抗CD122抗體對小鼠銀屑病樣皮損的影響及其作用機制

李華潤 溫炬 鄭榮昌 周玉嬋 秦思 李婷 黃錦萍

1 廣東省第二人民醫院皮膚科，廣州 510317；2 番禺區第二人民醫院皮膚科，廣州511430

銀屑病是一種易復發的免疫介導的慢性炎癥性皮膚病，與年齡、種族、遺傳等多種因素有關［1］，全球患病率占2%～3%，影響全球約1.25 億人［2］，現在其發病機制尚未完全闡明［3］。銀屑病患者容易在相同位置復發，目前被認為是由組織常駐記憶T細胞（tissue resident memory T cells，TRM細胞）介導的免疫記憶所致，其中支持TRM細胞形成和存活的白細胞介素（IL）-15 對TRM細胞有著重要作用，且去除T細胞上的IL-15受體發現導致TRM細胞下降［3-5］。IL-15受體異三聚體是由IL-15Rα、IL-15Rβ（CD122）和IL-15Rγ（CD132）組成，對于皮膚等組織中的CD8+TRM細胞的長期維持或生存是必不可少的，且發現TRM細胞的數量會因IL-15 的缺乏而減少［6-8］。有研究表明，IL-17A 可促進角質形成細胞增殖，是銀屑病發生發展的重要細胞因子［9-10］。Yu 等［11］在研究自身免疫性腦脊髓炎的小鼠模型時發現，用抗CD122 抗體阻斷IL-15 介導的CD8+CD122+T 細胞的轉運可導致記憶性CD8+T 細胞的耗竭。Yuan 等［12］在糖尿病小鼠模型中發現，抗CD122治療會耗盡記憶中的CD8+T細胞。而Richmond 等［13］通過體外研究表明，抗CD122 抗體能夠阻斷IL-15 介導的T 細胞存活。本實驗通過觀察抗CD122 抗體對咪喹莫特乳膏初次及再次誘導的小鼠銀屑病樣皮損的影響，以TRM細胞、IL-15、IL-17A 作為研究對象，初步研究IL-15參與銀屑病發病的可能機制。

材料與方法

1.主要試劑及儀器

5%咪喹莫特乳膏（美國3M公司，批號GUC078B），凡士林（天津市致遠化學試劑有限公司，批號2019051083），IL-17A 多克隆抗體（Proteintech 公司，貨號26163-1-AP），IL-15多克隆抗體（ThermoFisher公司，貨號PA5-34511），抗CD122 抗體（BioXcell 公司，貨號BE0298-5MG），同型對照抗體（BioXcell 公司，貨號BE0090），CD122 單克隆抗體（Abcam 公司，貨號ab61195），CD3 單克隆抗體（eBioscience公司，貨號14-0032-82），CD4 單克隆抗體（eBioscience 公司，貨號14-0041-82），CD8 單克隆抗體（Abcam 公司，貨號ab22378），CD103 單克隆抗體（Abcam 公 司，貨 號ab254182），CY3標記山羊抗大鼠/異硫氰酸熒光素（FITC）標記山羊抗小鼠（Servicebio 公司，貨號GB21302/GB22301），CY3 標記山羊抗兔/FITC 標記山羊抗小鼠（Servicebio 公司，貨號GB21303/GB22301），正置熒光顯微鏡（日本尼康，型號：NIKON ECLIPSE C1）等。

