歐盟微生物農(nóng)藥登記中次生代謝產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

申繼忠，張海燕，余武秀

(1.上海艾農(nóng)國(guó)際貿(mào)易有限公司，上海200122；2.江蘇永安化工有限公司，江蘇漣水223404)

1 微生物的次生代謝和次生代謝產(chǎn)物

代謝是生命體賴以生存的重要生命活動(dòng)。代謝是指生物體內(nèi)所發(fā)生的用于維持生命的一系列有序的化學(xué)反應(yīng)的總稱。這些反應(yīng)使得生物體能夠生長(zhǎng)和繁殖、保持它們的結(jié)構(gòu)以及對(duì)外界環(huán)境做出反應(yīng)。代謝的實(shí)質(zhì)是生命體內(nèi)部及其與外界環(huán)境之間進(jìn)行的物質(zhì)和能量交換。因此可以將代謝分如下幾類：分解代謝(對(duì)大的分子進(jìn)行分解以獲得能量，如細(xì)胞呼吸)，合成代謝(利用能量來(lái)合成細(xì)胞中的各個(gè)組分，如蛋白質(zhì)和核酸等)，物質(zhì)代謝(指生物體與外界環(huán)境之間物質(zhì)的交換和生物體內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)變過程)，能量代謝(指生物體與外界環(huán)境之間能量的交換和生物體內(nèi)能量的轉(zhuǎn)變過程)。

另外，根據(jù)代謝產(chǎn)物對(duì)于生命體的意義還可以將代謝區(qū)分為初級(jí)代謝和次生代謝。初級(jí)代謝的代謝系統(tǒng)、代謝途徑和代謝產(chǎn)物在各類生物中都基本相同，是一類普遍存在于各類微生物中的一種基本代謝類型。初級(jí)代謝產(chǎn)物是指微生物通過代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的、自身生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。在不同種類的微生物細(xì)胞中，初級(jí)代謝產(chǎn)物的種類基本相同。此外，初級(jí)代謝產(chǎn)物的合成在不停的進(jìn)行著，任何一種產(chǎn)物的合成發(fā)生障礙都會(huì)影響微生物正常的生命活動(dòng)，甚至導(dǎo)致死亡。

次生代謝的概念最早于1891 年由Kossel 明確提出。一般指微生物在一定的生長(zhǎng)時(shí)期，以初級(jí)代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對(duì)微生物生命活動(dòng)無(wú)生理功能的物質(zhì)，這一過程被稱為次生代謝，所形成的產(chǎn)物為次生代謝產(chǎn)物。次生代謝產(chǎn)物多是分子結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的化合物，如抗微生物藥物、毒素、生物堿等。

次生代謝在植物和微生物中都有發(fā)生，并且代謝途徑和代謝產(chǎn)物因不同生物而異，就是同種生物也會(huì)由于培養(yǎng)條件不同而產(chǎn)生不同的次生代謝產(chǎn)物。在次生代謝產(chǎn)物中，對(duì)維持生命占有重要地位的并不少，但另一方面，各種動(dòng)植物和微生物所大量積累的生物堿、類萜(ferpenoid)、酚類、抗菌物質(zhì)、色素等，其生理意義并不完全清楚。

在微生物的新陳代謝中，一般將微生物從外界吸收各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過分解代謝和合成代謝，生成維持生命活動(dòng)的物質(zhì)和能量的過程稱為初級(jí)代謝。初級(jí)代謝產(chǎn)物有單糖或單糖衍生物、核苷酸、維生素、氨基酸、脂肪酸等單體以及由它們組成的各種大分子聚合物，如蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂質(zhì)等生命必需物質(zhì)。

微生物生長(zhǎng)到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜而且對(duì)微生物本身無(wú)明顯生理功能或并非是微生物生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)，如抗微生物藥物、毒素、激素、色素等屬于微生物的次生代謝產(chǎn)物。不同種類的微生物所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不相同，它們可能積累在細(xì)胞內(nèi)，也可能排到外環(huán)境中。

微生物作為自然界種群數(shù)量最為龐大的一類生命體，與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，因此對(duì)微生物的生命過程和代謝研究發(fā)展迅速。

Xu 等[1]統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生各種次生代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物分布在30 個(gè)不同屬的各種真菌中，包括一些罕見的菌種。其中，球毛殼(Chaetomium globosum)是一種很特殊的微生物，因?yàn)樗墚a(chǎn)生大量獨(dú)特的、結(jié)構(gòu)上具有重要生物活性的球毛殼菌素(chaetoglobosins)。這些代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原真菌的抗真菌活性表明，內(nèi)生真菌可以通過產(chǎn)生對(duì)植物病原有毒甚至致命的生物活性分子來(lái)保護(hù)其宿主植物，并突顯了內(nèi)生真菌在產(chǎn)生有價(jià)值的代謝產(chǎn)物方面的潛力(表1)。

