外泌體在肝內(nèi)膽管癌中的作用

唐晉元，楊陳鳳麟，梁冬樂，羅雨豪

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 瀘州 646000

2 廊坊市人民醫(yī)院腫瘤科，河北 廊坊 065000

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一種具有膽管細胞分化特征的膽管上皮惡性腫瘤，占所有類型原發(fā)性肝癌的10%～15%。ICC 惡性程度極高，其5 年生存率低于10%［1］。由于缺乏典型的癥狀和體征，早期ICC 很難通過常規(guī)篩查明確診斷。外泌體是細胞分泌到體液中的特殊囊泡，含有DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等多種物質(zhì)。外泌體將核酸或蛋白質(zhì)遞送至不同細胞，是細胞間通訊的重要介質(zhì)。ICC 具有特定的外泌體表達譜，在腫瘤發(fā)生進展中起重要作用，具有潛在的腫瘤診療價值［2］。

1 ICC的發(fā)生發(fā)展

1.1 基因驅(qū)動促進ICC ICC 在基因組水平上具有高度異質(zhì)性，這為個性化的靶向治療開辟了新的機會。DNA測序研究表明多個基因以及信號通路參與了ICC的發(fā)生發(fā)展（圖1）。FGFR融合以及TP53、KRAS、IDH1/2和BAP1突變是ICC 中最常見的改變。其中，KRAS 和IDH1/2 的突變發(fā)生在基因的易突變點G12A/C/D、R132C/G/L，而TP53的突變則發(fā)生在整個基因上。值得注意的是，一項全外顯子組測序研究［3］表明，F(xiàn)GFR2 融合定義了ICC 的獨特亞型。綜合基因組研究［4-5］發(fā)現(xiàn)基因突變與ICC 患者預(yù)后相關(guān)。在3 個獨立的患者隊列中，TP53 或KRAS的腫瘤突變與ICC 手術(shù)切除后較低的總生存期（OS）相關(guān)，與IDH突變患者或這3個基因無突變的患者相比，腫瘤復(fù)發(fā)率更高［6］。大多數(shù)ICC是體細胞突變，然而，一部分患者（5%～10%）在BRCA1/2、ATM 或BAP1 中存在種系突變，這可能導(dǎo)致膽管癌［7-8］。

ICC發(fā)生的危險因素復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤病因可能影響癌基因相關(guān)突變。基因組測序顯示，與肝吸蟲陰性ICC相比，肝吸蟲相關(guān)ICC 與體細胞突變數(shù)量增加之間存在關(guān)聯(lián)［9］。TP53突變和ERBB2擴增是肝吸蟲相關(guān)ICC中的主要基因組改變，而BAP1 和IDH1/2 在非肝吸蟲相關(guān)病例中經(jīng)常發(fā)生突變［10-11］。同樣，TP53 缺陷的膽管癌與HBV顯著相關(guān)［6］。ICC基因組的多樣性反映了對不同腫瘤類別的個性化治療的需求，對將來根據(jù)患者的基因突變譜進行腫瘤診斷和精準靶向治療有著重要臨床意義。

1.2 炎癥和免疫失調(diào)介導(dǎo)ICC ICC 的分子發(fā)病機制見圖2。慢性炎癥是ICC 的危險因素。長期的膽道損傷、炎癥應(yīng)激和膽汁淤積后，大量的促炎因子、細胞生長因子和有毒膽汁酸會引起正常膽管細胞發(fā)生有絲分裂，進而導(dǎo)致腫瘤相關(guān)突變的積累和不受控制的細胞增殖產(chǎn)生。癌細胞和腫瘤基質(zhì)之間的相互作用激活腫瘤細胞中TGF-β 信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路、Wnt信號通路、IL-6/STAT3信號通路等多種信號通路，介導(dǎo)癌細胞存活、增殖、遷移、免疫細胞浸潤、免疫抑制微環(huán)境形成、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、細胞外基質(zhì)重塑和淋巴管生成，進而支持ICC 的發(fā)生發(fā)展。綜合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明ICC 存在兩個不同的生物亞類：炎癥亞型（38%），主要以激活免疫相關(guān)信號通路為特征；以及增殖亞型（62%），這與OS減少有關(guān)，主要富集于經(jīng)典致癌途徑，如絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、受體酪氨酸激酶和MET信號通路，以及KRAS突變增加［12］。