2.實驗動物分組及模型建立

研究時間為2020年7月1日至11月23日，選用6～8周齡、SPF級BALB/c小鼠共56只，雌性，體質量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［合格證編號：SCXK（京）2016-0006］，所有動物均飼養于廣州瑞業模型動物生物科技有限公司SPF 級動物飼養室［許可證號：SYXK（粵）2020-0218］，飼養壞境：室溫（23.0±0.5）℃，采用10 h∶14 h 晝夜間斷照明，濕度40%～70%，保持通風透氣。小鼠自由進食和飲用滅菌后的純化水，飼養過程中小鼠健康情況均可。所有動物實驗操作均符合ARRIVE（Animal Research：Reporting of In Vivo Experiments）準則，且經瑞業模型動物中心實驗動物倫理委員會審批通過（20201117002）。56只SPF級BALB/c 雌性小鼠采用隨機數字表法隨機分為4 組：對照組（8例）、模型組（20例）、實驗組A（8例）和實驗組B（20例）。小鼠背部脫毛（面積為2 cm×2 cm），暴露皮膚。對照組背部脫毛區域每日涂凡士林62.5 mg，連續6 d（即1～6 d）。模型組、實驗組A、實驗組B背部脫毛區域每日涂咪喹莫特62.5 mg，連續6 d（即1～6 d），隨后模型組和實驗組B 部分小鼠停止涂藥至皮損消退后恢復為正常皮膚（第35 天），2 cm×2 cm 脫毛，再次予涂咪喹莫特，連續6 d（即36～41 d）。實驗組A腹腔內（左下腹）注射同型對照抗體和實驗組B 腹腔內（左下腹）注射抗CD122 抗體，分別建模前第1 天及建模第3 天注射共2 次，500 μg/次。每天拍照并記錄小鼠背部皮膚并依據銀屑病面積與嚴重程度指數（PASI）評分標準進行評分。對照組和實驗組A于第3、6天采用頸椎脫臼法處死小鼠，模型組和實驗組B 于第3、6、35、38、41 天處死小鼠（各時間點4 只），取小鼠背部皮損1 cm×1 cm 浸泡于組織固定液（4%多聚甲醛）中，待后續進行檢測。

3.小鼠PASI評分

PASI評分標準［14］：指標包括紅斑、鱗屑、厚度3個指標，每個指標為0～4 分，3 個指標分數相加為PASI 總分（0 分：無；1分：輕度；2分：中度；3分：重度；4分：極重度）。評分越高提示小鼠銀屑病樣皮損越重。

4.組織病理學變化

4%多聚甲醛固定的小鼠背部皮損，脫水、石蠟包埋、切片，進行HE染色。顯微鏡下觀察表皮增厚、表皮突延伸、角質層分化及炎癥細胞浸潤等情況，使用Image J 18.0 軟件的標尺功能測量小鼠皮層厚度。

5.皮損組織免疫熒光染色確定TRM的存在數量及變化

石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復，畫圈自發熒光淬滅，在圈內加入自發熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。血清封閉30 min，加一抗，加二抗，二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復染細胞核（晃動洗滌3 次，每次5 min），滴加DAPI染液孵育10 min。鏡檢拍照：熒光顯微鏡下采集圖像（DAPI 紫外激發波長330～380 nm，發射波長420 nm，發藍光；FITC 激發波長465～495 nm，發射波長515～555 nm，發綠光；CY3 激發波長510～560 nm，發射波長590 nm，發紅光）。免疫熒光結果判讀：DAPI 染色的細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光（CD3、CD4、CD8、CD122）或者綠光（CD103）。黃色區域即為TRM細胞。

6.免疫組織化學檢測IL-15和IL-17A表達

石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復、封閉，滴加一抗（1∶400），4 ℃過夜孵育（17 h以上），滴加二抗（1∶1 000）4 ℃孵育，DAB 顯色，蘇木精復染，同步設立陰性對照。對蠟塊連續切片各5張，隨機選取5個非重合的視野進行觀察。結果判讀：細胞核呈藍色，IL-15 和IL-17A 免疫組化檢測結果分別以鏡下胞漿、胞核內出現淡棕色、淡褐色、棕色、棕褐色以及褐色顆粒為陽性判斷標準。光學顯微鏡下觀察免疫陽性反應物的分布情況并拍照。使用Image pro plus6.0軟件采集圖片上深染的各個點的光密度值，得到積分光密度值，取平均值。平均光密度值反映IL-15、IL-17A蛋白表達水平。

7.統計學處理

采 用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖，ImageJ_v1.8.0 及Image-Pro Plus 6.0 軟件分析；使用SPSS 20.0 軟件進行數據處理和統計學分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準為α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.臨床表現