表1 不同微生物產(chǎn)生的抗真菌次生代謝產(chǎn)物數(shù)量[1]

微生物次生代謝產(chǎn)物也具有廣泛的生物活性，而且很多次生代謝產(chǎn)物同時(shí)具有多種活性。有些產(chǎn)物具有農(nóng)藥活性，可用于多種作物保護(hù)目的(表2)[2]。

表2 各種微生物及其代謝產(chǎn)物的農(nóng)藥作用示例[2]

2 歐盟微生物農(nóng)藥登記的法規(guī)修訂

微生物農(nóng)藥深受全球各國(guó)農(nóng)藥主管部門的關(guān)注。不同國(guó)家均采取盡可能有利于快速進(jìn)入市場(chǎng)的登記審批制度。微生物農(nóng)藥的活性成分主要有微生物活體和/或其次生代謝產(chǎn)物。微生物活體的登記審批一般不存在太多爭(zhēng)議，但各國(guó)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的登記則有不同的措施和要求。美國(guó)對(duì)活體微生物和次生代謝產(chǎn)物均采取比較寬松的政策，如含有多種次生代謝活性物質(zhì)的Majestene(滅活的發(fā)酵液)被批準(zhǔn)作為殺線蟲劑[3]。我國(guó)也批準(zhǔn)登記了各種微生物次生代謝產(chǎn)物作為農(nóng)藥使用，如井岡霉素、武夷菌素等[4]。澳大利亞生物農(nóng)藥登記要求明確指出：如果微生物體產(chǎn)生或被懷疑可能產(chǎn)生毒素或有毒代謝物，則必須對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定，并在可能的情況下進(jìn)行分離。毒素或有毒代謝物可能被要求提交完整的代謝和動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果。一些發(fā)展中國(guó)家如越南，則沒有明確提出與代謝物有關(guān)的要求。

歐盟一直重視化學(xué)農(nóng)藥有效成分的環(huán)境代謝產(chǎn)物和微生物代謝產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。有多種農(nóng)藥有效成分因?yàn)榇x產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)不被接受而遭到歐盟的禁用。為了區(qū)別對(duì)待化學(xué)農(nóng)藥和微生物農(nóng)藥，并盡可能減少對(duì)微生物代謝產(chǎn)物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的要求，以促進(jìn)微生物農(nóng)藥快速上市，2022 年歐盟批準(zhǔn)了新的與微生物農(nóng)藥登記相關(guān)的法規(guī)。

歐盟微生物農(nóng)藥包括基于細(xì)菌、真菌、病毒和原生動(dòng)物等生產(chǎn)的產(chǎn)品(主要指活體微生物產(chǎn)品)。2022 年2 月8 日歐盟成員國(guó)批準(zhǔn)了4 項(xiàng)實(shí)施法規(guī)(Implementing Regulations)，修訂了適用于微生物的現(xiàn)行法規(guī)。新的法規(guī)與歐洲綠色協(xié)議(European Green Deal)完全配合，并有助于實(shí)現(xiàn)從農(nóng)場(chǎng)到餐桌戰(zhàn)略(Farm to Fork strategy)的目標(biāo)。4 項(xiàng)新法規(guī)包括：微生物有效成分的審批標(biāo)準(zhǔn)[Commission Regulation (EU) 2022/1438][5]、微生物活性物質(zhì)登記審批需要提交的信息和數(shù)據(jù)要求[Commission Regulation (EU) 2022/1439][6]、微生物農(nóng)藥制劑產(chǎn)品登記所需提交的信息和數(shù)據(jù)要求[Commission Regulation (EU) 2022/1440][7]以及評(píng)價(jià)和授權(quán)含微生物生物制劑產(chǎn)品的統(tǒng)一原則[Commission Regulation(EU)2022/1441][8]。

