香蕉枯萎和細(xì)菌性軟腐病菌的多重PCR檢測(cè)

蒲小明 張景欣 沈會(huì)芳 孫大元 劉平平 林壁潤(rùn) 楊祁云

摘要

香蕉枯萎病菌Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense和細(xì)菌性軟腐病菌Dickeya?zeae的復(fù)合侵染為害給香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)，有必要建立相關(guān)病害的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（multiplex?polymerase?chain?reaction，multiplex?PCR）檢測(cè)技術(shù)。本文基于尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種（F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?1，F(xiàn)OC1）基因組contig?438區(qū)間（35?631-37?693?bp）（GenBank：?AMGP01000438.1）和4號(hào)生理小種（F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?4，F(xiàn)OC4）基因組contig?195區(qū)間（4?028-6?126?bp）（GenBank：?AMGQ01000195.1）存在160?bp插入序列差異設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物FOCF/R，同時(shí)以香蕉細(xì)菌性軟腐病菌D.zeae的促旋酶B?亞單位基因（the?subunit?B?of?gyrase?gene）（GenBank：?JQ284039）序列設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物gyrBF/R。多重PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：本技術(shù)可在一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)內(nèi)同時(shí)檢測(cè)香蕉枯萎病菌1號(hào)、4號(hào)生理小種和細(xì)菌性軟腐病菌;?多重PCR的靈敏度結(jié)果表明：檢測(cè)香蕉枯萎病菌的DNA濃度最低限為0.1?ng/μL，細(xì)菌性軟腐病菌的靈敏度為103cfu/mL;檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。因此，本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法可有效應(yīng)用于檢測(cè)香蕉發(fā)病組織中的香蕉枯萎病菌和細(xì)菌性軟腐病菌，也可用于香蕉種苗和田間土壤帶病菌的監(jiān)測(cè)，為香蕉種植保駕護(hù)航。

關(guān)鍵詞

香蕉;?尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種;?尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種;?玉米迪基氏菌;多重PCR;?促旋酶B?亞單位基因

中圖分類號(hào)：

S?436.681

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022799

Detection?of?banana?Fusarium?wilt?and?bacterial?soft?rot?by?multiplex?PCR?amplification

PU?Xiaoming，?ZHANG?Jingxin，?SHEN?Huifang，?SUN?Dayuan，?LIU?Pingping，?LIN?Birun，?YANG?Qiyun*

（Institute?of?Plant?Protection，?Guangdong?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Green?Prevention?and?

Control?on?Fruits?and?Vegetables?in?South?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Guangdong?Provincial?

Key?Laboratory?of?High?Technology?for?Plant?Protection，?Guangzhou?510640，?China）

Abstract

The?diseases?caused?by?Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense?and?Dickeya?zeae?have?brought?serious?challenges?to?the?development?of?banana?industry，?and?it?is?necessary?to?develop?a?detection?method?by?multiplex?polymerase?chain?reaction?（multiplex?PCR）?technology?for?them.?The?specific?amplification?primers?for?the?molecular?multiplex?PCR?system?were?designed?as?followed：?FOCF/R?targeted?the?sequences?of?the?contig?438?（35?631-37?693?bp）?（GenBank：?AMGP01000438.1）?in?the?DNA?of?F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?1（FOC1）?and?the?contig?195（4?028-6?126?bp）?（GenBank：?AMGQ01000195.1）?in?the?DNA?of?F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?4?（FOC4），?and?there?was?a?difference?of?160?bp?between?FOC1?and?FOC4.?The?primers?gyrBF/R?were?designed?based?on?the?gene?sequence?（GenBank：?JQ284039）?in?D.zeae.?The?results?of?multiplex?PCR?showed?that?this?technology?could?simultaneously?detect?FOC1，?FOC4?and?D.zeae?in?one?PCR?amplification?reaction.?Moreover，?the?minimum?limit?of?DNA?concentration?for?detection?of?F.oxysporum?f.sp.?cubense?was?0.1?ng/μL，?and?the?sensitivity?for?detecting?D.zeae?was?103cfu/mL.?The?detection?results?were?stable?and?reliable.?Therefore，?the?multiplex?PCR?detection?method?can?be?effectively?used?to?detect?F.oxysporum?f.sp.?cubense?and?D.zeae?in?infected?banana?plant?tissues，?and?can?also?be?used?to?monitor?banana?seedling?and?soilborne?pathogens?in?the?field，?which?provides?a?useful?tool?for?safe?planting?of?banana.

