快速現場評價技術在重癥監護室的應用進展

董阿靜 趙丹萍 李海波

快速現場評價(rapid on site evaluation, ROSE)技術是一種床旁快速檢測手段,是指通過穿刺、刷檢、鉗夾、針吸等方法于靶部位取材,然后將部分取材進行快速制片、染色后,由細胞病理學醫師在顯微鏡下觀察,根據細胞學特征進行現場快速標本充分性和初步診斷評估,綜合多學科知識如:病理學、細胞學、臨床微生物學等,并結合患者臨床信息,將疾病和患者整體狀況加以解釋并指導臨床,最終將剩余標本以合適渠道送入不同跟進檢查環節。ROSE技術主要包括兩大部分:快速現場細胞學評價(cytological ROSE,C-ROSE)和快速現場微生物學評價(microbiological ROSE,M-ROSE)[1]。C-ROSE主要用于介入操作中,評價取材滿意度及實時指導介入操作,是所有后續檢測的快速質量控制手段;M-ROSE可以提供部分微生物病原的形態學依據,細胞分類與計數及其比例等細胞學背景,有極高的重復檢查次數,因此可用于感染性疾病,進行病情的評估和療效的預判。

重癥肺炎是指除肺炎常見呼吸系統癥狀外,尚有呼吸衰竭和其他系統明顯受累,其可表現為社區獲得性肺炎、醫院獲得性肺炎或呼吸機相關性肺炎,是重癥監護室(intensive care unit,ICU)的常見病,及時和充分的抗菌治療對于重癥肺炎危重患者的良好預后至關重要,也是國際肺炎管理指南的重點[2],而確定病原體對于重癥肺炎危重患者的抗生素管理至關重要。然而,在很多患者中確定病因是很困難的,尤其是既往有慢性基礎疾病、接受過抗生素治療和機械通氣的患者中。目前,臨床常用的病原檢測方法有一定局限性,如病原培養存在陽性率低、時間長的缺點,再加上臨床醫師對目標病原的判斷水平不一,均有可能導致臨床用藥不夠精準,從而影響疾病的早期診治。近年來,隨著基因組學技術的飛速發展,宏基因組二代測序技術被越來越多地運用到感染性疾病的病原檢測上,但其應用于感染性疾病的診斷還處于起步階段,還存在耗時長、成本高、錯誤率高以及生物信息分析軟件不夠豐富等缺點。

近年來,越來越多的研究報道ROSE技術在肺部感染性疾病的診斷中發揮著重要作用,本文主要綜述了ROSE技術的最新研究進展,并探討M-ROSE與肺部感染性疾病的相關研究,分析M-ROSE應用于ICU的臨床價值。

一、C-ROSE

1981年,Pak等[3]首次將現代C-ROSE應用于臨床。1993年開始出現了有關C-ROSE的系統研究和Meta分析,Austin等[4]對55例懷疑患有肺癌的患者進行了細針穿刺針吸活檢,結果有 ROSE指導的操作其陽性率為 100%,而沒有 ROSE指導的操作其陽性率僅有 80%,該研究證實ROSE可以提高手術操作的陽性率并減少無謂的手術操作,從而減少操作相關并發癥。

隨著介入技術的快速發展和廣泛應用,以及快速染色制片技術的發展,ROSE的臨床價值得到了進一步體現,廣泛應用于機體呼吸系統、生殖系統以及消化系統等各個系統實體腫瘤病變的輔助診斷。

