉制品、辣椒類調(diào)味品中（劉翰升，2016；林清荷，2014；張劍鋒等，2013）， 鮮見同時測定飼料中此6 種物質(zhì)的UPLC-MS/MS 法的報道，本研究考察了飼料基質(zhì)中6 種染色劑的提取、凈化和基質(zhì)效應等，旨在建立高效準確的UPLC-MS/MS 方法，為飼料中這類染色劑的監(jiān)督檢驗提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及材料 Ultimate 3000 型高效液相色譜系統(tǒng) （Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；TSQ Quantiva 三重四級桿質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific 公司， 美國）；H1850 型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；MS205DU型十萬分之一天平 （Mettler Toledo 公司）；CP224C 型； 萬分之一天平 （奧豪斯儀器有限公司，常州）；MX-S 型渦旋混合儀（大龍興創(chuàng)儀器股份有限公司， 北京）；SHZ-C 型往返式振蕩器（上海博訊）；MTN-4800A 型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV 標準物質(zhì)采購自Dr.Ehrenstorfer 公司，純度＞97.0%；羅丹明B、酸性橙II 采購自壇墨質(zhì)檢標準物質(zhì)中心，純度＞98.0%；乙腈（色譜純，美國Sigma 公司）；正己烷（色譜純，Oceanpak 公司）；乙酸乙酯（色譜純，Oceanpak 公司）；甲酸（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

ALN 固相萃取柱（中性氧化鋁填料）和C18固相萃取柱：200 mg/6 mL， 月旭科技有限公司；C18凈化材料（40 ～60 μm）：月旭科技有限公司；PSA 凈化材料（40 ～63 μm）：PuReagent Chemicals Inc 公司；中性氧化鋁凈化材料（40 ～60 μm）：月旭科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制 標準儲備液的配制：分別稱取6 種標準品1 mg 于10 mL 容量瓶中， 用乙腈溶解并定容至刻度， 配制成濃度為100 μg/mL的標準儲備液。

混合標準中間溶液的配制： 準確吸取蘇丹紅I、II、III、IV 和酸性橙II 標準儲備液各0.1 mL，羅丹明B 標準儲備液0.01 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度， 配制成蘇丹紅I、II、III、IV 和酸性橙II 濃度為1 μg/mL， 羅丹明B 濃度為0.1 μg/mL 的混合標準中間溶液。

標準工作溶液的配制： 吸取適量混合標準中間溶液， 用乙腈配制成蘇丹紅I、II、III、IV 和酸性橙II 濃度分別為2、5、10、50、100 ng/mL， 羅丹明B 濃度分別為0.2、0.5、1、5、10 ng/mL 系列標準工作溶液，備用。

1.3 前處理方法 提取： 稱取2.5 g （精確至0.0001 g）試樣于50 mL 離心管中，加入乙腈10 mL，渦旋1 min， 置于振蕩器上振蕩提取10 min，7000 r/min 離心3 min，將上清液倒入另一離心管中，作為備用液。

凈化：取3 mL 備用液于10 mL 離心管中，依次加入100 mg C18凈化材料和100 mg PSA 凈化材料，渦旋1 min，靜置10 min，上清液過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD C1850 mm×2.1 mm；柱溫：40 ℃；流動相：A 為10 mmol/L的乙酸銨溶液，B 為乙腈；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫程序：0 ～5 min，10%B ～90%B；5 ～8 min，90%B；8 ～8.1 min，90%B ～10%B；8.1 ～10 min，10%B；進樣量：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式： 正、 負離子掃描； 監(jiān)測方式： 多反應檢測（MRM）；噴霧電壓：正離子模式3500 V，負離子模式2500V； 鞘氣壓力：35 Arb； 輔助氣壓力：10 Arb；傳輸管溫度：350 ℃；霧化器溫度：350 ℃；各待測物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 目標化合物的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶液的考察 蘇丹紅不溶于水，易溶于乙腈、正己烷等有機試劑；羅丹明B 和酸性橙II易溶于水和乙醇等有機試劑。據(jù)此物理性質(zhì)，優(yōu)先考慮甲醇、乙腈、正己烷和乙酸乙酯作為提取液，按照1.3 中的前處理過程對四種有機試劑進行考察，選取某雞用預混料進行加標試驗，其中甲醇、乙腈提取液凈化后直接上機測試， 正己烷和乙酸乙酯經(jīng)氮氣吹干后用甲醇或乙腈復溶凈化后上機測試。試驗結(jié)果表明，乙腈作為提取液時回收率最高，6 種化合物均能達到90%以上（圖1）。