圖2 ICC的分子發(fā)病機制Figure 2 Molecular pathogenesis of cholangiocarcinoma

2 外泌體簡介

外泌體為直徑40～100 nm細胞外囊泡，密度為1.13～1.19 g/mL，具有經(jīng)典的“杯狀”或“皿狀”形態(tài)，其在大小、形態(tài)、組成等多個方面與其他細胞外囊泡存在差異（表1）。外泌體可攜帶參與細胞間信號通訊的多種分子（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA）［13］。蛋白質(zhì)可分為結(jié)構(gòu)蛋白和作為標記的特異蛋白，如CD9、CD63、CD81 和CD82 等［14］。核酸包括miRNA、DNA、mRNA、lncRNA等。外泌體可以由不同細胞釋放，也可從多種體液中分離出來，如血漿［15］、尿液、支氣管肺泡灌洗液［16］、唾液、母乳、羊水、腹水等。研究［17-19］表明外泌體核酸可被轉(zhuǎn)運到受體細胞產(chǎn)生生理或病理效應(yīng)，并介導(dǎo)細胞通訊、免疫反應(yīng)、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲和血管生成在內(nèi)的多種生物學(xué)行為。外泌體被認為在腫瘤的診斷和治療中發(fā)揮著重要作用，參與ICC發(fā)生發(fā)展、侵襲及預(yù)后的各個環(huán)節(jié)。

表1 外泌體與其他傳統(tǒng)細胞外囊泡的區(qū)別Table 1 Differences between exosomes and other traditional extracellular vesicles

3 外泌體在ICC中的診斷價值

3.1 外泌體蛋白在ICC 中的診斷價值 外泌體特異性蛋白可作為ICC 診斷的生物標志物。有研究［20］表明，熱休克蛋白90（HSP90）在侵入性ICC細胞外泌體中差異磷酸化，隨著腫瘤分期增加，HSP90B-S255位點磷酸化水平顯著降低，提示HSP90 有望作為預(yù)測ICC 轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標志物。Ikeda 等［21］通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CLDN3在人膽汁來源的外泌體中富集，外泌體CLDN3對膽汁衍生型ICC預(yù)測的敏感度為87.5%，特異度為87.5%，提示其可能是ICC 的有效生物預(yù)測標志物。Arbelaiz 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體、黏蛋白1和整合素β4在ICC外泌體中高度富集，促進腫瘤細胞的生長、去分化、侵襲及遷移，并與不良結(jié)局相關(guān)。其中整合素β4 還能特異性預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移位置，以上結(jié)果表明外泌體蛋白在促進ICC細胞生長和轉(zhuǎn)移過程中具有潛在的關(guān)鍵作用。

3.2 外泌體核酸在ICC中的診斷價值 外泌體中的核酸包括miRNA、lncRNA、circRNA等，研究發(fā)現(xiàn)其可能在ICC診斷中發(fā)揮重要價值。有文獻［23］報道，外泌體中miR-200 家族中的4 個miRNA（miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p和miR-200c-3p）診斷ICC的受試者工作特征曲線下面積比傳統(tǒng)腫瘤標志物CA19-9更高，被認為是ICC 潛在的新型診斷生物標志物。并且外泌體中miR-200a/c-3p的表達與ICC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期之間存在顯著正相關(guān)。Han等［24］和Gao等［25］的研究顯示，抑制miR-10a可以通過下調(diào)PI3K-AKT途徑來抑制膽管癌，研究中PI3K-AKT途徑在膽汁外泌體中顯著富集，因此膽汁外泌體中的miR-10a-5p 可以是潛在的診斷生物標志物，同時可作為個體化治療靶點。此外，據(jù)報道［26］，lncRNA NEAT1 在ICC 組織和細胞中過表達，通過與miR-186-5p 直接相互作用，促進ICC細胞生長、遷移和侵襲。在Sun等［27］的研究中，ICC 細胞中的lncRNA SNHG3 顯著上調(diào)，通過miR-3173-5p/ERG 軸促進膽管癌進展。circRNA 是近年來新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，有文獻［28］報道，circRNA Hsa_circ_0050898在ICC中顯著上調(diào)，作為miR-424-5p的分子海綿以及與YBX1相互作用轉(zhuǎn)錄激活FZD7來促進ICC增殖和轉(zhuǎn)移，是ICC的潛在預(yù)后標志物和治療靶點。

4 外泌體參與ICC的發(fā)生發(fā)展

有研究［29-30］指出，癌細胞衍生的外泌體可以通過多種機制調(diào)節(jié)腫瘤進展。外泌體參與缺氧微環(huán)境的調(diào)控、新生血管的形成及免疫逃逸等過程，進而加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展（圖3）。

圖3 ICC源性外泌體調(diào)節(jié)腫瘤進展的機制Figure 3 ICC derived exosomes can regulate tumor progression through a variety of mechanisms

4.1 外泌體促進ICC增殖轉(zhuǎn)移 在Li等［31］研究中，肝癌腫瘤細胞通過分泌富含Shh蛋白的外泌體，激活Hedgehog信號通路促進細胞生長，而通過shRNA 降低Shh 表達水平時，腫瘤細胞源性的外泌體則失去相關(guān)功能，證明外泌體攜帶的Shh 是激活肝癌細胞中Hedgehog 信號通路的主要信號分子。

4.2 外泌體調(diào)控腫瘤微環(huán)境 Wang等［32］研究顯示，缺氧本身會誘導(dǎo)炎性分子的增加，如IL-6、IL-1、TNF-α 和IL-10 等。另外，HSP70 激活NF-κB 信號后，間充質(zhì)干細胞分泌大量的趨化因子CCL-2、CCL-7、CCL-12，增加微環(huán)境中的炎性因子濃度，促使單核細胞、巨噬細胞在腫瘤部位聚集和極化，塑造腫瘤免疫抑制環(huán)境［33-34］。