對照組小鼠背部皮膚正常（圖1A）。模型組和實驗組A涂咪喹莫特刺激后第1～2 天背部皮膚出現淡紅色紅斑，第3天為紅斑，少許白色或淡黃色鱗屑，紅斑、鱗屑、增厚逐漸明顯，出現片狀白色或者淡黃色鱗屑，大部分第6 天呈典型的銀屑病樣改變（圖1B 和圖1D）。模型組于第36 天再次涂咪喹莫特刺激小鼠背部皮膚發現紅斑、鱗屑、厚度出現較初次早，且再次刺激第3～4 天（即第38～39 天）出現典型的銀屑病樣改變（圖1C）。實驗組A各觀察指標在第0～6天與同一時間模型組的表現相似（圖2），實驗組A的PASI總分與同一時間模型組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。實驗組B初次刺激第1～2天小部分小鼠背部皮膚出現淡紅色紅斑，第3天僅部分可見小鼠出現紅斑，鱗屑也相對較少；第4～6 天小鼠紅斑、鱗屑、增厚出現逐漸緩慢加重，第5～6天PASI總分均較同一時間的模型組和實驗組A 少（圖2），差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1；第6天小鼠未呈現典型銀屑病樣皮損（圖1E）。實驗組B 再次刺激時紅斑、鱗屑、增厚均較同一時間的模型組減輕，且PASI總分在第1～5天均低于同一時間模型組的PASI總分（均P＜0.05），見圖2、表1。小鼠始終未呈現典型銀屑病樣皮損（圖1F）。

表1 各組小鼠背部皮膚的PASI評分總分（分，± s）

表1 各組小鼠背部皮膚的PASI評分總分（分，± s）

注：對照組背部脫毛區域每日涂凡士林62.5 mg，連續6 d（即1～6 d）；模型組、實驗組A、實驗組B 背部脫毛區域每日涂咪喹莫特62.5 mg，連續6 d（即1～6 d），隨后模型組和實驗組B部分小鼠停止涂藥至皮損消退后恢復為正常皮膚（第35天），2 cm×2 cm脫毛，再次予涂咪喹莫特，連續6 d（即36～41 d）。初次刺激為1～6 d，再次刺激為36～41 d。PASI 為銀屑病面積與嚴重程度指數。模型組（初次）與對照組比較，aP＜0.05；模型組（再次）與模型組（初次）比較，bP＜0.05；實驗組A 與模型組（初次）比較，cP＞0.05；實驗組B（初次）與模型組（初次）比較，dP＜0.05；實驗組B（再次）與模型組（再次）比較，eP＜0.05

圖1 各組小鼠背部皮損的臨床表現。A 為對照組第6 天，B 為模型組第6 天，C 為模型組第38 天，D 為實驗組A 第6 天，E 為實驗組B 第6天，F為實驗組B第38天

圖2 各組小鼠背部皮膚的銀屑病面積與嚴重程度指數（PASI）評分。A為紅斑；B為鱗屑；C為厚度；D為三者相加的總積分

2.小鼠背部皮損組織病理

對照組小鼠皮膚組織病理正常（圖3A）。模型組初次刺激的小鼠皮損第6天及再次刺激的小鼠皮損第3天（即第38 天）均呈現出典型的銀屑病樣炎性改變，可見角化過度、角化不全、真皮淺層炎癥性細胞浸潤以及真皮血管擴張等（圖3B、3C）；實驗組A小鼠第6天的皮損組織病理與同一時間的模型組基本一致（圖3D）。實驗組B 的表皮層厚度、毛細血管增生、炎癥細胞浸潤等程度均低于同一時間的模型組和實驗組A（圖3E、3F）。模型組初次刺激的小鼠表皮層厚度均較對照組明顯增厚（均P＜0.05）；模型組表皮層厚度再次刺激第3 天（即第38 天）大于初次刺激第3 天，再次刺激第6 天（即第41 天）小于初次刺激第6 天（均P＜0.05）；實驗組A 小鼠的表皮層增厚顯著，與同一時間的模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；實驗組B 表皮層厚度均較同一時間的模型組和實驗組A 表皮層厚度減少，實驗組B 初次及再次刺激的表皮層厚度與同一時間的模型組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠皮損的表皮層厚度比較（μm，± s）

