四烯甲萘醌（MK-4）對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠模型的保護作用分析

葉 露，趙 凡，黃倩倩，張佳怡，王建青，

1 安徽醫科大學藥學院，合肥 230032

2 安徽醫科大學第一附屬醫院藥學部，合肥 230012

3 安徽省公共衛生臨床中心，合肥 230012

急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是由病毒感染、乙醇、毒物等原因引起的肝臟合成、代謝和排泄功能受損，嚴重時可進展為急性肝衰竭［1］。四氯化碳（CCl4）是典型的肝毒性化合物，廣泛應用于誘導ALI的模型研究［2］。

鐵死亡作為一種區別于其他細胞死亡形態和生化特征的新型細胞死亡形式［3］，其發生機制主要與鐵代謝紊亂、氧化系統功能受損和脂質過氧化物聚集有關［4］。Lin 等［5］發現，CCl4誘發小鼠ALI 時會促進肝臟鐵死亡，且早在“鐵死亡”一詞之前，就已有報道維生素K 具有抗氧化作用［6-7］，因此Mishima 等［8］通過用維生素K 處理不同種類的谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）缺失腫瘤細胞的研究中發現，維生素K 都可阻止這些細胞死亡，提示維生素K 是一種有效的鐵死亡抑制劑，且四烯甲萘醌（menaquinone-4，MK-4）效果最佳，但MK-4是否可應用于ALI中還未可知。因此，該研究探索MK-4保護CCl4誘導的ALI小鼠模型的機制，為臨床預防和治療ALI提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用48 只普通雄性ICR 小鼠，8 周齡，體質量為36～42 g，購買于北京維通利華研究動物技術有限公司，動物生產許可證編號：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證編號：SYXK（皖）2020-001。小鼠飼養在適宜的環境中，溫度保持在（25±1）℃，濕度保持在（55±5）%，適應性喂養7 d后進行實驗操作。

1.1.2 主要試劑 MK-4 購自美國MCE 公司；CCl4購自天津歐博凱化工有限公司；玉米油購自上海阿拉丁生化有限公司；AST、ALT檢測試劑盒購自浙江伊利康生物技術有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒和谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；組織鐵測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）相關試劑購自上海元升生物科技有限公司；研究中引物均由研究室設計并交給江蘇睿捷生物有限公司合成，GPX4 抗體購于英國abcam公司。

1.1.3 主要儀器 純水儀（型號：Merck MILLIPORE QUOTATION）購于美國默克公司；多功能酶標儀（型號：SENERGY2）購于美國伯騰儀器公司；擴增儀（型號：ABI MiniAmp 熱循環儀）購于美國賽默飛公司；熒光定量PCR 儀（型號：ABI7500）購于美國賽默飛公司；全自動生化分析儀（型號：CS-T300）購于長春迪瑞醫療科技股份有限公司；高速冷凍離心機（型號：1424）購于珠海黑馬醫學儀器有限公司，顯影儀（型號：5200-multi）購于上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 小鼠按照體質量S 形分組分為Control組、MK-4組、CCl4模型組（6、12、24 h）、MK-4+CCl4組（6、12、24 h），使每組小鼠體質量平均值基本一致，每組6只。Control組腹腔注射同等劑量玉米油；MK-4組腹腔注射40 mg/kg 的MK-4 溶液，1 h 后腹腔注射同等劑量玉米油；MK-4+CCl4組（6、12、24 h）先腹腔注射40 mg/kg的MK-4溶液，1 h后和CCl4模型組（6、12、24 h）同時腹腔注射0.3 mL/kg CCl4溶液，分別在6、12、24 h進行取材。

1.2.2 血清生化檢測 使用生化分析儀檢測血清中ALT、AST含量。

1.2.3 肝臟MDA 含量測定 精密稱取30 mg 小鼠肝臟組織，放入細胞裂解液（占組織質量10%）進行勻漿或裂解。勻漿或裂解后，10 000～12 000×g離心10 min，取上清備用。提前配置好后續研究所需試劑，按照試劑盒中提供的說明書進行相關操作，使用酶標儀在532 nm測定吸光度，計算出樣品溶液中的MDA 含量后，通過組織質量來表示最初樣品中的MDA含量。

