多糖添加量對玉米醇溶蛋白-葡聚糖接枝物理化特性的影響

摘要：玉米醇溶蛋白（Zein）因水溶性差等問題，限制了其應用。為了解決這一問題，對其糖基化改性，通過接入多糖來改善它的功能特性，擴大其應用范圍。采用美拉德濕法利用葡聚糖（DX）對Zein進行糖基化改性，研究不同DX添加量（蛋白、多糖質量比分別為4：1、2：1、1：1和1：2）對Zein改性的影響，通過接枝率、FTIR、溶解度和乳化性等指標對美拉德接枝物的結構和性質進行表征。糖基化改性后，Zein的溶解性、分散性、乳化性等均有較大改善，且改善效果與DX添加量呈正相關。利用美拉德反應DX能與Zein共價連接，親水性多糖的接入能顯著改善Zein的溶解性和乳化性等功能特性，是改善Zein理化特性的有效方法。

關鍵詞：玉米醇溶蛋白；葡聚糖；美拉德反應；理化特性

中圖分類號：TS201.2 文獻標志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240524

基金項目：沈陽市糧油深加工重點實驗室課題基金資助（2023002）。

Effect of polysaccharide addition on physicochemical properties of zein - dextran grafts

Wang Dexiong，Xiao Zhigang，Zhang Yifan， Li Jianan， Zhu Minpeng

（College of Grain Science / Shenyang Key Laboratory of Grain and Oil Deep Processing， Shenyang Normal University， Shenyang， Liaoning 110034）

Abstract： The application of zein was limited due to its poor water solubility. In order to solve this problem， the glycosylation of zein was modified to improve its functional properties and expand its application range by adding polysaccharide. The glycosylation of zein was carried out using dextran （DX） by Maillard method， and the effects of different DX supplemental levels （protein， polysaccharide mass ratio 4：1， 2：1， 1：1 and 1：2， respectively） on zein modification were studied. The structure and properties of Maillard grafts were characterized by grafting rate， FTIR， solubility and emulsification. After glycosylation， solubility， dispersion， emulsification properties of zein were greatly improved， and the improvement effect was positively correlated with the added amount of DX. The addition of hydrophilic polysaccharide can significantly improve the solubility and emulsification of zein， which is an effective method to improve the physicochemical properties of zein.

Key words： zein； glucan； Maillard reaction； physicochemical properties

玉米醇溶蛋白（Zein）是從玉米胚乳中提取出的醇溶性蛋白，是玉米加工副產物玉米黃粉中的主要蛋白質，因其低經濟成本，良好的生物降解性和生物相容性，成為流行且用途廣泛的生物聚合物之一[1]。同時Zein還是美國食品藥品監督管理局（FDA）批準口服使用的少數非親水蛋白之一。Zein中含有大量的疏水性氨基酸，其中亮氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸占比超過50%，故而使得Zein具有極強的疏水性。這種疏水性結構賦予了Zein出色的物理、化學特性，如能作為乳化劑吸附在油水界面從而穩定乳液。此外，Zein被認為是親脂性化合物（如維生素D3和β-胡蘿卜素）的有效載體，可以保護它們并提高它們的穩定性[2]。一方面因其物理疏水能力使Zein能夠構造出負載不同功能成分的輸送體系，但另一方面，Zein過強的疏水性成為它應用于食品工業的限制因素[3]。因此，改善其水溶性是擴大Zein應用范圍的重要手段。

近年來，蛋白質的糖基化修飾被認為是改善蛋白質性質一個有效方法。通過物理、化學或酶處理將多糖引入到蛋白質結構中，使得蛋白質糖基化產物表面具有更多的親水性基團和更為疏松的表面結構，從而具有更好的溶解性和乳化性[4]。Kim 等[5]報道牛血清白蛋白和巖藻多糖形成共價復合物后，牛血清白蛋白的熱穩定性、乳化活性和乳化穩定性均得到改善。在Zein和大豆多糖的糖基化反應中發現，大豆多糖與Zein通過美拉德反應進行糖基化接枝后，Zein的潤濕性和乳化性都有較大的改善[6]。