表2 各組小鼠皮損的表皮層厚度比較（μm，± s）

注：對照組背部脫毛區域每日涂凡士林62.5 mg，連續6 d（即1～6 d）；模型組、實驗組A、實驗組B 背部脫毛區域每日涂咪喹莫特62.5 mg，連續6 d（即1～6 d），隨后模型組和實驗組B部分小鼠停止涂藥至皮損消退后恢復為正常皮膚（第35天），2 cm×2 cm脫毛，再次予涂咪喹莫特，連續6 d（即36～41 d）。初次刺激為3 d、6 d，再次刺激為38 d、41 d。與模型組（初次）比較，aP＜0.05；實驗組A與模型組（初次）比較，bP＞0.05；實驗組B（初次）與模型組（初次）比較，cP＜0.05；實驗組B（再次）與模型組（再次）比較，dP＜0.05

圖3 各組小鼠的背部皮損組織病理 HE 染色 ×100。A 為對照組第6 天，B 為模型組第6 天，C 為模型組第38 天，D 為實驗組A 第6 天，E為實驗組B第6天，F為實驗組B第38天

3.TRM細胞在小鼠銀屑病樣皮損中的表型及變化

模型組初次及再次刺激、實驗組A、實驗組B 初次及再次刺激的小鼠皮損內于真皮淺層和局部表皮層均可見黃色區域，即考慮存在CD3+CD103+（TRM），CD4+CD103+（CD4+TRM）和CD8+CD103+（CD8+TRM）TRM細 胞，而CD122+CD103+（CD122+TRM）提示部分TRM細胞表達CD122，且可見CD8+TRM細胞的數量較CD4+TRM細胞多，而對照組小鼠皮損內未檢測到TRM細胞分布（圖4）。模型組初次刺激的小鼠皮損內TRM細胞數量均較對照組增多（均P＜0.01）；且模型組再次刺激第3 天（即38 d）的TRM細胞數量均比初次刺激第3 天明顯增多（均P＜0.01）；實驗組A 小鼠皮損內TRM細胞的數量與同一時間模型組比較，數量均基本一致（P＞0.05）（表3）。實驗組B初次刺激第3天的CD4+TRM細胞數量與模型組初次刺激第3 天的CD4+TRM細胞數量相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；而實驗組B 初次及再次刺激小鼠皮損內其余時間點TRM細胞的數量均較同一時間模型組和實驗組A 明顯減少（P＜0.05）（圖4、表3）；其中CD8+TRM細胞較明顯（P＜0.01）。

表3 各組小鼠背部皮損中不同類型TRM細胞的變化（細胞個數/視野，± s）

表3 各組小鼠背部皮損中不同類型TRM細胞的變化（細胞個數/視野，± s）

注：對照組背部脫毛區域每日涂凡士林62.5 mg，連續6 d（即1～6 d）；模型組、實驗組A、實驗組B 背部脫毛區域每日涂咪喹莫特62.5 mg，連續6 d（即1～6 d），隨后模型組和實驗組B部分小鼠停止涂藥至皮損消退后恢復為正常皮膚（第35天），2 cm×2 cm脫毛，再次予涂咪喹莫特，連續6 d（即36～41 d）。初次刺激為3 d、6 d，再次刺激為38 d、41 d。與對照組比較，aP＜0.05；與模型組（初次）3 d比較，bP＜0.05；實驗組A 與模型組（初次）比較，cP＞0.05；實驗組B（初次）與模型組（初次）比較，dP＜0.05；實驗組B（再次）與模型組（再次）比較，eP＜0.05