這些新法規(guī)將促進(jìn)微生物農(nóng)藥進(jìn)入市場(chǎng)。

2022 年的修訂，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：⑴允許使用同行評(píng)審的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)作為登記資料的部分內(nèi)容。⑵更新了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)規(guī)則。⑶為微生物修訂了“低風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥”的定義。⑷清楚地定義了“抗微生物藥物耐藥性”等幾個(gè)概念。⑸在新的“統(tǒng)一評(píng)估原則”中明確給出“受關(guān)切代謝產(chǎn)物”(metabolites of concern)的定義，不再提相關(guān)代謝產(chǎn)物(relevant metabolite)一詞(但該詞仍適用于化學(xué)農(nóng)藥)。舊的原則中只有“相關(guān)代謝產(chǎn)物”(適用于化學(xué)農(nóng)藥和微生物農(nóng)藥)的概念但是沒有給出準(zhǔn)確定義。⑹“受關(guān)切代謝產(chǎn)物”的定義：是指被評(píng)估微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有已知的毒性或已知的相關(guān)抗微生物藥物活性，其在微生物制劑(MPCA)中存在的濃度可能對(duì)人類健康、動(dòng)物健康或環(huán)境構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)，和/或無(wú)法充分證明代謝產(chǎn)物的原位生產(chǎn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估無(wú)關(guān)。

修訂后的歐盟微生物農(nóng)藥登記法規(guī)對(duì)微生物次生代謝產(chǎn)物作出如下說(shuō)明：⑴如果申請(qǐng)者聲稱其所生產(chǎn)的微生物農(nóng)藥中存在的一種或多種次生代謝產(chǎn)物是產(chǎn)品發(fā)揮植物保護(hù)作用的有效成分的一部分，則這些代謝產(chǎn)物的含量應(yīng)按照化學(xué)農(nóng)藥登記要求的新規(guī)定予以聲明。⑵申請(qǐng)人應(yīng)確定并列出微生物可能產(chǎn)生的受關(guān)切的次生代謝產(chǎn)物，并根據(jù)登記要求的相關(guān)規(guī)定(有效成分審批資料要求的某些內(nèi)容)提交用于確定或排除受關(guān)切代謝產(chǎn)物的信息摘要，除非該微生物是病毒。⑶如果有效物質(zhì)屬于以下2 類，則將其歸為化學(xué)農(nóng)藥有效成分進(jìn)行審批：化學(xué)物質(zhì)(包括信息化合物和從生物材料中提取的物質(zhì))，或由微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物(包括從微生物中純化的代謝產(chǎn)物或者從能復(fù)制或轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的產(chǎn)生菌中提純的代謝產(chǎn)物)。⑷除非另有說(shuō)明，有關(guān)(潛在)代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)要求適用于生物防治劑母藥(TG-MPCA)或制劑產(chǎn)品(MPCP)中存在的代謝產(chǎn)物以及使用后原位產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

3 修訂后的法規(guī)對(duì)受關(guān)切次生代謝產(chǎn)物的信息要求

3.1 歐盟微生物農(nóng)藥統(tǒng)一評(píng)審原則對(duì)受關(guān)切代謝產(chǎn)物的評(píng)審要求

在統(tǒng)一評(píng)審原則的各條款下均對(duì)受關(guān)切次生代謝產(chǎn)物的信息提出了相應(yīng)的要求：⑴評(píng)價(jià)受關(guān)切代謝產(chǎn)物的身份信息和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。⑵根據(jù)活性成分審批要求法規(guī)Regulation(EU) No 283/2013 中要求的信息評(píng)價(jià)受關(guān)切代謝產(chǎn)物在儲(chǔ)藏過程中發(fā)生的變化。⑶受關(guān)切代謝產(chǎn)物對(duì)植物的藥害評(píng)價(jià)。⑷對(duì)受關(guān)切代謝產(chǎn)物分析方法的評(píng)價(jià)、殘留分析方法評(píng)價(jià)。⑸評(píng)價(jià)受關(guān)切代謝產(chǎn)物的毒性；觀察到的或預(yù)期的由于受關(guān)切代謝產(chǎn)物引起的植物保護(hù)產(chǎn)品的不良毒理學(xué)影響(對(duì)操作者、工人、旁觀者和居民)；代謝產(chǎn)物殘留引起的風(fēng)險(xiǎn)；代謝產(chǎn)物殘留水平。