美拉德反應是食品加工中的一種常見的褐變反應，因為主要是羰基化合物（還原糖）和氨基化合物（蛋白質和氨基酸）之間的反應，所以又稱為羰氨反應[7]。通過與多糖發生美拉德反應來改善蛋白質的功能特性，其核心是引入多糖豐富的親水性羥基，來改善美拉德接枝物的親水親油平衡。葡聚糖（DX）是一種水溶性多糖，其具有簡單的直鏈結構和良好的水溶性及穩定性，因此被廣泛應用于蛋白質的糖基化研究中。

本研究通過濕法美拉德反應，利用葡聚糖對玉米醇溶蛋白進行糖基化接枝改性，引入親水性羥基來改善玉米醇溶蛋白的理化特性，擴大其應用范圍，并探究了不同玉米醇溶蛋白、葡聚糖反應底物質量比對美拉德接枝物理化性質的影響，為更好地改善玉米醇溶蛋白理化性質提供了理論和實踐借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

玉米醇溶蛋白（Zein）（純度≥ 99.5%）：美國Sigma公司；葡聚糖（DX）（相對分子質量： 20 kDa，純度≥ 99.5%）、鄰苯二甲醛（OPA）、β-巰基乙醇、蛋白Marker：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris、TEMED、雙縮脲試劑、磷酸鹽緩沖液、溴酚藍、甲醇、無水乙醇、乙酸：國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、乙醇（95%）、絲氨酸標準品：上海阿拉丁有限公司，本研究中使用的化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1200S型紫外可見分光光度計：上海奧儀電器有限公司；Scientz-10N普通型真空冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；Mini-PROTEAN Tetra System型化學發光凝膠成像系統：美國伯樂公司；Nicolet 5700型傅立葉變換紅外光譜儀：美國 Nicolet 公司；F97型熒光光譜儀：上海棱光科技有限公司；pHS-3E型酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋：上海汗諾儀器有限公司；H1850型高速離心機：湖南湘儀集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白-葡聚糖接枝物的制備

根據Hu等[8]的研究方法并稍加修改，通過美拉德反應制備得到玉米醇溶蛋白-葡聚糖接枝物。將不同質量比的玉米醇溶蛋白和葡聚糖（4 ： 1、2 ： 1、1 ： 1和1 ： 2）分別溶解在95%的乙醇溶液和去離子水中（1 ： 10，質量濃度）。待溶解后，將玉米醇溶蛋白和葡聚糖溶液混合，用0.1 mol/L NaOH將混合溶液調節pH至9.0后攪拌10 min。然后在85 ℃水浴中熱處理2 h，冰水浴冷卻至室溫，8 000 r/min離心5 min分離取上清液，調節pH至7.0，冷凍干燥即得玉米醇溶蛋白-葡聚糖美拉德接枝物，接枝物儲存在-18 ℃備用。在不添加葡聚糖的條件下，用相同方法處理玉米醇溶蛋白，作為對照。玉米醇溶蛋白（Zein）：經過熱處理的玉米醇溶蛋白，不添加葡聚糖。玉米醇溶蛋白-葡聚糖接枝物（Zein-DX）：根據蛋白、多糖質量比（4 ： 1、2 ： 1、1 ： 1和1 ： 2）分別標記為Zein-DX（4 ： 1）、Zein-DX（2 ： 1）、Zein-DX（1 ： 1）和Zein-DX（1 ： 2）。

1.3.2 接枝度測定

式中：DG為接枝度%；AC為對照樣品的吸光度；AS為樣品的吸光度。

1.3.3 褐變強度的測定

參考趙城彬等[9]的方法，采用0.1 g/100 mL的SDS溶液將樣品溶液稀釋至蛋白質量濃度為0.2 g/100 mL，空白樣為SDS溶液，在420 nm波長處測定吸光度A420 nm，以A420 nm表示褐變強度。

1.3.4 SDS-PAGE 分析

采用Laemmli等[10]的方法對玉米醇溶蛋白與多糖的美拉德接枝物進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，將Zein與Zein-DX接枝物溶于上樣緩沖液中，配制濃度為1 mg/mL，然后在100 ℃下沸水浴中加熱5 min，上樣量為15 μL。在tris-甘氨酸-SDS樣品緩沖液中以80 V和120 V電壓進行電泳。最后使用化學發光凝膠成像系統獲取凝膠圖像。