1.2.4 肝臟GSH 含量測定 精密稱取30 mg 小鼠肝臟組織，加入300 μL 的蛋白去除M 液（用于去除樣品中的其他蛋白）充分勻漿后，4 ℃放置10 min 后，10 000×g、4 ℃離心10 min，取上清備用。提前配置好后續研究所需試劑，按照試劑盒中提供的說明書進行相關操作，使用酶標儀在412 nm 處測定吸光度，計算出樣品溶液中GSH 含量后，通過組織質量來表示最初樣品中的GSH含量。

1.2.5 組織病理學檢測 取小鼠新鮮肝大葉置于4%多聚甲醛溶液中，室溫放置搖床固定24 h。進行脫水、包埋、切片、固定和蘇木精-伊紅（HE）染色后顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 組織鐵測定 稱取待測小鼠肝臟30 mg，加入270 μL的生理鹽水，冰水浴條件機械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液待測。按照說明書加入相關試劑混勻后，沸水浴5 min，流水冷卻，3 500 r/min，離心10 min，取上清液200 μL，0.5 cm光徑，波長520 nm，測定各管吸光度光密度值。利用說明書中提供的方法進行計算。

1.2.7 普魯士染色 取小鼠新鮮肝大葉置于4%多聚甲醛溶液中，室溫放置搖床固定24 h。常規脫水包埋、切片、脫蠟至水、Perls 染色15～30 min，脫水、透明、封固后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 Western Blot蛋白表達檢測 稱取50 mg左右的小鼠肝組織，加入500 μL裂解液低溫勻漿后靜置30 min，離心獲取總蛋白，采用酶標儀對蛋白濃度定量。總蛋白經電泳分離再轉至PCDF 膜上，采用5%脫脂牛奶封閉1 h，室溫孵育一抗1 h（GPX4一抗濃度1∶2 000；GAPDH 一抗濃度1∶5 000），室溫孵育對應二抗1 h（GPX4對應二抗濃度1∶50 000；GAPDH 對應二抗濃度1∶10 000）。配制顯影液在顯影儀上顯影，Image Pro 軟件分析蛋白條帶，計算蛋白表達量。

1.2.9 RT-PCR 檢測相關基因 采用TRlzol 法提取肝臟RNA，使用酶標儀將所提取的RNA 樣品濃度定量到1 000 ng/μL，逆轉錄為cDNA 后進行擴增操作。選取18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S）為內參基因，計算長鏈脂酰輔酶A 合成酶4（long-chain acyl-CoA synthetase，ACSL4）、前列腺素內過氧化物酶2（prostaglandinendoperoxide synthase，PTGS2）、GPX4、鐵調素調節蛋白（hemojuvelin，HJV）、膜轉鐵蛋白（ferroportin，FPN）、轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor protein 1，TFR1）和18S 基因的相對表達水平。引物序列如表1所示。

表1 基因的引物序列Table 1 The primer sequence of the gene

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行統計分析，計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MK-4 提前干預對CCl4誘導的ALI 小鼠肝質量系數的影響 與Control組比，MK-4組小鼠的肝質量系數差異無統計學意義，CCl4（12、24 h）組肝質量系數增加，差異均有統計學意義（P值均＜0.05）；與CCl4（12 h）組相比，MK-4+CCl4（12 h）組的肝質量系數下降（P＜0.05）（表2）。

表2 各組小鼠肝質量系數比較Table 2 Liver weight coefficient of mice in each group

2.2 MK-4提前干預對CCl4誘導的ALI小鼠肝細胞壞死情況的影響 與Control 組相比，MK-4 組對小鼠肝臟無明顯損傷作用，且CCl4（6、12、24 h）組隨著CCl4注射時間的延長，小鼠肝組織的炎癥浸潤區域和壞死面積也隨之增加；與CCl4（12 h）組相比，MK-4+CCl4（12 h）組對小鼠肝臟組織中的炎癥浸潤和組織壞死有一定的改善作用（圖1）。