3.2 活性成分審批需要提交的受關(guān)切代謝產(chǎn)物的信息

⑴相關(guān)雜質(zhì)的身份和定量信息(最高含量)。⑵對(duì)靶標(biāo)生物的作用方式和寄主范圍：應(yīng)提供來(lái)自科學(xué)同行評(píng)審文獻(xiàn)或任何其他可靠來(lái)源的關(guān)于受關(guān)切代謝產(chǎn)物可能的作用方式和目標(biāo)生物可能暴露于受關(guān)切代謝產(chǎn)物的途徑的信息。⑶有關(guān)代謝產(chǎn)物的信息：申請(qǐng)人應(yīng)在這一項(xiàng)下確定并列出微生物產(chǎn)生的受關(guān)切代謝產(chǎn)物，包括根據(jù)活性成分?jǐn)?shù)據(jù)要求的某些方面的要求提交的用于確定或排除受關(guān)切代謝產(chǎn)物的信息摘要，除非該微生物是病毒。可根據(jù)科學(xué)文獻(xiàn)或?qū)ξ⑸锘蛎芮邢嚓P(guān)菌株進(jìn)行的毒性、生態(tài)毒性或抗微生物藥物活性研究的觀察來(lái)確定受關(guān)切代謝產(chǎn)物。通過采用適當(dāng)?shù)幕蚪M方法(如全基因組測(cè)序)證明，不存在生產(chǎn)所鑒定的潛在問題代謝產(chǎn)物所需的基因，應(yīng)被視為證明該代謝產(chǎn)物不存在此類危害的證據(jù)。⑷受關(guān)切代謝產(chǎn)物分析方法。⑸受關(guān)切代謝產(chǎn)物殘留分析方法。⑹治療和急救措施：提交受關(guān)切代謝產(chǎn)物的已知拮抗劑(解毒劑)信息。⑺醫(yī)學(xué)監(jiān)測(cè)報(bào)告應(yīng)包括受關(guān)切代謝產(chǎn)物信息。⑻代謝產(chǎn)物信息和毒性研究。⑼代謝產(chǎn)物殘留數(shù)據(jù)。⑽微生物以及受關(guān)切代謝產(chǎn)物的環(huán)境發(fā)生、環(huán)境行為和歸宿，代謝產(chǎn)物的環(huán)境暴露數(shù)據(jù)。⑾代謝產(chǎn)物的信息和生態(tài)毒理學(xué)研究[4]。

3.3 制劑登記需要提交的受關(guān)切代謝產(chǎn)物的信息

⑴制劑產(chǎn)品的物理、化學(xué)和技術(shù)特性。⑵儲(chǔ)存前后受關(guān)切代謝產(chǎn)物的存在。⑶關(guān)于制劑產(chǎn)品的進(jìn)一步信息：使用設(shè)備的清洗。⑷分析方法：受關(guān)切代謝產(chǎn)物的標(biāo)樣(技術(shù)上可行的話)和分析方法。⑸藥效數(shù)據(jù)：受關(guān)切代謝產(chǎn)物對(duì)后茬作物的影響。⑹對(duì)人的影響：潛在毒性評(píng)價(jià)，包括皮膚致敏性、額外毒性數(shù)據(jù)。⑺對(duì)非靶標(biāo)生物的影響：對(duì)陸棲脊椎動(dòng)物、魚、水生無(wú)脊椎動(dòng)物、藻類、水生植物(大型水藻)、蜜蜂及其他非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物的影響，對(duì)土壤中非靶標(biāo)中、大型生物的影響，對(duì)非靶標(biāo)陸生植物的影響[5]。

4 微生物次生代謝產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

2020 年，歐盟健康和食品安全總理事會(huì)頒布了用作農(nóng)藥的微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)指南[9]。指南的目的是幫助評(píng)審人員對(duì)微生物農(nóng)藥制劑中存在的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，確定出可能受關(guān)切的次生代謝產(chǎn)物并進(jìn)行相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。通過定性定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估確定受關(guān)切次生代謝產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)是否可被接受。

4.1 指南對(duì)微生物(受關(guān)切)次生代謝產(chǎn)物的定義

次生代謝產(chǎn)物對(duì)微生物的初級(jí)代謝過程并不是必需的，它表現(xiàn)出一些可能與微生物生存功能有關(guān)的生物活動(dòng)，如競(jìng)爭(zhēng)、寄生或共生、金屬運(yùn)輸?shù)取?/p>

次生代謝產(chǎn)物通常是在特定的物理和生物條件共同存在的情況下由微生物產(chǎn)生的。單個(gè)微生物菌株產(chǎn)生令人關(guān)切的代謝產(chǎn)物的能力取決于該特定菌株許多特有的環(huán)境和遺傳因素。一種或多種菌株不產(chǎn)生不受歡迎的化合物并不能推定同一種內(nèi)所有菌株也不產(chǎn)生這類化合物。

受關(guān)切次生代謝產(chǎn)物是被評(píng)估菌株產(chǎn)生的具有已知的毒性或抗微生物藥物活性的代謝產(chǎn)物，其可接受的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)通過定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估來(lái)證明。