圖4 各組小鼠背部皮損中免疫熒光染色檢測TRM細胞及其類型 ×200

4.免疫組織化學

對照組的小鼠皮損內IL-15與IL-17A 僅少量表達或無表達，呈淡褐色或淡棕色；模型組初次及再次刺激、實驗組A 的小鼠皮損內IL-15 和IL-17A 主要分布于表皮層和真皮淺層，呈深褐色、棕褐色，其著色的細胞層數和數量均比對照組增多。實驗組B 初次及再次刺激的小鼠皮損內IL-15 與IL-17A 著色的細胞層數及數量均低于同一時間的模型組和實驗組A（圖5、6）。模型組初次刺激小鼠皮損內IL-15 和IL-17A 的表達水平均高于對照組（均P＜0.05），且模型組再次刺激小鼠皮損內IL-15和IL-17A 的表達水平與初次刺激同一時間比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；實驗組A 的小鼠皮損內IL-15與IL-17A 的表達水平與同一時間的模型組相當（均P＞0.05），而實驗組B 初次及再次刺激小鼠皮損內IL-15和IL-17A 的表達水平均比同一時間的模型組降低（均P＜0.05）。見表4、5。

表4 各組小鼠背部皮損中各時間點IL-15平均光密度比較（IOD/area，± s）

表4 各組小鼠背部皮損中各時間點IL-15平均光密度比較（IOD/area，± s）

注：對照組背部脫毛區域每日涂凡士林62.5 mg，連續6 d（即1～6 d）；模型組、實驗組A、實驗組B 背部脫毛區域每日涂咪喹莫特62.5 mg，連續6 d（即1～6 d），隨后模型組和實驗組B部分小鼠停止涂藥至皮損消退后恢復為正常皮膚（第35天），2 cm×2 cm脫毛，再次予涂咪喹莫特，連續6 d（即36～41 d）。初次刺激為3 d、6 d，再次刺激為38 d、41 d。IL-15 為白細胞介素-15。與模型組（初次）比較，aP＜0.05；實驗組A 與模型組（初次）比較，bP＞0.05；實驗組B（初次）與模型組（初次）比較，cP＜0.05；實驗組B（再次）與模型組（再次）比較，dP＜0.05

表5 各組小鼠背部皮損中各時間點IL-17A平均光密度比較（IOD/area，± s）

表5 各組小鼠背部皮損中各時間點IL-17A平均光密度比較（IOD/area，± s）

注：對照組背部脫毛區域每日涂凡士林62.5 mg，連續6 d（即1～6 d）；模型組、實驗組A、實驗組B 背部脫毛區域每日涂咪喹莫特62.5 mg，連續6 d（即1～6 d），隨后模型組和實驗組B 部分小鼠停止涂藥至皮損消退后恢復為正常皮膚（第35天），2 cm×2 cm脫毛，再次予涂咪喹莫特，連續6 d（即36～41 d）。初次刺激為3 d、6 d，再次刺激為38 d、41 d。IL-17A 為白細胞介素-17A。與模型組（初次）比較，aP＜0.05；實驗組A 與模型組（初次）比較，bP＞0.05；實驗組B（初次）與模型組（初次）比較，cP＜0.05；實驗組B（再次）與模型組（再次）比較，dP＜0.05

圖5 各組小鼠背部皮損中免疫組織化學染色檢測白細胞介素-15（IL-15）的表達 ×100。A 為對照組第6天，B 為模型組第6天，C 為模型組第41天，D為實驗組A第6天，E為實驗組B第6天，F為實驗組B第41天

圖6 各組小鼠背部皮損中免疫組織化學染色檢測白細胞介素-17A（IL-17A）的表達 ×100。A為對照組第6天，B為模型組第6天，C為模型組第41天，D為實驗組A第6天，E為實驗組B第6天，F為實驗組B第41天