Key?words

banana;?Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense?race?1;?Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense?race?4;?Dickeya?zeae;?multiplex?PCR;?gyrB?gene

香蕉是我國(guó)熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)鄉(xiāng)村振興方面發(fā)揮重要作用。香蕉枯萎病在20世紀(jì)60-70年代在廣東和廣西已局部發(fā)生，王碧青等報(bào)道1985年-1987年采集的42個(gè)香蕉植株發(fā)病樣本均分離出鐮刀菌，形態(tài)特征鑒定確定其均為尖孢鐮刀菌古巴專化型Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense［1］。Zhang等首次報(bào)道在廣州市番禺區(qū)細(xì)菌性軟腐病發(fā)病香蕉植株中分離鑒定出病原菌為玉米迪基氏菌Dickeya?zea［2］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病菌和香蕉細(xì)菌性軟腐病菌存在復(fù)合侵染現(xiàn)象。玉米迪基氏菌被證明是一種重要的病原細(xì)菌，侵染水稻［3］、菠蘿［4］、玉米［5］、蕉芋?Canna?edulis［6］、甘蔗［7］等多種植物引起軟腐病害。香蕉枯萎病菌和細(xì)菌性軟腐病菌都具有一定的潛伏期，常在生長(zhǎng)半年以上的香蕉植株或在果穗期表現(xiàn)出明顯發(fā)病癥狀，造成整株軟腐枯死，導(dǎo)致香蕉嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。

建立有效的香蕉病害預(yù)警監(jiān)測(cè)技術(shù)并及時(shí)進(jìn)行防控，是控制和降低香蕉枯萎病和軟腐病為害率的關(guān)鍵手段。這兩種病害均為系統(tǒng)性侵染病害，一般從根部和蟲傷口侵染為害，潛伏期間植株無(wú)發(fā)病癥狀，一般采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)病菌，如DNA?指紋圖譜［8］、常規(guī)PCR［910］、實(shí)時(shí)熒光定量PCR［1112］、loopmediated?isothermal?amplification（LAMP）［1314］等。PCR是目前采用最普遍的病原菌鑒定方法，靈敏度高，可靠性強(qiáng)。目前國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于同時(shí)檢測(cè)香蕉枯萎病和細(xì)菌性軟腐病的多重PCR檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道。本文基于尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種（F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?1，F(xiàn)OC1）基因組contig?438區(qū)間（35?631-37?693?bp）（GenBank：?AMGP01000438.1）［15］和4號(hào)生理小種（F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?4，F(xiàn)OC4）基因組contig?195區(qū)間（4?028-6?126?bp）（GenBank：?AMGQ01000195.1）［15］存在160?bp插入序列差異以及玉米迪基氏菌基因組［16］中的促旋酶B?亞單位基因（gyrB，?GenBank：?JQ284039）［17］等設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增特異基因片段，依據(jù)擴(kuò)增片段大小區(qū)分病原菌種類，從而實(shí)現(xiàn)在一個(gè)PCR體系中同時(shí)檢測(cè)香蕉病害的多個(gè)病原菌，提高檢測(cè)效率，為香蕉病害預(yù)警預(yù)防提供技術(shù)支撐。