4.3 外泌體調(diào)控ICC 血管生成 有文獻［35］報道，缺氧條件下腫瘤外泌體增加的同時誘導(dǎo)血管形成。腫瘤來源的外泌體本身富含TGF-β 以及VEGF，可以直接誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮遷移和增殖。同時，腫瘤細胞分泌的含有miR-205 的外泌體通過卵巢癌PTEN/AKT 途徑誘導(dǎo)血管生成［36］。在癌癥的情況下，富含可溶性E-鈣黏蛋白的外泌體是血管生成的有效刺激物，可能與卵巢癌患者惡性腹水的形成和廣泛的腹膜轉(zhuǎn)移有關(guān)［37］。

4.4 外泌體介導(dǎo)ICC 免疫逃逸 研究［38］顯示，腫瘤進展的另一個關(guān)鍵步驟是逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視，缺氧誘導(dǎo)的腫瘤外泌體在CSF-1、MCP-1 和TGF-β 等趨化因子和細胞因子中均豐富，可通過影響巨噬細胞募集和極化來改變宿主免疫微環(huán)境，增強腫瘤進展。Zhang［39］等研究發(fā)現(xiàn)，Circ-UHRF1存在于肝癌患者分泌的血漿外泌體中，通過循環(huán)UHRF1/miR-449c-5p/TIM-3 軸抑制自然殺傷細胞活性。除了外泌體中含有的成分外，它們的外部分子PD-L1 可以通過與PD-1 表面的直接結(jié)合來抑制T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核細胞的免疫功能，以促進腫瘤免疫逃逸［40］。最近的研究［40-41］表明，來自癌細胞的外泌體也表達PD-L1，因此表達PD-L1 的外泌體也能損害免疫功能并促進腫瘤生長。

5 外泌體在ICC中的治療價值

5.1 外泌體作為藥物輸送載體治療ICC Moon等［42］研究顯示，外泌體是理想的藥物輸送載體，外泌體具有組織特異性高、安全性好和穩(wěn)定性好的特點。它們具有磷脂雙分子層，可以直接與靶細胞的質(zhì)膜融合，進而將藥物靶向遞送到腫瘤血管和腫瘤細胞中，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。有基礎(chǔ)和臨床研究［43］表明，當(dāng)藥物加載到外泌體進行抗腫瘤治療時，抗癌藥物可以比僅單純靜脈給藥時更有效地遞送。

5.2 外泌體影響ICC 和腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAF）的相互作用 有文獻［44-46］報道，CAF 在激活膽管癌細胞和控制癌癥生長、侵襲和耐藥性方面具有旁分泌功能（圖4），CAF 通過旁分泌途徑與ICC 細胞相互通信，介導(dǎo)癌癥生長和侵襲，并獲得對化療藥物（如吉西他濱）的耐藥性［47］。Yang 等［48］將miR-206模擬物轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞或CAF中，IL-6和TGF-β1表達降低。ICC 細胞與CAF 之間的相互促進作用減弱，惡性腫瘤被抑制，表明miR-206 可用作抑制腫瘤生長和提高吉西他濱治療效率的藥物。Ota 等［49］研究發(fā)現(xiàn)，包含miR-30e 的外泌體可以通過靶向膽管癌細胞中的Snail來抑制TGF-β 誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的侵襲和遷移。因此，miR-30e有可能成為一種腫瘤抑制基因，并且可能是人類ICC 的潛在治療靶點。在腫瘤微環(huán)境中使用外泌體包裹的miR-30e靶向上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的治療手段可能是晚期膽管癌患者的重要治療方法。

圖4 外泌體在ICC與CAF細胞通信中的作用Figure 4 Effects of exosomes on the interaction between ICC and CAF cells

6 小結(jié)及展望

綜上所述，外泌體是腫瘤診斷的新型生物標志物，代表了一個熱門的新興研究領(lǐng)域。外泌體源性蛋白及miRNA 在ICC 診斷及治療中發(fā)揮重要作用，ICC 患者早期外泌體源性蛋白、miRNA 含量及表達譜區(qū)別于健康人，且不同病因、病理類型及不同疾病間存在表達譜的差異，因此使用多種外泌體生物標志物可能可以預(yù)測早期ICC。同時，外泌體作為生物源性載體，具有兼容性好、安全性好、穩(wěn)定性高等特點，基于外泌體的給藥系統(tǒng)研發(fā)可能對未來腫瘤的治療發(fā)揮重要作用。綜上，外泌體在ICC 診斷、治療和預(yù)后判斷方面開辟了新的途徑，具有重要臨床價值。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：唐晉元負責(zé)課題設(shè)計與論文撰寫；楊陳鳳麟、梁冬樂負責(zé)繪制表格與圖片；羅雨豪負責(zé)思路設(shè)計，文章修改和最后定稿。