Xu C.H.等[5]探究了支氣管內超聲經支氣管肺活檢(endobronchial ultrasound transbronchial lung biopsy with guide sheath,EBUS-GS-TBLB)聯合ROSE對周圍型肺癌的診斷價值,納入了138例接受EBUS-GS-TBLB治療并最終診斷為肺癌的患者,分為ROSE組和非ROSE組,比較有無ROSE的EBUS-GS-TBLB的診斷率、活檢次數、并發癥、細胞病理診斷費用及手術次數,研究結果提示,ROSE組和非ROSE組診斷率分別為87.8%和78.1%,ROSE組活檢次數、手術次數及并發癥發生率均顯著低于非ROSE組,且ROSE組細胞病理診斷費用低于非ROSE組,均有統計學意義。馬禎一等[6]探討了ROSE評估聯合細胞蠟塊對乳腺癌檢查的意義,實驗分為C-ROSE研究組和對照組,兩組各30例患者,實驗結果顯示C-ROSE組陽性為28例(93.33%),陰性為2例(6.67%);對照組陽性19例(63.33%),陰性11例(36.67%),其中11例陰性穿刺涂片與常規病理結果對照發現,有8例(72.73%)常規病理結果為陽性,3例(27.27%)為陰性。實驗結果提示ROSE聯合細胞蠟塊對乳腺腫塊進行定點穿刺,可提高穿刺成功率,保證穿刺質量,還能準確鑒別乳腺腫塊良惡性,不但可以提高診斷準確率,還對臨床靶向治療及預后評估都有極重要的應用價值,值得推廣及研究。Tamura T.等[7]研究了內鏡超聲引導下細針抽吸(endoscopic ultrasonography-guided fine-needle aspiration,EUS-FNA)聯合ROSE對胃腸粘膜下腫瘤診斷的準確性,并與單獨EUS-FNA進行比較,研究表明,EUS-FNA聯合ROSE對胃腸粘膜下腫瘤診斷的準確性顯著增高,且在有ROSE的病例中,胃腸粘膜下腫瘤的總體診斷準確率顯著高于沒有ROSE的患者,ROSE對胃腸粘膜下腫瘤的診斷能力的提高一定程度上可歸因于獲得了足夠的免疫染色材料,且ROSE并未增加手術所需的時間。因此,ROSE聯合介入是診斷機體實體腫瘤有效和安全的方法且不會增加操作的并發癥。

二、M-ROSE

由于呼吸疑難病及危重癥感染早期診治的迫切需求,以及ROSE技術的廣泛應用和不斷更新發展,近年來,ROSE在診斷下呼吸道感染病原體方面的臨床價值逐漸被報道,廣泛應用于肺部感染性疾病的評估。M-ROSE的主要臨床價值包括:根據形態學特征,初步辨別部分微生物病原,如念珠菌屬、曲霉菌屬、耶氏肺孢子菌、隱球菌和其他類型真菌、病毒包涵體、球菌和桿菌;可現場實時反復取材,保證標本量;根據細胞分類與計數及其比例等細胞學背景,粗略區分感染性疾病和非感染性疾病,從而制定初步治療的策略,并能夠預估病情嚴重程度和預判療效。

1. 理論基礎

感染性疾病的細胞學所見,因病原體不同或病程階段不同而有所差異。ROSE通過恰當的染色,可以直接觀察到某些細菌、真菌等,為快速確定病原微生物提供形態學依據,但在很多感染病例,尤其是細菌、病毒或非典型菌感染病例中,單一的現場快速染色法并不能顯示病原菌,可組合運用不同的染色方法予以鑒別[8]。ROSE的常規染色方法首推Diff-Quick染色,染色后可以直接從鏡下觀察細菌的形態進行判斷,如球狀、桿狀、螺旋狀等;真菌快速熒光特異性染色可以直接在鏡下判讀部分真菌的菌屬,如白色念珠菌、曲霉菌等;結核的特異抗酸染色可以直接鏡檢找到結核桿菌進行診斷用藥。有些特殊病原菌需要特殊染色方法或實驗室悉心培養才能顯現,而這些工作并不能夠在現場快速完成。

ROSE不僅可以提供微生物生態學,還可以提供明確的細胞學背景[9],比如化膿性炎癥會有大量的中性粒細胞,異形增生則提示腫瘤,肉芽腫病變鏡下主要成分有淋巴細胞、上皮樣組織細胞、巨噬細胞和肉芽組織,而多片無細胞、無固定形狀的碎片則提示結核分枝桿菌感染等。根據細胞分類與計數及其比例等細胞學背景,粗略區分感染性疾病和非感染性疾病,從而制定初步治療的策略,并能夠預估病情嚴重程度和預判療效。