1?材料與方法

1.1?供試菌株

供試的尖孢鐮刀菌Fusarium?oxysporum不同專化型和迪基氏菌屬Dickeya?sp.不同種分離自不同寄主植物，其他屬菌株為分離自發(fā)病植物或?yàn)槌Ｒ?guī)試驗(yàn)菌株，具體見表1。

1.2?特異性引物設(shè)計(jì)

尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)和4號(hào)生理小種基因組的種間存在插入序列大小差異，即F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?1（FOC1）?contig438?（GenBank：?AMGP01000438.1）［15］和?F.oxysporum?f.sp.?cubense?race?4（FOC4）?contig195?（GenBank：?AMGQ01000195.1）［15］序列比較，F(xiàn)OC4比FOC1多160?bp左右的插入片段，在該片段兩側(cè)延伸序列設(shè)計(jì)合適引物，獲得引物FOCF/R。

根據(jù)Dickeya?zeae?MS1的gyrB?基因序列（GenBank：?JQ284039）［17］，比較近似屬細(xì)菌的gyrB?基因序列，在Dickeya保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，最終獲得引物gyrBF/R。引物序列如表2所示。

1.3?真菌DNA提取

供試真菌菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，26～28℃培養(yǎng)72?h，過濾取菌絲體，加液氮磨成粉末，采用CTAB法［18］提取真菌基因組DNA，?-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4?多重PCR擴(kuò)增

1.4.1?特異性分析

采用引物FOCF/R和gyrBF/R復(fù)合擴(kuò)增不同供試真菌DNA和細(xì)菌菌液，分析引物擴(kuò)增特異性。多重PCR擴(kuò)增體系為：TaKaRa?2×Premix?TaqTM?10?μL，引物FOCF/R和gyrBF/R各0.4?μL，模板（DNA或菌液）1?μL，DNaseFree?water?（無(wú)DNA酶水）?補(bǔ)足至20?μL。儀器BIORAD?T100TM?Thermal?Cycler的PCR反應(yīng)條件：?94℃預(yù)變性5?min;94℃變性30?s，56℃退火30?s，72℃延伸60?s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10?min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4.2?靈敏度檢測(cè)

香蕉枯萎病菌DNA按10倍梯度稀釋得到102～10-7ng/μL系列濃度，香蕉細(xì)菌性軟腐病菌菌液按10倍梯度稀釋得到108～10-1cfu/mL系列濃度。采用多重PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行靈敏度分析，PCR擴(kuò)增反應(yīng)同1.4.1。

1.5?含菌土壤的檢測(cè)

將菌株FOC1或FOC4的分生孢子制成104?cfu/mL孢子懸浮液，將菌株MS1菌液制成104?cfu/mL菌懸液。稱取10份滅菌土，每份100?g，其中2份分別加入2?mL菌株FOC1孢子懸浮液、2份分別加入?2?mL?菌株FOC4孢子懸浮液、2份分別加入2?mL菌株MS1菌懸液、1份加入2?mL菌株FOC1孢子懸浮液+2?mL菌株MS1菌懸液、1份加入2?mL菌株FOC4孢子懸浮液+2?mL菌株MS1菌懸液、1份加入2?mL菌株FOC1孢子懸浮液+2?mL菌株FOC4孢子懸浮液、1份無(wú)菌土加入2?mL無(wú)菌水，充分?jǐn)嚢杈鶆颉Ｓ肊.Z.N.A?Soil?DNA?kit（OMEGA）提取土壤總DNA，?-20℃保存?zhèn)溆谩２捎靡颋OCF/R和gyrBF/R?擴(kuò)增上述樣品DNA。PCR?擴(kuò)增反應(yīng)同1.4.1。

1.6?田間發(fā)病植株分析

在廣州市東涌、萬(wàn)頃沙、新墾、朱村、欖核、大崗等鎮(zhèn)采集樣品，每個(gè)鎮(zhèn)取3～5株發(fā)病植株的假莖組織，切碎后用液氮磨成粉末，采用CTAB法［18］提取總DNA，?-20℃保存?zhèn)溆谩２捎靡颋OCF/R和gyrBF/R?擴(kuò)增樣品DNA。PCR?擴(kuò)增反應(yīng)同1.4.1。