1.3.5 FTIR 分析

參考鄧瑜等[11]的方法，對其進行修改后，按照1∶100的質量比稱取樣品和溴化鉀粉末并混合，充分研磨后稱取 80 mg，用壓片機壓成薄片，裝入夾具后用傅里葉紅外光譜儀進行掃描。掃描范圍為4 000～500 cm-1，掃描次數為32，分辨率為4 cm-1。使用Origin 2021軟件收集和處理數據。

1.3.6 蛋白質溶解度和分散性

其中，C1為樣品總蛋白含量，C2為上清液中蛋白含量。

將樣品分散于濃度為1 mg /mL的蒸餾水中，攪拌1 h。靜置5 min后，通過分析樣品分散體在600 nm波長下的濁度，并拍攝樣品分散體的照片來分析蛋白在水溶液中的分散性。

1.3.7 乳化性（EAI）和乳化穩定性（ESI）測定

式中：A0和A30分別為第0、30 min時的吸光度；DF為稀釋倍數（100）；C為蛋白質質量濃度（g/mL）；φ為乳狀液中油相所占比例（0.5）。

1.3.8 統計分析

每組實驗重復3次，采用SPSS V17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析，作圖采用Origin 2021軟件完成，P<0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 Zein-DX糖基化產物接枝度和褐變強度分析

美拉德反應是使多糖的還原端羰基共價連接在蛋白質的游離氨基上的反應[13]。因此，可以通過糖基化程度或褐變程度來表示蛋白與多糖的接枝程度。由圖1可知，隨著葡聚糖質量比的增加，接枝物的接枝度逐漸增加，在葡聚糖與玉米醇溶蛋白的質量比為 2∶1 時接枝度最大為28.1%。糖基化反應過程中能夠產生褐色物質，將各自的美拉德接枝物稀釋后，在其典型的表征褐變的420 nm波長測其吸光度，顏色越深，吸光度越大，表明反應越劇烈，反應越充分。如圖1所示，420 nm波長處吸光值的增加表明褐變程度與葡聚糖添加量呈正相關，隨著葡聚糖添加量的增大，玉米醇溶蛋白和葡聚糖的糖基化反應生成的接枝產物增多。

2.2 SDS-PAGE分析

為了進一步確認Zein與DX之間美拉德的反應，對Zein-DX進行了SDS-PAGE研究。圖2為Zein以及不同DX質量比條件下制備的Zein-DX電泳圖。對照組Zein的主帶對應于20～25 kDa的位置，這是α-玉米醇溶蛋白的典型特征。而Zein-DX的條帶均出現在Zein的上方，這說明接枝物相對分子質量大于Zein的相對分子質量，證明了多糖的接入使產物相對分子質量的增加。并且DX的質量比越大，產物的相對分子質量也越大，其電泳條帶越靠近上方，這可歸因于玉米醇溶蛋白-葡聚糖接枝物接枝度的提高。當與葡聚糖結合時，燕麥分離蛋白也有類似的結果[14]。值得注意的是，上樣液中的SDS和β-巰基乙醇可以破壞蛋白質與多糖之間的非共價相互作用，所以玉米醇溶蛋白與葡聚糖的共價結合（美拉德反應）是美拉德接枝物相對分子質量增加的主要原因。

2.3 FTIR 光譜分析

蛋白質紅外光譜中有幾個易于識別的區域，包括酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）、酰胺Ⅱ帶（1 600～ 1 500 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1 500～1 200 cm-1）[15]。這些特殊區域通常用于蛋白質的分析，因為形成酰胺基團（C—O、N—H、C—N）鍵的特征帶與美拉德反應產物有關。如圖3，對于Zein-DX接枝物來說，1 654 cm-1 和 1 540 cm-1 處的吸收峰分別代表酰胺I帶中C=O 伸縮振動與 N-H 伸縮振動，其吸收峰顯著增強，這可能是美拉德反應中葡聚糖與蛋白的游離氨基作用的結果[6]。同時，美拉德反應過程中可生成吡嗪（C—N）、席夫堿（C = N）等物質，而導致了峰強度和位置的改變。在研究大豆分離蛋白和羧甲基纖維素的糖基化產物時，也觀察到了相同的現象[16]。與Zein相比，Zein-DX糖基化產物在1 012 cm-1附近都出現了新的吸收峰，此為C—N糖苷鍵的特征吸收峰，說明Zein和DX間形成了共價鍵。此外，接枝物在3 700～3 200 cm-1區域的吸收峰強度增加，此區域吸收峰是—OH伸縮振動引起的，表明糖基化產物中羥基含量增加，其原因是引入的DX自身攜帶了大量的羥基。

