添加天然抗氧化劑對寵物罐頭空氣暴露后菌落總數及過氧化值的影響

張 至， 蔡 旋， 趙熠群， 趙 念， 周晨露， 陳 國

（1.上海農林職業技術學院，上海 201699；2.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；3.上海比瑞吉寵物用品有限公司，上海 201107）

寵物罐頭食品因其生產工藝能夠完全殺滅包裝內的微生物，且與外界空氣完全隔絕，在滅菌、密封等環節達到技術要求時， 罐內食物不會產生腐敗變質的問題（周立新等，2003）。但是犬貓采食罐頭環境復雜，常常是放置于容易揚塵的地面，或是容易接觸毛發等污染物的籠具內，且犬貓（尤其是貓）在采食時時常無法一次性吃完整個罐頭，而使得罐頭在高污染環境下暴露較長時間。 據筆者調研， 一些寵物主人會將罐頭放置在寵物進食的區域12 h 甚至更長，有些甚至是在感覺到罐頭散發異味時才予以丟棄。 寵物罐頭內含有較為豐富的營養成分，水分充足，極其適合微生物生長；寵物罐頭通常脂肪含量也較高， 在空氣中長時間暴露容易氧化變質。 變質的寵物食品被食用會對寵物健康造成不良影響（Leiva 等，2019）。

在膨化寵物食品中，包括維生素C（VC）、維生素E（VE）、茶多酚（TP）、迷迭香提取物在內的天然抗氧化劑受到消費者的認可。 抗氧化劑能夠抑制油脂的酸敗，減緩食物的變質過程；一些天然抗氧化劑還具有抑菌作用。 同時，也有研究表明，犬貓存在多種因素引起的氧化應激， 補充抗氧化劑能夠對犬貓健康起到積極的作用 （Hagen 等，2019；Beigh 等，2016；張玉蝶，2016）。 因此，本研究探討幾種常見天然抗氧化劑在罐頭加工工藝中的熱穩定性， 并分析添加不同濃度的天然抗氧化劑對狗糧罐頭在典型環境（狗舍、潔凈室內）暴露24 h 內變質程度的影響，以期為天然抗氧化劑在寵物罐頭中的添加提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 維生素C、維生素E、茶多酚由上海比瑞吉寵物用品有限公司提供， 迷迭香提取物（包括水溶性，REW；脂溶性，REO）由湖南先偉陽光生物科技有限公司提供。

試驗所用基礎罐頭由上海比瑞吉寵物用品有限公司提供，主要原料為牛肉、雞肉、青豆，罐頭不含有防腐劑及抗氧化劑成分。

DPPH 自由基和ABTS 自由基測定試劑盒，還原力測定試劑盒購自上海琮益科技有限公司；分析純丙酮、 乙醇及營養瓊脂培養基均購自國藥集團化學試劑有限公司； 過氧化值檢測試劑套裝購自北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 儀器與設備 高壓滅菌鍋購自上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；Sunrise 酶標儀購自奧地利Tecan 公司；雷磁PHS-3C pH 計購自上海儀電科學儀器股份有限公司； 全自動生化分析儀購自北京普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 五種天然抗氧化劑的高溫殺菌處理 維生素C、維生素E、茶多酚、脂溶性迷迭香提取物、水溶性迷迭香提取物配制成100 μg/mL 溶液， 然后稀釋至5 ～50 μg/mL。置于耐壓試管中，采用反式高壓滅菌鍋121 ℃濕熱滅菌30 min。 待恢復至室溫后取出，與未滅菌樣品一同進行抗氧化試驗。

1.3.2 滅菌前后天然抗氧化劑抗氧化能力比較滅菌前后天然抗氧化劑的DPPH 自由基、ABTS自由基清除能力及鐵離子還原能力均采用上海琮益科技有限公司生產的試劑盒測定， 測試操作按照說明書要求進行。

1.3.3 含不同抗氧化劑的罐頭制備 罐頭的制備由上海比瑞吉寵物用品股份有限公司代加工，為圓柱形馬口鐵罐頭，上蓋直徑83 mm，罐內食品凈含量160 g。 所有測試抗氧化劑隨維生素及微量元素一同加入，經工藝穩定性驗證，各成分在罐頭原料中分布均勻。 制備好的罐頭置于陰涼潔凈倉庫中存放，并于30 d 內開展空氣暴露試驗。

1.3.4 罐頭的空氣暴露 所有罐頭分別置于潔凈的室內（辦公室辦公桌上）和犬舍（上海市農林職業技術學院實訓基地） 中犬只接觸不到的地面，每處環境（辦公室或犬舍）分距離較遠的3 處擺放， 保持正常通風， 兩處場所均控制氣溫為（20±2）℃。

每2 h 取樣一次， 每次取樣時均采用無菌采樣袋從每個點立即進行菌落總數測定、pH 測定和樣品過氧化物值分析。

1.3.5 罐頭菌落總數的測定 罐頭各暴露時間段菌落總數按照GB 4789.2—2016 《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》 方法進行測定。