選取香蕉假莖的病健交界處組織進(jìn)行病原菌分離，提取病原菌DNA。以該DNA為模板，使用真菌ITS保守引物ITS4和ITS5，細(xì)菌16S?rDNA通用引物27f和1492r，擴(kuò)增相應(yīng)的保守基因序列，測(cè)序并進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2?結(jié)果與分析

2.1?引物特異性分析

多重PCR檢測(cè)不同真菌基因組的特異性結(jié)果如圖1所示。多重PCR體系僅特異性

擴(kuò)增出尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)和4號(hào)生理小種基因組中的特異片段，而其他19種不同真菌基因組DNA均未擴(kuò)增出條帶（圖a）;圖1b顯示多重PCR體系在尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種基因組中擴(kuò)增出796?bp的條帶，而在尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種和其他尖孢鐮刀菌菌株基因組中擴(kuò)增出636?bp條帶，說(shuō)明多重PCR體系在尖孢鐮刀菌菌株中能特異性擴(kuò)增出尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種，由于香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)和4號(hào)生理小種僅侵染香蕉植株，因此該多重PCR擴(kuò)增體系適用于香蕉發(fā)病組織中檢測(cè)香蕉枯萎病菌。

多重PCR檢測(cè)不同細(xì)菌的特異性結(jié)果如圖2所示。在迪基氏菌屬細(xì)菌內(nèi)不同菌株中均能擴(kuò)增出218?bp條帶，但在其他15個(gè)不同屬菌株中均不能擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明此多重PCR檢測(cè)能在迪基氏菌屬內(nèi)特異擴(kuò)增，也能有效實(shí)現(xiàn)香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的檢測(cè)。

香蕉枯萎病菌和香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的多重PCR檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種、尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種和香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的單獨(dú)擴(kuò)增和兩兩混合擴(kuò)增，所得到的特異條帶清晰，無(wú)雜帶，說(shuō)明基于引物FOCF/R和gyrBF/R復(fù)合的多重PCR檢測(cè)體系可靠。

2.2?多重PCR靈敏度分析

多重PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明（圖4）：10-1～102等4個(gè)濃度的DNA模板均有相應(yīng)的擴(kuò)增帶，10-7～10-2?ng/μL濃度的模板及陰性對(duì)照等均沒有擴(kuò)增，表明該多重檢測(cè)體系可檢測(cè)到香蕉枯萎病菌DNA的含量下限為0.1?ng/μL。

多重PCR檢測(cè)體系檢測(cè)玉米迪基氏菌D.zeae的靈敏度結(jié)果表明（圖5）：103～108?cfu/mL?6個(gè)濃度DNA模板均有相應(yīng)的擴(kuò)增帶，10-1～102?cfu/mL濃度菌液的模板及陰性對(duì)照等均沒有擴(kuò)增，表明該多重檢測(cè)體系可檢測(cè)到的細(xì)菌含量下限為103?cfu/mL。

2.3?含菌土壤檢測(cè)

以土壤總DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)（圖6）。結(jié)果表明：在拌菌土壤檢測(cè)中，土壤拌尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種、尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種和香蕉細(xì)菌性軟腐病菌處理的PCR產(chǎn)物分別呈現(xiàn)636、796?bp和218?bp條帶，均符合相應(yīng)菌株的目的條帶;土壤拌兩種菌處理的PCR產(chǎn)物則分別呈現(xiàn)636?bp和218?bp復(fù)合條帶、796?bp和218?bp復(fù)合條帶、636?bp和796?bp復(fù)合條帶，同樣符合土壤所拌菌株的目的條帶，表明此多重PCR檢測(cè)體系可有效檢測(cè)出土壤中含香蕉枯萎病菌和細(xì)菌性軟腐病菌。