4.2 關(guān)于原位(in situ)產(chǎn)生的未知代謝產(chǎn)物

所謂原位產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，是指活體微生物制劑使用之后其在田間使用部位可能產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。指南文件中描述的方法是基于次生代謝產(chǎn)物的毒性研究、作用方式、對(duì)收獲后的發(fā)酵培養(yǎng)基以及對(duì)微生物有害生物防治劑母藥(TG-MPCA)和/或微生物防治劑(MPCP)的分析數(shù)據(jù)。不是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和/或與作用方式無(wú)關(guān)的原位產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)不在本指南的范圍內(nèi)。由于這些代謝產(chǎn)物是未知的，所以它們?cè)谔烊晃⑸镏械拇嬖跓o(wú)法被合理地證實(shí)。可以預(yù)期，它們的產(chǎn)量很低，因?yàn)榇嬖诟?jìng)爭(zhēng)而且微生物可利用的資源和能量都有限。此外，微生物被認(rèn)為無(wú)處不在，因此人類、動(dòng)物和環(huán)境都會(huì)自然接觸到這些代謝產(chǎn)物。所以，除非通過公開文獻(xiàn)綜述、毒性研究、基因組表征或其他與微生物有關(guān)的信息能夠確定這些代謝產(chǎn)物危害，否則可以合理地假設(shè)這些未知代謝產(chǎn)物不會(huì)構(gòu)成可預(yù)見的風(fēng)險(xiǎn)，因此不構(gòu)成法規(guī)意義上的“相關(guān)代謝產(chǎn)物(relevant metabolites)”。

4.3 關(guān)于具抗微生物藥物活性的次生代謝產(chǎn)物

指南文件涉及的與微生物代謝產(chǎn)物有關(guān)的2 種危害是毒性和抗微生物藥物活性。歐盟特別關(guān)注抗微生物藥物的農(nóng)業(yè)應(yīng)用。因此，如果已知某種微生物能夠產(chǎn)生具有重要醫(yī)學(xué)意義的抗微生物藥物(依據(jù)WHO的定義)，則應(yīng)評(píng)估制劑產(chǎn)品中是否存在這類化合物。

WHO 對(duì)抗微生物藥物(antimicrobials)耐藥性(AMR)的釋義如下：抗微生物藥物包括抗生素、抗病毒藥、抗真菌藥和抗寄生蟲藥，它們是用于預(yù)防和治療人類、動(dòng)物和植物感染的藥物。而抗微生物藥物耐藥性是指當(dāng)細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲隨著時(shí)間的推移發(fā)生變化，不再對(duì)藥物產(chǎn)生反應(yīng)。

與在制劑產(chǎn)品中存在的抗微生物藥物的釋放不同，土著或施用后的外來(lái)微生物原位產(chǎn)生的抗微生物藥物只在很小的范圍內(nèi)產(chǎn)生一定時(shí)期的拮抗作用。即使土壤或植物環(huán)境中存在人類或動(dòng)物病原體，暴露于這些抗微生物藥物而直接相互作用，這種暴露也僅限于短時(shí)間，之后是長(zhǎng)時(shí)間的不暴露。這種情況不利于抗微生物藥物耐藥性的發(fā)展和持續(xù)。因此，用于植物保護(hù)產(chǎn)品的微生物原位產(chǎn)生的抗微生物藥物不被視為對(duì)人類和動(dòng)物健康構(gòu)成可預(yù)見的風(fēng)險(xiǎn)。因此，沒有必要對(duì)這些原位產(chǎn)生的抗微生物藥物化合物進(jìn)行評(píng)估。

為了便于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，指南文件給出了2 個(gè)定義，可視為評(píng)估原則。

⑴潛在受關(guān)切的代謝產(chǎn)物：被評(píng)估菌株可能產(chǎn)生的在基于文獻(xiàn)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)的初步評(píng)估中(即在該指南中描述的評(píng)估的第2 階段結(jié)束時(shí))已經(jīng)確定具有毒性或抗微生物藥物活性的代謝物。對(duì)此類次生代謝產(chǎn)物進(jìn)一步的評(píng)估是必要的，以確定其是否屬于受關(guān)切的次生代謝產(chǎn)物。

⑵受關(guān)切的代次生謝產(chǎn)物：被評(píng)估菌株產(chǎn)生的代謝物，具有已知的毒性或抗微生物藥物活性，其可接受的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)通過定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估來(lái)證明。