圖1 不同提取溶劑的添加回收率

再考察乙腈、0.1%甲酸乙腈和乙腈-水溶液的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈中引入甲酸后，酸性橙II 的回收率降低；采用乙腈-水溶液作為提取溶液時，四種蘇丹紅的回收率明顯降低，綜合考慮采用乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化方式的選擇 已有報道采用ALN 固相萃取柱對辣椒及其制品中蘇丹紅提取溶液進行凈化（詹克航等，2013），以及采用C18固相萃取柱對辣椒制品中蘇丹紅提取溶液凈化（王韋崗等，2017）。本研究測試了ALN 固相萃取柱和C18固相萃取柱在飼料中的凈化效果， 并未達到理想的凈化效果，其中C18柱需要將乙腈溶劑濃縮轉(zhuǎn)換為水相溶劑后進行凈化，6 種染料的回收率均大幅降低。

因此， 本研究考察了直接加入凈化材料吸附雜質(zhì)的方式凈化， 向凈化液中加入C18和PSA 兩種凈化材料，得到了很好的凈化效果，在保證回收率不受影響的同時，大幅縮短了凈化時間，提高了工作效率（圖2 ～圖4）。

圖2 未凈化的加標樣品總離子流圖

圖3 ALN 固相萃取柱凈化的加標樣品總離子流圖

圖4 C18+PSA 凈化的加標樣品總離子流圖

2.3 凈化材料的選擇 試驗分別考察了C18、PSA和ALN 三種凈化材料的凈化效果， 結(jié)果表明，C18凈化材料能夠凈化羅丹明B 色譜峰附近的雜質(zhì)峰，PSA 能夠有效凈化蘇丹紅III、IV 色譜峰附近的雜質(zhì)峰，ALN 則沒有明顯的凈化效果。 因此選用C18+PSA 的組合材料進行凈化。

試驗考察了不同質(zhì)量C18和PSA 的凈化效果，結(jié)果表明，當兩種吸附材料各稱取100 mg 時，凈化效果最佳， 稱取超過100 mg 時無明顯變化，考慮到凈化材料較為昂貴，為了節(jié)省成本，將兩種材料的質(zhì)量均定為100 mg。

2.4 色譜柱的考察 本研究采用Hypersil GOLD C1850 mm×2.1 mm，1.9 μm 和Hypersil GOLD C18100 mm×2.1 mm，1.9 μm 共2 款色譜柱進行測試。結(jié)果表明Hypersil GOLD C18100 mm×2.1 mm，1.9 μm的色譜柱出峰時間長， 難以體現(xiàn)UPLC 快速分離的優(yōu)勢，Hypersil GOLD C1850 mm×2.1 mm，1.9 μm的色譜柱分離時間適中， 且對四種蘇丹紅可以達到良好分離， 因此本試驗選用Hypersil GOLD C1850 mm×2.1 mm，1.9 μm 規(guī)格的C18色譜柱。

2.5 流動相的考察 由于同時采用正、負離子兩種掃描模式，因此考慮水相使用0.1%甲酸溶液和10 mmol/L 乙酸銨溶液兩種，試驗結(jié)果表明，0.1%甲酸溶液對酸性橙II 的靈敏度有抑制效果，10 mmol/L乙酸銨溶液對6 種化合物均有較好的靈敏度。

有機相常用的有甲醇或乙腈， 采用甲醇作為有機相時，由于提取溶劑為乙腈，進樣時由于兩種溶劑極性的差異，產(chǎn)生了較強的溶劑效應，其中酸性橙II 出現(xiàn)分叉現(xiàn)象，蘇丹紅III、IV 出現(xiàn)不同程度的拖尾現(xiàn)象，將有機相換成乙腈時，溶劑效應隨之消失，因此流動相選用10 mmol/L 乙酸銨+乙腈進行梯度洗脫。 6 種化合物及MRM 圖見圖5。