2.4?田間樣品檢測(cè)

采集廣州市主要香蕉種植區(qū)的田間香蕉患病組織，嚴(yán)重發(fā)病香蕉假莖橫截面見圖7，截面大部分呈現(xiàn)紫色或褐色，其中部分假莖中心點(diǎn)出現(xiàn)褐色軟腐。采用本文的多重PCR檢測(cè)體系對(duì)發(fā)病組織進(jìn)行病原菌的檢測(cè)，結(jié)果表明（圖8）：廣州市主要鎮(zhèn)地區(qū)采集的香蕉植株發(fā)病組織均能檢測(cè)出玉米迪基氏菌D.zeae相應(yīng)的特異條帶（218?bp）;在東涌、萬(wàn)頃沙、新墾、朱村等地采集的香蕉病樣均能擴(kuò)增出FOC4對(duì)應(yīng)的特異條帶（796?bp），在欖核、大崗、萬(wàn)頃沙、新墾、朱村等鎮(zhèn)粉蕉病樣均能擴(kuò)增出FOC1對(duì)應(yīng)的特異條帶（636?bp）;表明這些地區(qū)的病株受到香蕉枯萎病菌和細(xì)菌性軟腐病菌復(fù)合侵染。

香蕉發(fā)病植株分離的病原菌保守序列分析結(jié)果表明，所有引起植株發(fā)病的病原菌均與多重PCR檢測(cè)的結(jié)果一致。

3?結(jié)論與討論

本研究建立的多重PCR檢測(cè)體系是在一個(gè)PCR?反應(yīng)體系中加入2對(duì)特異引物FOCF/R和gyrBF/R，可以同時(shí)擴(kuò)增出尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種、4號(hào)生理小種和玉米迪基氏菌的特異片段，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率等優(yōu)點(diǎn)［19］。尖孢鐮刀菌對(duì)不同作物品種具有專性寄生而致病的特點(diǎn)，所以尖孢鐮刀菌被進(jìn)一步分為不同專化型生理小種，傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定和保守基因片段很難區(qū)分［20］。本研究基于尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種、4號(hào)生理小種基因組種間存在區(qū)域片段的插入序列差異，從而設(shè)計(jì)出1對(duì)特異引物，通過擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不同來(lái)區(qū)別香蕉枯萎病菌的2個(gè)生理小種，具有應(yīng)用價(jià)值。香蕉細(xì)菌性軟腐病病原菌為玉米迪基氏菌Dickeya?zeae，?gyrB基因在迪基氏屬內(nèi)具有保守性，而侵染香蕉導(dǎo)致發(fā)病的只有玉米迪基氏菌，即在香蕉發(fā)病組織中g(shù)yrB基因可以作為檢測(cè)香蕉細(xì)菌性軟腐病病菌的靶標(biāo)基因。本研究也是基于田間種植過程中，發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病菌和細(xì)菌性軟腐病菌可復(fù)合侵染，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道僅限于尖孢鐮刀菌古巴專化型［2124］和迪基氏細(xì)菌［2528］?的單獨(dú)檢測(cè)技術(shù)，但僅檢測(cè)其中一種病原菌無(wú)法提供精準(zhǔn)的香蕉病害預(yù)警防控技術(shù)指導(dǎo)，本文建立的檢測(cè)技術(shù)彌補(bǔ)了相關(guān)技術(shù)空白。

本文建立的香蕉枯萎病菌和細(xì)菌性軟腐病菌的多重PCR檢測(cè)技術(shù)可有效用于檢測(cè)香蕉患病組織中病菌種類，進(jìn)而應(yīng)用于香蕉種苗檢疫、田間香蕉病害的早期診斷以及田間土壤帶病菌的監(jiān)測(cè)和鑒定，有效防止香蕉枯萎病和細(xì)菌性軟腐病的擴(kuò)散與蔓延，保障香蕉安全生產(chǎn)。

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