2. 細菌感染

大多數常見細菌在呼吸道細胞學標本的快速染色中并不易見,因為大部分細胞并不發生任何特殊的細胞病理學改變,細胞病理學的作用是很有限的。但ROSE在某些感染中卻是有助于診斷的,如結核桿菌、諾卡氏菌、放線菌和軍團菌等。國內一項病例報道[10],男性患者,CT提示兩肺多發結節灶,惡性病變不能排除。頭孢噻肟(后改頭孢地尼口服)聯合伏立康唑治療1月,患者咳嗽咳痰癥狀加重,伴發熱,胸悶氣促,復查胸部CT 病變未明顯吸收。行支氣管鏡超聲導向鞘引導的經支氣管肺活檢取出的組織樣本即刻行ROSE,ROSE 提示:顯微鏡下可見到大量細菌菌團及中性粒細胞,考慮放線菌感染。調整治療方案,改用大劑量青霉素制劑治療。經過2周治療,患者體溫正常,呼吸道癥狀明顯好轉,進一步復查胸部CT,肺部病灶顯著吸收。

Li T.等[11]分析了10例最終診斷為銅綠黏液假單胞菌的支氣管擴張患者,比較M-ROSE與痰菌培養的準確性和時間。由于黏液層涂層,銅綠黏液假單胞菌迪夫染色后顯微鏡下顯示出獨特的淺紫色生物膜,可以通過ROSE快速識別。該研究表明M-ROSE與病理的符合率為100%,其除了具有較高的準確性外,完成診斷的時間比細菌培養縮短了1000多倍。需要強調的是,ROSE不同于快速病理診斷,病理診斷的目標是明確診斷、精確診斷,而ROSE著眼于細胞學背景,結合其他臨床信息,協助鑒別診斷,為后續選擇檢查項目提供細胞學背景信息及評估標本的充分性。秦田田等[12]進行了ROSE聯合二代測序在呼吸道感染中的應用研究,在支氣管鏡操作中通過ROSE對標本充分性和合格率進行初步判斷,將ROSE陽性標本送二代測序,提高了二代測序的陽性率,進而快速精確的獲得病原學依據,精準地指導抗感染治療,減少了二次檢查率,臨床價值高,值得推廣。

3. 真菌感染

真菌感染形成肉芽腫或化膿性肉芽腫,純粹的化膿性變多見于有免疫缺陷者。大多數種類的真菌可在Diff-Quick、Papanicolaou 、Giemsa或真菌熒光染色中顯影,可見大量負像或不同程度染色的真菌。國內一項研究[13]運用ROSE診斷兒童侵襲性肺真菌病,12例不明原因肺不張患兒,經支氣管鏡行病灶部位粘膜刷檢再經迪夫染色后進行ROSE診斷,結果ROSE診斷為兒童侵襲性肺真菌病4例,4例ROSE結果均與二代測序及病理組織檢查結果一致。王漢生等[14]探究了ROSE在經皮肺穿刺活檢中診斷肺隱球菌病的準確性和時效性,研究結果提示ROSE診斷肺隱球菌病的敏感度、特異度、準確率分別為80.0%、100.0%、80.0%;ROSE和病理報告出具平均時間分別為(10±1)min、(81±1.4)h,診斷費用分別為220元、450元。因此,將ROSE應用于隱球菌的診斷,有利于縮短確診時間并及時使用抗菌藥物,為患者治療贏得時間,值得在呼吸介入領域推廣應用。葉玲等[15]通過對比肺隱球菌病患者的診治過程,探討M-ROSE聯合肺活檢對疑診肺隱球菌病的診斷價值,該研究通過總結分析了4例肺隱球菌患者的診斷和診治經過,表明ROSE技術在肺隱球菌病理診斷中具有快速準確的優勢,優于隱球菌莢膜抗原的檢測,臨床意義重大。

臨床上存在一些誤診的情況,ROSE可以起到輔助鑒別診斷的作用,為進一步檢查提供方向。根據ROSE的結果,將標本送病理檢查或送微生物室,選用適當的培養方法,進行PCR、特殊檢測或耐藥實驗。馬衛紅等[16]的一項病例報告中ROSE促進了馬爾尼菲青霉菌感染的診斷。一例腎移植患者初步臨床和影像表現高度懷疑肺癌,在超聲引導下經支氣管細針抽吸,床旁進行ROSE涂片顯示未見惡性細胞;在風干載玻片上的ROSE檢測中發現了大量生物體。根據其特征形態懷疑馬爾尼菲青霉菌,后將ROSE結果傳達給微生物團隊,并建立了適合馬爾尼菲青霉菌的特殊培養條件,證實患者為真菌感染,進行抗真菌治療后患者完全康復。本病例展示了ROSE在提供初步診斷方面的重要作用,從而對有限的檢驗標本進行分類以進行輔助檢查。