1.3.6 罐頭pH 的測定 罐頭各暴露時間段pH按照GB 5009.237—2016 《食品安全國家標準食品pH 的測定》方法進行測定。

1.3.7 罐頭過氧化值的測定 罐頭各暴露時間段過氧化值采用普析通用公司生產的試劑盒測定，操作參照說明書要求進行。

1.4 數據統計 試驗數據采用Excel 2019 進行初步計算和整理，采用SPSS 19.0 進行統計分析，數據表示為“平均值±標準差”形式。 滅菌前后抗氧化能力數據采用配對T 檢驗分析；其余數據利用單因子方差分析（One way ANOVA）進行差異顯著性檢驗，差異顯著水平為P＜0.05，差異顯著時采用LSD 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 天然抗氧化劑耐受濕熱滅菌的能力 如圖1所示， 經121 ℃濕熱滅菌后所有抗氧化劑的EC50均有上升， 其中VC、VE、REO、REW 的DPPH 自由基清除能力EC50顯著上升（P＜0.05）；TP、REO的ABTS 自由基清除能力EC50顯著上升 （P＜0.05）。其中濕熱滅菌前后TP 和REO 的EC50變化較大，TP 的DPPH 自由基清除EC50滅菌后提高29.31%，ABTS 自由基清除EC50滅菌后提高210.95%；REO 的DPPH 自由基清除EC50滅菌后提高296.64%，ABTS 自由基清除EC50滅菌后提高67.98%， 其余抗氧化劑滅菌前后DPPH 和ABTS 自由基清除EC50變化均小于7%。表明VC、VE、REW 耐受濕熱滅菌能力較好， 而TP 和REO在濕熱滅菌過程中抗氧化性能損失較大。

圖1 常見天然抗氧化劑濕熱滅菌前后抗氧化能力變化

2.2 添加天然抗氧化劑對犬罐頭空氣暴露后菌落總數的影響 如圖2、圖3 所示，與未添加抗氧化劑（對照）比較，添加了抗氧化劑的罐頭在空氣中暴露24 h 內菌落總數均顯著降低。 在空氣暴露中，隨時間的推遲，所有罐頭的菌落總數均有增加，但仍接近線性增長，提示在空氣暴露24 h后，罐頭內菌群尚未進入對數生長期。比較同一環境下相同抗氧化劑對菌落總數的抑制效果可知，高濃度的抗氧化劑（500 mg/kg）添加對罐頭中菌落的抑制優于低濃度抗氧化劑（100 mg/kg）；比較辦公室環境下不同抗氧化劑在試驗結束時（24 h）對菌落總數的抑制效果可知， 低劑量維生素C、維生素E 和脂溶性迷迭香提取物（REO）添加組空氣暴露24 h 后菌落總數接近 （4.3×104～4.7×104CFU）， 低于茶多酚和脂溶性迷迭香提取物（REW）添加組空氣暴露24 h 后菌落總數（7.2×104～7.7×104CFU）， 狗舍環境中低劑量抗氧化劑添加組對罐頭總菌數影響與辦公室類似，提示低劑量（100 mg/kg）維生素C、維生素E 和脂溶性迷迭香提取物添加抑菌效果優于茶多酚和脂溶性迷迭香提取物添加。本次試驗狗舍環境放置的罐頭24 h 后菌落總數均顯著高于辦公室環境（P＜0.05），但差異較小。

圖2 添加天然抗氧化劑對辦公室中放置成犬罐頭菌落總數的影響

圖3 添加天然抗氧化劑對犬舍中放置成犬罐頭菌落總數的影響

2.3 添加天然抗氧化劑對犬罐頭空氣暴露后pH的影響 如表1、表2 所示，犬罐頭空氣暴露24 h內pH 均尚無明顯變化， 這可能與罐頭菌落尚未對數增長有關。

表1 添加天然抗氧化劑對辦公室中放置成犬罐頭pH 的影響

表2 添加天然抗氧化劑對犬舍中放置成犬罐頭pH 的影響

2.4 添加天然抗氧化劑對犬罐頭空氣暴露后過氧化物值的影響 如圖4、圖5 所示，所有犬罐頭在空氣中暴露24 h 后過氧化值均有上升。但添加有抗氧化劑的犬糧罐頭所有時間段過氧化物值均低于對照組，高劑量（500 mg/kg）的抗氧化劑添加對罐頭的保護作用優于同種低劑量 （100 mg/kg）的抗氧化劑添加。比較辦公室環境中暴露24 h 后罐頭過氧化物值可知，維生素E 和茶多酚類似（P＞0.05）， 優于其余抗氧化劑：24 h 時所有添加低劑量抗氧化劑的罐頭過氧化物值大小順序為VC＞REO ＞REW ＞TP = VE（此處“=”表示平均值無顯著差異，P＞0.05，下同），所有添加高劑量抗氧化劑的罐頭過氧化物值大小順序為VC ＞REO ＞REW ＞VE = TP， 高低劑量不同抗氧化劑的保護能力順序完全一致； 比較犬舍環境中暴露24h 后罐頭過氧化物值可知，24 h 時所有添加低劑量抗氧化劑的罐頭過氧化物值大小順序為VC ＞REO＞REW ＞TP = VE， 所有添加高劑量抗氧化劑的罐頭過氧化物值大小順序為TP＞VC = REO ＞REW ＞VE，與犬舍環境中得到的結論略有不同，主要是茶多酚（TP）變化較大，其機理未知。 所有結果均提示在保護罐頭食品過氧化物產生方面，維生素E 是一種優良的天然抗氧化劑。