4.4 分步確定受關(guān)切的次生代謝產(chǎn)物

為了確定微生物是否正在產(chǎn)生受關(guān)切的代謝產(chǎn)物，指導(dǎo)文件按照分步的程序進(jìn)行評(píng)估。該指南將評(píng)估程序分成4 個(gè)階段：⑴第1 階段(步驟1～2)：確定需要評(píng)估的代謝產(chǎn)物所屬類型(包括歸入化學(xué)農(nóng)藥評(píng)審、無(wú)需進(jìn)行評(píng)審的病毒、需要進(jìn)一步評(píng)審3 種)；⑵第2 階段(步驟3～11)：收集關(guān)于代謝產(chǎn)物的基本信息，并產(chǎn)生潛在受關(guān)切代謝產(chǎn)物的清單；⑶第3 階段(步驟12～15)：確定哪些已識(shí)別的代謝產(chǎn)物值得關(guān)切，從而得到值得受關(guān)切的代謝產(chǎn)物清單和無(wú)需關(guān)切的代謝物清單；⑷第4 階段(步驟16～20)：對(duì)受關(guān)切的代謝產(chǎn)物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

每個(gè)階段由幾個(gè)步驟組成。這些步驟包含對(duì)申請(qǐng)人和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估人員的提問，以指導(dǎo)他們完成每個(gè)階段的過程。

4.4.1 第1 階段(步驟1～2)：確定代謝產(chǎn)物所需的評(píng)估類型

步驟1：確定次生代謝產(chǎn)物在微生物農(nóng)藥作用方式中所起的作用。即需要確定微生物活性物質(zhì)的主要作用方式是否基于制劑產(chǎn)品中存在的次生代謝產(chǎn)物。

關(guān)于微生物作用方式的信息對(duì)于識(shí)別潛在受關(guān)切代謝產(chǎn)物很重要。因此，在技術(shù)上可行的情況下必須在登記申請(qǐng)檔案中盡可能詳細(xì)地描述產(chǎn)品的作用方式，并有科學(xué)證據(jù)支持，以確定所鑒定的代謝產(chǎn)物是否明確參與作用方式。

如果微生物產(chǎn)品的植物保護(hù)作用已知是由于毒素/代謝產(chǎn)物的殘留效應(yīng)，或者作用方式是基于產(chǎn)品中存在的代謝物的殘留效應(yīng)，這意味著采用離體的代謝產(chǎn)物將產(chǎn)生相同的植物保護(hù)作用并且代謝物可以被視為活性物質(zhì)，此時(shí)需要按照化學(xué)農(nóng)藥登記要求提交數(shù)據(jù)檔案。含有滅活微生物及微生物代謝物的某些產(chǎn)品就屬于這一類(如美國(guó)批準(zhǔn)的Majestene 殺線蟲劑)。

作用方式不是基于產(chǎn)品中存在的次生代謝物的所有微生物產(chǎn)品，則進(jìn)入步驟2 進(jìn)一步予以評(píng)估。

步驟2：目的是排除次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。如果微生物農(nóng)藥是基于病毒生產(chǎn)的，根據(jù)目前的科學(xué)知識(shí)，沒有跡象表明病毒能產(chǎn)生可能令人擔(dān)憂的代謝物，因此不需要進(jìn)一步評(píng)估。

對(duì)于所有其他微生物：進(jìn)入第2 階段。

4.4.2 第2 階段(步驟3～11)：收集關(guān)于代謝物的基本信息

在第2 階段，結(jié)合不同來(lái)源的數(shù)據(jù)集，確定哪些代謝產(chǎn)物可能是由被評(píng)估的菌株和密切相關(guān)的菌株所產(chǎn)生，并收集有關(guān)這些代謝物的危害信息(即毒性或抗微生物藥物活性)，以確定導(dǎo)致任何觀察到的毒性作用的任何代謝物。

作為第2 階段評(píng)估的一部分，需分別準(zhǔn)備如下3 個(gè)清單：⑴所申請(qǐng)菌株及其相關(guān)菌株(及其危害作用)被確定的代謝物清單。⑵(生態(tài))毒理學(xué)研究中觀察到的可能由代謝物引起的有害影響清單。⑶未觀察到任何有害影響的(生態(tài))毒理學(xué)研究。

在這些(生態(tài))毒理學(xué)研究中觀察到的能產(chǎn)生有害影響的任何代謝物都必須予以鑒定。

應(yīng)該對(duì)第一個(gè)清單中所有得到確定的代謝物進(jìn)行單獨(dú)的文獻(xiàn)檢索。然后將上述前2 個(gè)清單合并為潛在的受關(guān)切有毒代謝物清單(包括有抗微生物藥物活性的化合物)。