討論

銀屑病是一種免疫相關的炎癥性皮膚病，已知小鼠局部應用咪喹莫特乳膏，可誘發銀屑病樣皮損［15-17］，且咪喹莫特誘導的小鼠模型是目前研究銀屑病最成熟的工具［18］。咪喹莫特誘導的小鼠模型是銀屑病研究的合適動物模型［19］，目前咪喹莫特誘導的小鼠模型較少研究銀屑病中復發的形成和皮膚炎癥的慢性化［20］。其中模型組小鼠背部皮膚臨床表現及組織病理學均呈典型的銀屑病樣改變，與Lin等［21］用咪喹莫特小鼠建模的表現是一致的，而對照組小鼠背部皮膚正常，這提示小鼠建模成功。在第35 天確定小鼠背部皮膚恢復正常后進行咪喹莫特再次刺激時發現，小鼠背部皮膚的反應更加強烈，紅斑、鱗屑、厚度出現較初次早，這與Ramírez-Valle 等［22］研究結果表現較為一致，考慮再次使用咪喹莫特刺激可能使皮損中某種細胞增殖或某種因子分泌增加，從而導致出現更快的皮膚炎癥反應。TRM細胞在外周組織中擁有長期存活和低遷移兩大特點，這可能與銀屑病停藥后容易在相同部位復發的特點密切相關［23］。大量研究證實，TRM細胞主要表型標記為CD103 和CD69，但CD69 體外培養顯示表達不穩定，因此，實驗選擇CD103 作為TRM細胞的表型標記。本研究結果顯示，模型組初次及再次刺激的小鼠銀屑病樣皮損內于真皮淺層和局部表皮層均可見TRM細胞分布，且部分TRM細胞表達CD122（IL-15Rβ），這也是我們使用抗CD122 抗體進行后續實驗的有力依據；而對照組未檢測到TRM細胞分布，考慮TRM細胞可能參與初次及再次刺激的銀屑病樣皮損的形成。咪喹莫特再次刺激第3 天的TRM細胞數量均比初次刺激第3 天增多，考慮可能與小鼠再次使用咪喹莫特誘導時表現出的強烈反應相關，即再次刺激時，TRM細胞快速增殖并分泌相關細胞因子參與炎癥反應。有研究表明，IL-15通過刺激相關炎癥因子的分泌和釋放（如IL-17等），促進炎癥細胞的增加和血管生成等多方面共同影響銀屑病的發生和發展［24-25］；IL-17A 可導致角質形成細胞增殖和分化異常，參與相關炎癥反應［26-28］。模型組初次及再次刺激的小鼠皮損內有IL-15 及IL-17A 表達，且較對照組升高（均P＜0.05）。這提示IL-15 及IL-17A可能參與咪喹莫特初次及再次誘導的銀屑病樣皮損的發生和發展，這與Singh 等［29］研究結果一致。本研究發現，實驗組A 小鼠與模型組小鼠的各項結果差異不大（均P＞0.05）；而實驗組B 小鼠的臨床表現、組織病理表現均較同一時間的模型組和實驗組A 減輕，這提示抗CD122 抗體對銀屑病樣皮損具有緩解作用。de Jesús-Gil 等［30］阻斷IL-15 信號通路后發現，銀屑病異種移植小鼠模型的銀屑病樣皮損幾乎完全消退，而本實驗結果并未出現完全消退的情況，考慮可能與抗CD122抗體的來源、劑量或小鼠模型差異有關，同時也不排除其他途徑導致皮損形成的可能［31］。實驗組B 初次及再次刺激的皮損內TRM細胞數量基本均較同一時間模型組和實驗組A 減少（均P＜0.05），且CD8+TRM細胞較明顯（P＜0.01）；同時，實驗組B 初次及再次刺激的小鼠皮損內IL-15 與IL-17A 的表達水平均低于同一時間的模型組和實驗組A（均P＜0.05）。

綜上所述，抗CD122 抗體阻斷IL-15 信號通路對咪喹莫特初次及再次誘導的銀屑病樣皮損有一定的緩解作用，可能與其抑制皮損內TRM細胞的生成和功能，以CD8+TRM細胞為主，以及降低IL-15、IL-17A 的表達有關。本實驗選擇抗CD122 抗體阻斷IL-15 信號通路的策略對IL-15 在咪喹莫特刺激誘導銀屑病樣皮損的可能作用機制進行了初步探索，這開拓了銀屑病機制研究的途徑和思路。同時，我們認為抗CD122 抗體阻斷IL-15 信號通路靶向TRM細胞可能是解決銀屑病復發難題的一種有前途的方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明李華潤：實施研究，采集數據，起草文章；溫炬：獲取研究經費，指導，支持性貢獻；鄭榮昌：醞釀和設計實驗；周玉嬋：分析/解釋數據；秦思：統計分析；李婷：對文章的知識性內容作批評性審閱；黃錦萍：指導