圖5 6 種化合物MRM 圖

2.6 柱溫度的考察 試驗考察了柱溫度分別為25、30、35、40 ℃和45 ℃時對目標化合物出峰時間和峰型的影響， 試驗結(jié)果表明， 柱溫度越高，6種化合物出峰時間越短， 當柱溫度設置為40 ℃時，6 種化合物均能保證在10 min 內(nèi)出峰， 考慮到柱溫箱的使用壽命，將柱溫定為40 ℃。

2.7 洗脫方式的選擇 由于四種蘇丹紅不溶于水的特性，采用等度洗脫時，需采用大比例的有機相進行洗脫， 這會造成酸性橙II 出峰時間過快，無法在色譜柱上有效保留。 采用梯度洗脫的方式， 洗脫四種蘇丹紅時逐漸增加有機相比例，從而達到很好的分離效果。圖6 為6 種化合物標準總離子流圖。

圖6 6 種化合物標準總離子流圖

2.8 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 將混合標準中間液注入質(zhì)譜儀，對目標化合物進行一級質(zhì)譜全掃描（Full Scan），在正、負離子掃描模式下，通過調(diào)節(jié)碰撞氣的大小，確認目標化合物的母離子（m/z）后進行二級質(zhì)譜的參數(shù)優(yōu)化。

通過調(diào)節(jié)碰撞能量、鞘氣和輔助氣等參數(shù)，調(diào)節(jié)碰撞能量的大小， 找出最大且穩(wěn)定的碎片離子作為定量離子， 選取響應值較大且穩(wěn)定的碎片離子作為定性離子。 同時優(yōu)化出最佳的錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)。 具體數(shù)據(jù)見表1。

2.9 基質(zhì)效應考察及方法線性范圍 本研究考察了6 種化合物在不同基質(zhì)的飼料中所產(chǎn)生的基質(zhì)效應， 通過向空白飼料樣品中添加標準溶液的方式，計算出各組分的添加回收率。試驗選用了禽類動物常用的配合飼料、 蛋白質(zhì)補充飼料和預混合飼料， 試驗表明，6 種化合物回收率均達到了90%以上，受基質(zhì)效應影響很小，因此不考慮采用基質(zhì)匹配標準曲線。

將混合標準中間溶液用乙腈稀釋成系列標準工作液，以濃度作為橫坐標，各組分峰面積作為縱坐標建立標準曲線，結(jié)果表明，各濃度與質(zhì)譜響應值間存在較好的線性關系， 相關系數(shù)R2均大于0.999，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 6 種藥物的線性范圍、線性方程和相關系數(shù)

2.10 方法靈敏度、 準確度和精密度 選取空白飼料樣品，添加適量混合標準溶液，按前處理步驟處理后上機測定，依據(jù)信噪比S/N＞3（按PtP 算）作為檢出限（LOD），依據(jù)信噪比S/N＞10（按PtP算）作為定量限（LOQ），確定本方法在飼料中蘇丹紅I、II、III、IV、 酸性橙II 檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg；羅丹明B 檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.1 μg/kg。

通過向空白樣品中加標的方式驗證方法的回收率和精密度，選用空白禽用配合飼料、蛋白質(zhì)補充飼料和預混合飼料各6 份， 在樣品中添加6 種化合物標準溶液（3 個不同濃度，每個濃度6 個平行），進行加標回收實驗，結(jié)果表明，方法回收率為90% ～110%，相對標準偏差＜10%，證明該方法在不同禽用飼料中檢測6 種化合物均有較好的準確度和精密度。 結(jié)果見表3。

表3 6 種化合物的添加濃度、回收率及精密度

2.11 實際樣品的測定 抽取了禽用配合飼料、蛋白質(zhì)補充飼料和預混合飼料各20 批進行了檢測，結(jié)果顯示，所抽檢的60 批樣品中，2 份樣品中檢出蘇丹紅III，分別為2.75 μg/kg 和11.2 μg/kg，其余化合物均未檢出。

3 結(jié)論

本研究基于UPLC-MS/MS 結(jié)合QuEChERS快速凈化方式， 建立了一種測定禽用飼料中6 種化工染料的定量分析方法。經(jīng)過實驗證明，本方法具有良好的穩(wěn)定性和重復性，且方法靈敏度高，具有較低的檢出限和定量限，同時具有快速、準確、成本低廉等優(yōu)點。 該方法滿足禽用飼料中蘇丹紅等6 種化工染料的分析要求， 為禽用飼料的質(zhì)量安全提供技術(shù)保障。