收集關(guān)于代謝產(chǎn)物的基本信息，并生成潛在受關(guān)切代謝產(chǎn)物的清單。

在第2 階段，步驟3～8 是強(qiáng)制性的。步驟9 是一個(gè)可選步驟，可用于排除潛在的代謝產(chǎn)物，以進(jìn)一步評(píng)估。步驟10 是有條件的步驟，對(duì)于信息不太全的微生物是必需的。

4.4.3 第3 階段(步驟12～15)：確定受關(guān)切的代謝產(chǎn)物

在第3 階段將處理由第2 階段確定的潛在受關(guān)切代謝物可能引起的風(fēng)險(xiǎn)。

預(yù)期的成果是將潛在受關(guān)切的代謝產(chǎn)物區(qū)分為“不受關(guān)切”或“受關(guān)切并需要風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估”2 組。

要確定代謝產(chǎn)物是否真正值得關(guān)切，則需要確定代謝物的暴露程度。由于暴露取決于母藥(TGMPCA)中存在的代謝產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物的原位產(chǎn)生，因此確定實(shí)際暴露水平可能具有挑戰(zhàn)性。

如果能充分證明菌株不產(chǎn)生代謝產(chǎn)物(例如通過全基因組測(cè)序即WGS 數(shù)據(jù))，則無(wú)需評(píng)估。否則進(jìn)入代謝產(chǎn)物的暴露途徑評(píng)估。

如能充分證明代謝產(chǎn)物的原位產(chǎn)生與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估無(wú)關(guān)，則無(wú)需評(píng)估。若不能，則進(jìn)入下一步確定潛在的受關(guān)切代謝產(chǎn)物是否存在受關(guān)切的風(fēng)險(xiǎn)。

通過定性評(píng)估能否證明人類或相關(guān)的非靶生物(NTO)對(duì)代謝產(chǎn)物的暴露在不值得關(guān)切的背景暴露水平范圍內(nèi)，若是，則無(wú)需評(píng)估；否則將其確定為“受關(guān)切代謝產(chǎn)物”。

對(duì)于所有值得關(guān)切的代謝產(chǎn)物(第3 階段的結(jié)果)，說(shuō)明原位產(chǎn)生是否與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)，以及代謝產(chǎn)物是否存在于產(chǎn)品中。然后進(jìn)入第4 階段。

4.4.4 第4 階段(步驟16～20)：對(duì)受關(guān)切的代謝產(chǎn)物(即相關(guān)代謝產(chǎn)物)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

第4 階段的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估對(duì)于以下所有代謝物都是必要的：⑴暴露評(píng)估不能證明代謝物與人類和非靶生物無(wú)關(guān)；⑵所描述的毒理學(xué)效應(yīng)被認(rèn)為與擬議的用途有關(guān)。

所有已確定的對(duì)人類和相關(guān)非靶生物(即已確定危害的生物)的毒性類型(如急性毒性、遺傳毒性)都需要在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中加以處理。

對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，原則上應(yīng)遵循微生物和化學(xué)活性物質(zhì)法規(guī)和指導(dǎo)文件中指定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法。如果這些方法不合適或在技術(shù)上不可行，可以考慮以下方法：

⑴暴露評(píng)估(暴露的確定)

對(duì)于產(chǎn)品中存在的代謝產(chǎn)物造成的暴露，應(yīng)根據(jù)歐洲食品安全局(EFSA)關(guān)于農(nóng)藥環(huán)境歸宿建模和/或操作人員/工人/旁觀者/居民的現(xiàn)行指南，酌情進(jìn)行定量暴露評(píng)估。

對(duì)于那些沒有充分證明原位產(chǎn)生與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估無(wú)關(guān)的代謝產(chǎn)物，通過測(cè)量代謝產(chǎn)物在相關(guān)環(huán)境區(qū)域的濃度來(lái)確定暴露(例如可食用部分，這將觸發(fā)需要進(jìn)行殘留試驗(yàn)，如化學(xué)農(nóng)藥數(shù)據(jù)要求所述)。

⑵從文獻(xiàn)或毒理學(xué)關(guān)切閾值(TTC)中確定參考值

是否可以根據(jù)現(xiàn)有信息/數(shù)據(jù)確定相關(guān)代謝產(chǎn)物的參考值，若是，進(jìn)入設(shè)置NOAEL/NOEC 和參考值的步驟(見下文)；若否，進(jìn)入(生態(tài))毒性測(cè)試。