4. 支原體感染

肺炎支原體肺炎是由肺炎支原體感染引起的非典型肺炎,重癥肺炎支原體肺炎及難治性肺炎支原體肺炎越來越多,臨床早期診斷和治療有助于患兒預后。目前檢測肺炎支原體的方法較多,但是尚沒有方法能早期快速診斷肺炎支原體感染。盧瑞華等[17]總結了41例兒童肺炎支原體肺炎的M-ROSE表現,研究結果顯示肺炎支原體肺炎患兒的ROSE細胞學表現有其特異性,主要表現為具有壞死性炎的特性,可見單核細胞為主的多種炎癥細胞的浸潤,表明ROSE對于肺炎支原體肺炎的診斷及治療有著重要的參考價值。

三、M-ROSE在重癥監護室的應用現狀

下呼吸道感染病原菌的確定有賴于微生物學結果,微生物學檢查的標本可來自痰、肺組織、支氣管肺泡灌洗液、血及胸腔積液等[18]。支氣管肺泡灌洗液通過支氣管鏡直接采集肺部病灶處分泌物,是用纖維支氣管鏡在選定的支氣管肺段內的楔形位置進行的,避開了口咽部大量定植菌的污染,使標本合格率及病原菌檢出率均顯著提高。有研究表明,支氣管肺泡灌洗液培養結果靈敏度與特異度均較高,分別為70%～90%和 80%～100%[19]。

Tao Y.等[20]在呼吸重癥監護室(respiratory intensive care unit ,RICU)進行了一項回顧性研究,將患者是否床旁使用M-ROSE指導治療分為M-ROSE組和非M-ROSE組,M-ROSE組通過M-ROSE對支氣管肺泡灌洗液進行快速的細胞學和病原學分析,然后基于所有臨床信息和M-ROSE結果選擇抗生素,非M-ROSE組僅基于所有臨床信息。研究結果提示在M-ROSE組患者入院后炎癥指標下降明顯快于對照組,使用抗生素種類明顯多于對照組。在有創機械通氣患者中,M-ROSE組病死率明顯低于對照組,M-ROSE結果與二代測序結果的符合率為66.2%,高于其他實驗室結果的符合率。此外,M-ROSE報告的速度明顯快于培養和二代測序結果。該研究表明在RICU中使用M-ROSE有助于病原微生物的早期和快速診斷,指導危重患者的抗生素治療方案,改善疾病進展,降低有創機械通氣患者的死亡率。

劉翔騰等[21]探討了ROSE技術在兒童重癥監護病房(pediatric intensive care unit,PICU)指導兒童重癥肺炎支氣管肺泡灌洗的后續診療價值,將患者分為單純灌洗組、灌洗+ROSE組以及家屬均不同意灌洗和ROSE組。分析3組患兒治療前后的血氣、炎癥指標及應用價值指標,結果顯示在PICU內ROSE指導重癥肺炎患兒行支氣管肺泡灌洗后續診療,能減少抗生素的使用天數及種類,減少真菌定植率,可為抗生素的合理應用提供參考。

四、總結及展望

ROSE技術的真正優勢在于快速-床旁即可實施,此外,ROSE能在一定程度上區分感染、定植還是標本污染的問題;在形態學方面,M-ROSE基本能看到細菌、真菌,尤其對真菌診斷準確率非常高,有經驗的醫生第一時間對細菌和真菌進行床旁診斷;而且根據細胞學背景可以對患者病情的嚴重程度進行評估以及判斷患者目前治療方案的療效。目前,ROSE在ICU的應用及研究較少,而重癥感染的診斷需要快速、個體化及精確度,但檢驗系統是無法做到的。ROSE與臨床一線相結合,有望打破重癥患者經驗性治療越治越重,耐藥菌越治越多的死循環狀態,實現早期快速精準診斷的個體化治療,因此,在ICU中ROSE有一定的應用前景,值得進一步研究和推廣。