2.4 蛋白質溶解度和分散性

溶解性是蛋白質最重要的性質之一，對其許多功能特性和應用都有重要影響。Zein分子含有50%以上的非極性和疏水性氨基酸殘基，這種獨特的氨基酸組成，使其在水中的溶解性較差，只溶于55%～90%的乙醇-水溶液以及強堿溶液等，使其應用受到限制[17]。由圖4可知，Zein幾乎不溶于水，而與DX發生糖基化反應之后，其溶解度顯著提高，DX的添加量越大則Zein-DX的溶解度越高。Zein-DX（1：2）的溶解度為16.6%是Zein溶解度（1.6%）的十倍。其主要原因是通過美拉德反應將更多的葡聚糖的親水性羥基連接到了蛋白質的氨基酸殘基上，改善了Zein的親水性，從而提高了蛋白質的溶解度，同時DX與Zein結合后提供的空間效應也可能抑制Zein在水中由于靜電作用而產生地再聚集效應。Wang等[18]在Zein和殼聚糖的糖基化研究中發現，使用不同的蛋白、多糖摩爾比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）均能顯著提高Zein的溶解性。以蛋白質溶液表征了Zein-DX接枝物在水中的分散性。如圖5所示，Zein在水中分散性較差，靜置10 min 后，大部分Zein 都沉到底部，故溶液的吸光度較低，而Zein-DX接枝物，在水中分散性明顯增強，大部分Zein-DX接枝物顆粒能夠在水中均勻分散，溶液的吸光度值也顯著高于Zein，其原因可能是Zein通過與DX的糖基化反應引入了更多的親水性羥基，在提高了溶解性的同時，其在水中的分散性也得到了改善。

2.5 乳化性與乳化穩定性

蛋白質的乳化特性是指其使水和油混在一起成為乳狀液的能力，包括乳化活性和乳化穩定性。由圖7可知，Zein的EAI和ESI分別為5.1 m2/g和13.7%，無法形成穩定的乳液，而Zein糖基化后的產物的EAI和ESI均顯著提高，且隨著DX用量的增加，EAI和ESI不斷增大。 其中Zein-DX（1∶2）改善效果最好，其EAI和ESI能達到18.6 m2/g和42.4%。Zein-DX乳化性能提高的主要原因是親水性的增加，使得美拉德接枝物具有良好的親水、親油平衡，蛋白質-多糖接枝物能夠在液滴附近形成混合的多分子層結構，從而降低液滴的聚集程度，達到改善乳化性的目的[19]，其次與多糖的糖基化反應可能改變蛋白質的結構和表面攜帶的電荷，蛋白質分子間靜電斥力的增加產生空間位阻，導致形成更小的液滴，減少液滴的絮凝和聚集，從而增加乳液的穩定性[20]。

3 結 論

利用濕法美拉德的反應，制備了玉米醇溶蛋白-葡聚糖接枝物，并研究了葡聚糖/玉米醇溶蛋白質量比對美拉德接枝物結構和功能特性的影響。研究結果表明，糖基化反應的接枝度和產物的褐變強度都與葡聚糖的添加量呈正相關，同時蛋白質表現出相對分子質量的增加和結構上的改變，在糖基化作用下，蛋白質的C=O伸縮振動與 N—H伸縮振動增強，并新出現了C—N糖苷鍵的特征吸收峰。糖基化反應能夠顯著，提高其在水中的溶解度和分散性，這主要是因為親水性多糖的接入所導致的。同時溶解度的增加使得接枝物擁有更好的乳化性能，隨著葡聚糖質量比的增大，糖基化接枝對Zein的乳化性能的改善也愈發顯著。表明對Zein進行糖基化處理，能夠顯著改善其理化性質和功能特性，為Zein作為乳化劑應用在食品領域提供了理論支持，拓寬了玉米醇溶蛋白的應用范圍。

參 考 文 獻

[1] SUN Y， WEI Z， XUE C. Development of zein-based nutraceutical delivery systems： a systematic overview based on recent researches[J]. Food Hydrocolloids， 2023， 137： 108368.