毒理學(xué)關(guān)切閾值(TTC)方法適用于受關(guān)切的代謝產(chǎn)物，若是，進(jìn)入設(shè)置NOAEL/NOEC 和參考值的步驟；若否，進(jìn)入(生態(tài))毒性測(cè)試。

⑶根據(jù)文獻(xiàn)/現(xiàn)有數(shù)據(jù)確定受關(guān)切代謝產(chǎn)物的毒性終點(diǎn)(生態(tài)毒理學(xué))

是否可以根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)/數(shù)據(jù)確定相關(guān)非靶標(biāo)生物組的代謝產(chǎn)物的毒性終點(diǎn)，若是，進(jìn)入設(shè)置NOAEL/NOEC 和參考值的步驟；若否，進(jìn)入(生態(tài))毒性測(cè)試。

⑷NOAEL/NOEC 和參考值的設(shè)置

酌情為人類健康設(shè)定無(wú)可見有害作用水平(NOAEL)/最大無(wú)影響濃度(NOEC)及相關(guān)群體的參考值包括施用人員允許暴露量(AOEL)/急性參考劑量(ARfD)/每日允許攝入量(ADI)/農(nóng)藥施用人員急性允許暴露量(AAOEL)；對(duì)非靶標(biāo)生物的NOEC/EC50。另外(特別是對(duì)于遺傳毒性物質(zhì))，如果合適，可以使用TTC。

4.4.5 定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

⑴對(duì)人的毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

適當(dāng)?shù)貙⒈┞读颗c參考值進(jìn)行比較。確定所評(píng)估的接觸組/有機(jī)體是否突破了相應(yīng)的觸發(fā)值(如傳統(tǒng)化學(xué)物質(zhì))。如果沒有突破，則表示該代謝產(chǎn)物存在可接受的風(fēng)險(xiǎn)，更新概述表。如果突破了，即表明該代謝產(chǎn)物存在不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，更新受關(guān)切代謝物清單。

⑵生態(tài)毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

適當(dāng)?shù)貙⒈┞读颗c參考值進(jìn)行比較。確定所評(píng)估的接觸組/有機(jī)體是否突破了相應(yīng)的觸發(fā)值(如傳統(tǒng)化學(xué)物質(zhì))。如果沒有突破，則表示該代謝產(chǎn)物存在可接受的風(fēng)險(xiǎn)，更新概述表。如果突破了，代表該代謝產(chǎn)物存在不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，更新受關(guān)切代謝物清單。

該指南已經(jīng)得到實(shí)際應(yīng)用。2023 年3 月1 日批準(zhǔn)有效期至2038 年2 月28 日的微生物農(nóng)藥有效成分綠假單胞菌菌株MA342，評(píng)審結(jié)果要求該活性成分中存在的具有遺傳毒性的代謝物2,3-deepoxy-2,3-didehydro-rhizoxin(DDR)的含量不得超過2 μg/mL。同時(shí)要求根據(jù)該指南進(jìn)一步提供有關(guān)DDR 的信息，尤其是環(huán)境降解速率信息[10]。

5 小結(jié)

為了適應(yīng)歐洲綠色協(xié)議和從農(nóng)場(chǎng)到餐桌戰(zhàn)略，歐盟于2022 年修訂了微生物農(nóng)藥的登記評(píng)審相關(guān)法規(guī)。在此之前的2020 年歐盟委員會(huì)發(fā)布了微生物農(nóng)藥中代謝產(chǎn)物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)指南。該指南提出了一種實(shí)用的逐步評(píng)估方法來(lái)評(píng)估微生物(擬)作為活性物質(zhì)生產(chǎn)的次生代謝物的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。指南自2021 年11 月1 日起生效。

該指南設(shè)計(jì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序分4 個(gè)步驟。第1 步是確定微生物代謝產(chǎn)物可能需要的評(píng)估類型(包括歸入化學(xué)農(nóng)藥評(píng)審、無(wú)需進(jìn)行評(píng)審的病毒、需要進(jìn)一步評(píng)審3 種)；第2 步是通過文獻(xiàn)檢索和試驗(yàn)數(shù)據(jù)，收集有關(guān)微生物及其代謝物的信息，以建立潛在的受關(guān)切代謝物列表；第3 步是根據(jù)被評(píng)估菌株實(shí)際產(chǎn)生代謝物的數(shù)據(jù)，可能的暴露途徑和定性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，將潛在的受關(guān)切代謝物列表細(xì)化為受關(guān)切代謝物列表。最后1 步是對(duì)每一種確定的受關(guān)切次生代謝物進(jìn)行定性和定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。