圖1 各組小鼠肝臟組織病理變化HEFigure 1 Pathological changes of liver tissue in each group

2.3 MK-4 提前干預對CCl4誘導的ALI 小鼠肝功能的影響 與Control 組相比，MK-4 組對小鼠的肝功能基本無影響，CCl4（6、12、24 h）組的血清ALT、AST水平明顯增加，差異均有統計學意義（P值均＜0.01）；與CCl4（12 h）組相比，MK-4+CCl4（12 h）組的血清ALT、AST 水平下降（P值均＜0.05）（表3）。

表3 各組小鼠血清中 ALT、AST 水平Table 3 Serum ALT and AST levels of mice in each group

2.4 MK-4提前干預對CCl4誘導的ALI小鼠肝臟中MDA和GSH 水平的影響 ALT、AST、肝質量系數和HE 染色結果均顯示出在12 h 時MK-4 預處理可以明顯減輕CCl4誘導的ALI，因此后續研究采用12 h的MK-4預處理小鼠肝組織進行檢測。如圖2 所示，與Control 組相比，MK-4組并不影響肝臟MDA 水平，但CCl4組卻有顯著增加（P＜0.01）；與CCl4組相比，MK-4+CCl4組肝臟MDA 水平顯著下降（P＜0.01）；此外，肝臟GSH 水平在采用CCl4進行處理后明顯下降（P＜0.01）；與CCl4組相比，MK-4+CCl4組肝臟GSH水平顯著上升（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠肝臟組織MDA及GSH水平Figure 2 MDA and GSH levels in liver tissue of mice in each group

2.5 MK-4提前干預可降低CCl4誘導的ALI小鼠鐵死亡相關基因的表達 與Control 組相比，CCl4刺激后，小鼠肝臟組織中鐵死亡標志基因ASCL4、PTGS2 的mRNA 水平上升，GPX4的mRNA 水平下降（P值均＜0.05）；與CCl4組相比，MK-4+CCl4組鐵死亡標志基因ASCL4、PTGS2 的mRNA 水平顯著下降，GPX4的mRNA 表達上升（P值均＜0.05）（圖3）；CCl4組較Control組，GPX4蛋白表達量下降（P＜0.01），但MK-4+CCl4組較模型組，GPX4 蛋白表達量上升（P＜0.05）（圖4）。

圖3 各組小鼠肝臟組織鐵死亡相關基因的表達Figure 3 Expression of genes related to ferroptosis in liver tissue of mice in each group

圖4 Western Blot檢測各組小鼠肝臟組織中GPX4蛋白水平Figure 4 The levels of GPX4 protein in liver tissues of mice in each group were detected by Western Blot

2.6 MK-4組預處理可改善CCl4誘導的ALI小鼠鐵代謝紊亂 與Control組相比，CCl4刺激后，小鼠肝臟中鐵聚集顆粒明顯增多，給予MK-4干預后，與CCl4組相比，鐵聚集下降（圖5）。與Control 組相比，CCl4刺激后，小鼠肝臟中鐵濃度顯著升高（P＜0.01），給予MK-4 干預后，與CCl4組相比，鐵濃度下降（P＜0.05）；此外，與Control組相比，CCl4組小鼠肝組織中鐵代謝標志基因FPN、HJV 的mRNA 水平均下降（P值均＜0.05），TFR1 的mRNA 水平上升（P＜0.05）；給予MK-4 預處理后，與CCl4組相比，鐵代謝標志基因FPN、HJV的mRNA水平均顯著上升，TFR1的mRNA水平下降，差異均有統計學意義（P值均＜0.05）（圖6）。

圖5 各組小鼠肝臟組織鐵聚集變化（普魯士藍染色，×40）Figure 5 Iron accumulation in liver tissue of mice in each group Prussian dyeing（×40）

圖6 各組小鼠肝臟組織鐵含量以及鐵代謝相關基因的表達Figure 6 Iron content and iron metabolism related gene expression in liver tissue of mice in each group

3 討論

鐵死亡作為一種新發現的非凋亡性細胞死亡形式，其特征為脂質過氧化物的過度積累，導致組織的損傷［9-10］。現有研究表明，CCl4誘導的ALI 中存在鐵死亡的發生［5］，而ALI作為肝病最突出的病因之一，與高發病率和死亡率有著密不可分的關系［11］，因此尋找有效抑制ALI中鐵死亡發生的藥物有著重要的意義。