[2] SOUZA E M C， FERREIRA M R A， SOARES L A L. Pickering emulsion stabilized by zein particles and their complexes and possibilities of use in the food industry： a review[J]. Food Hydrocolloids， 2022， 131： 107781.

[3] BA C， FU Y， NIU F， et al. Effects of environmental stresses on physiochemical stability of β-carotene in zein-carboxymethyl chitosan-tea polyphenols ternary delivery system[J]. Food Chemistry， 2020， 311： 125878.

[4] KAN X， CHEN G， ZHOU W， et al. Application of proteinpolysaccharide Maillard conjugates as emulsifiers： source， preparation and functional properties[J]. Food Research International， 2021， 150： 110740.

[5] KIM D Y， SHIN W S. Functional improvements in bovine serum albumin–fucoidan conjugate through the Maillard reaction[J]. Food chemistry， 2016， 190： 974-981.

[6] YAO L， WANG Y， HE Y， et al. Pickering emulsions stabilized by conjugated zein-soybean polysaccharides nanoparticles： fabrication， characterization and functional performance[J]. Polymers， 2023， 15（23）： 4474.

[7] 羅章， 辜雪冬， 張玉鳳，等. 咸蛋清蛋白酶解液美拉德反應條件優化及揮發性風味物質分析[J].糧食科技與經濟， 2020， 45（9）： 118-125.

[8] HU B， WANG K， HAN L， et al. Pomegranate seed oil stabilized with ovalbumin glycated by inulin： Physicochemical stability and oxidative stability[J]. Food Hydrocolloids， 2020， 102： 105602.

[9] 趙城彬，張浩，許秀穎，等.不同分子質量葡聚糖對玉米醇溶蛋白糖基化產物結構和功能性的影響[J].食品科學， 2018， 39（16）： 68-73.

[10] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature， 1970， 227（5259）： 680-685.

[11] 鄧瑜，孔令艷，薛梅，等.基于Pickering乳液模板法制備的芝麻素微膠囊性能表征[J].糧食科技與經濟， 2023， 48（3）： 108-111.

[12] MOLINA E， PAPADOPOULOU A， LEDWARD D A. Emulsifying properties of high pressure treated soy protein isolate and 7S and 11S globulins[J]. Food Hydrocolloids， 2001， 15（3）： 263-269.

[13] DE OLIVEIRA F C， COIMBRA J S R， DE OLIVEIRA E B， et al. Food protein-polysaccharide conjugates obtained via the Maillard reaction： a review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2016， 56（7）： 1108-1125.

[14] ZHANG B， GUO X， ZHU K， et al. Improvement of emulsifying properties of oat protein isolate–dextran conjugates by glycation[J]. Carbohydrate Polymers， 2015， 127： 168-175.

[15] BYLER D M， SUSI H. Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra[J]. Biopolymers： Original Research on Biomolecules， 1986， 25（3）： 469-487.

[16] SU J F， HUANG Z， YUAN X Y， et al. Structure and properties of carboxymethyl cellulose/soy protein isolate blend edible films crosslinked by Maillard reactions[J]. Carbohydrate Polymers， 2009， 79（1）： 145-153.

[17] XU Y， WEI Z， XUE C， et al. Assembly of zein- polyphenol conjugates via carbodiimide method： evaluation of physicochemical and functional properties[J]. LWT-Food Science and Technology， 2022， 154： 112708.

[18] WANG X J， ZHENG X Q， LIU X L， et al. Preparation of glycosylated zein and retarding effect on lipid oxidation of ground pork[J]. Food Chemistry， 2017， 227：335-341.

[19] PUGNALONI L A， DICKINSON E， ETTELAIE R， et al. Competitive adsorption of proteins and low-molecular-weight surfactants： computer simulation and microscopic imaging[J]. Advances in Colloid and Interface Science， 2004， 107（1）： 27-49.

[20] WANG Y， LI D， WANG L J， et al. The effect of addition of flaxseed gum on the emulsion properties of soybean protein isolate （SPI）[J]. Journal of Food Engineering， 2011， 104（1）： 56-62.