圖4 添加天然抗氧化劑對辦公室中放置成犬罐頭過氧化值的影響

3 討論

人類與寵物飲食方式的不同， 使得在罐頭食品采食時犬貓不能同人類一樣開蓋后即食用完畢，長期空氣暴露的罐頭極易滋生病菌，不僅造成寵物本身健康問題，還會散發惡臭，影響人類的居住環境。 采用一定的方式延長罐頭開蓋后的保質期， 避免罐頭食品過快腐敗能夠給寵物飼養帶來更好的體驗。

本研究選取兩個較有代表意義的環境進行測試，一是采用空調通風的辦公室環境，與居家環境類似；二是犬舍中犬只接觸不到的區域，與養殖寵物的家庭環境類似。 本研究發現兩種環境中菌落數增長相差不大， 犬舍環境中罐頭中菌落增長僅略高于辦公室環境，可能與犬舍經常消毒有關。本研究中，在24 h 觀測期內罐頭中的菌落均尚未進入對數生長期， 呈線性增長，24 h 時均超過1.0×105CFU/g，已高于我國熟肉制品的菌落總數要求（GB 2726-2016）上限，但符合GB16869-2005《鮮、凍禽產品》規定（菌落總數≤1.00×106CFU/g）。 目前鮮有24 h 內空氣暴露中罐頭食品菌落數變化的研究，劉夢竹等（2023）將稻香雞常溫（25 ℃）放置12 h 后菌落總數達到5.00×106CFU/g，24 h 后的菌落總數接近1.00×109CFU/g，與之不同的是，本研究中罐頭在開蓋前是無菌的， 且試驗溫度略低（20 ℃），因此菌群在罐頭中適應期較長，但可以預見，后期罐頭內細菌會快速增殖，進入對數生長期。 另外，本研究中罐頭均為環境中靜置，未經過犬貓舔舐。犬貓口腔中存在大量菌落，在舔舐過程中會帶入罐頭中，加速罐頭的變質。 因此，在現實環境中，罐頭內菌群會更快進入對數生長期。食品pH 的改變與其內產酸菌增長密切相關， 本研究中所有罐頭試驗期間pH 均未顯著改變， 與菌群增長尚未進入對數期有關。

犬貓罐頭為提高適口性，往往油脂含量較高，一些罐頭中脂肪含量可達30%以上 （陳國等，2021），油脂氧化會產生不愉快的哈喇味，犬貓的嗅覺極為靈敏（劉策等，2020），哈喇味的產生會給犬貓造成采食欲望的降低， 進一步導致罐頭食品采食周期延長。本研究數據表明，隨空氣暴露時間的延長，罐頭油脂表現出明顯的氧化現象；同時，本研究也表明不同抗氧化劑均能夠較好的抑制罐頭食品的油脂氧化， 提示在寵物罐頭食品中使用抗氧化劑的必要性。

罐頭食品加工工藝的特殊性使其必需將所有原料一起滅菌， 因此原料的耐高溫能力非常重要（劉策等，2022）。 DPPH 自由基和ABTS 自由基清除試驗是常見的評價化合物抗氧化能力的方法，因此本試驗比較了常見罐頭滅菌程序對飼料級維生素C、維生素E、茶多酚、脂溶性迷迭香提取物、水溶性迷迭香提取物滅菌前后的抗氧化能力。盡管有研究表明維生素C 在煮沸過程中損失可以高達75%（Leková 等，2006），油炸過程中維生素E 也有一定損失（Bramley 等，2000），但本研究發現維生素C 及維生素E 溶液在經過高壓滅菌30 min 后，其DPPH 和ABTS 自由基清除能力損失較小；在寵物飼料茶多酚一般是包含表沒食子兒茶素沒食子酸脂（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）、兒茶素（C）在內的一系列混合物， 迷迭香提取物分水溶性和脂溶性，水溶性產品主要成分是迷迭香酸，脂溶性產品主要成分是鼠尾草酸和鼠尾草酚（Xie 等，2017）。 目前有關熱穩定的報道較少，但有關茶多酚和迷迭香提取物保護高溫油脂有較多研究 （高浩祥等，2020；Guo 等，2016）。本研究發現水溶性迷迭香提取物耐濕熱滅菌能力較強，但茶多酚及脂溶性迷迭香提取物在滅菌后抗氧化能力損失較大。

4 結論

本研究結果提示，與維生素C、茶多酚、水溶性迷迭香提取物相比，維生素E、脂溶性迷迭香提取物在抑制罐頭油脂氧化、 抑制菌群生長方面均具有一定優勢， 但脂溶性迷迭香提取物熱穩定性仍需進一步論證。 因此綜合各項指標， 維生素E是一個較優的選擇。