本研究為了確定MK-4 對CCl4誘導的ALI 是否有保護作用，分別在6、12、24 h 采用CCl4誘導ALI 的前1 h，使用MK-4 進行保護，觀察在各自時間點內，MK-4 保護組和單純CCl4組相比，其ALT、AST、肝質量系數和HE染色結果均顯示出在12 h，而非24 h，MK-4 干預后明顯減輕CCl4誘導的ALI。有文獻［12］表明，MK-4在給藥后在血漿中存在時間不超過24 h，MK-4+CCl4組（24 h）的MK-4 可能在體內已代謝完全，保護失效。此外，CCl4給藥24 h后，與Control 組相比ALT、AST 水平上升近600 倍，肝損傷過于嚴重，這可能也是導致MK-4 對急性ALI 24 h 保護作用不明顯的另一重要原因。

已有研究［13-16］表明，ACSL4、PTGS2 和GPX4 可作為鐵死亡發生的關鍵標志物，ACSL4 和PTGS2 可促進脂質過氧化物的積累，而GPX4 可將有毒的脂質過氧化物轉化成無毒的脂質醇，其中GPX4 作為抗氧化系統中的最關鍵調節蛋白，是驗證鐵死亡發生的金標準。在使用12 h 的小鼠各組織樣本進行RT-PCR 檢測時，CCl4組的ACSL4、PTGS2 的mRNA 表達上調，GPX4 的mRNA 表達下調，而使用MK-4 進行保護后，ACSL4、PTGS2 和GPX4三者的表達水平與CCl4組相比結果均相反，差異均有統計學意義。同時，Western Blot 檢測GPX4蛋白時，CCl4組的GPX4 蛋白表達水平明顯下降，而CCl4+MK-4 組GPX4蛋白表達水平比CCl4組顯著上升。此外，MDA作為脂質過氧化的常用指標［17］，其在CCl4組有明顯升高，而經MK-4干預后呈下降趨勢，GSH作為抗氧化系統中的核心成員［18］，其結果與MDA相反。這些結果都表明ALI中確實存在鐵死亡的發生，MK-4 預處理后ASCL4、PTGS2 的mRNA 水平下降和GPX4 的mRNA 水平上升以及GPX4蛋白水平的變化都提示MK-4 有抑制脂質過氧化的作用，而MDA 水平的下降和GSH 水平的上升再一次驗證MK-4 可通過抑制脂質過氧化物的積累來抑制鐵死亡的發生，從而對CCl4誘導的ALI產生一定的保護效果。

肝臟鐵代謝紊亂會導致鐵過載，從而加劇鐵死亡的發生［13］。有研究［14］表明，FPN 負責將鐵從鐵儲存細胞運輸至血液中，以優化全身鐵穩態，TFR1 則是將鐵從細胞外環境導入細胞，HJV 作為鐵調素的上游分子，與其共同維持細胞內的鐵含量來防止鐵代謝紊亂。三者都與鐵死亡存在著密不可分的關系。本研究結果顯示，小鼠在給予CCl4刺激后，FPN 和HJV 的mRNA 水平均不同程度地下降，TFR1 的mRNA 水平上升，MK-4 進行保護后，FPN 和HJV 的mRNA 水平均上升，TFR1 的mRNA 水平下降。同時，在給予MK-4 保護CCl4誘導ALI 的小鼠肝臟中，鐵含量也明顯下降。這些結果再次提示，MK-4不僅通過調節抗氧化系統來抑制鐵死亡的發生，同時也可改善肝臟中鐵代謝紊亂來保護CCl4誘導的ALI。

綜上所述，本研究得出結論，CCl4誘導的ALI中發生鐵死亡事件，而MK-4 可通過降低脂質過氧化物，抑制鐵死亡以及調節鐵代謝來改善CCl4誘導的ALI，使得MK-4及其類似物在未來可能用于預防和治療ALI。

倫理學聲明：本研究方案于2022 年5 月23 日經由安徽醫科大學動物倫理委員會審批，批號：202200523，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：葉露、趙凡、張佳怡負責實驗；葉露負責查閱文章，撰寫論文；黃倩倩、王建青負責修改文章并最后定稿。