基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討川牛膝治療繼發(fā)性閉經(jīng)的作用機(jī)制*

黃紫薇,羅喜,王希,張伶俐

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208; 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬省直中醫(yī)院,湖南 株洲 412000;3.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院,湖南省直中醫(yī)醫(yī)院,湖南 株洲 412000

繼發(fā)性閉經(jīng)(secondary amenorrhea,SA)是指月經(jīng)初潮后停經(jīng)超過(guò)自身3個(gè)月經(jīng)周期或超過(guò)6個(gè)月[1]。閉經(jīng)的發(fā)病率約為5%,SA發(fā)病率約占閉經(jīng)的95%[2]。隨著生活節(jié)奏加快,工作壓力增加,SA的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),嚴(yán)重影響女性健康,如低雌激素所致的骨質(zhì)疏松癥和生殖道萎縮,長(zhǎng)期雌激素刺激而無(wú)孕激素對(duì)抗的子宮內(nèi)膜過(guò)度生長(zhǎng)甚至子宮內(nèi)膜癌,青春期無(wú)月經(jīng)所致的精神心理障礙以及婚后不孕等[3-4]。下丘腦-垂體-卵巢-子宮軸的神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)是SA的主要病因[5],臨床上針對(duì)相應(yīng)病變環(huán)節(jié)采用手術(shù)、激素以及全身治療等方式能取得一定的臨床療效[6]。但長(zhǎng)期和周期性用藥導(dǎo)致的藥物副作用明顯和患者依從性差是亟待解決的問(wèn)題。中醫(yī)藥治療SA具有辨證論治和整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì),且具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn)。

川牛膝(CyathulaeRadix)是莧科植物川牛膝(Cyathulaofficinalis)的干燥塊根,主要產(chǎn)于四川省天全縣,性善下行(引血下行),功善逐瘀通經(jīng),是臨床治療經(jīng)閉癥瘕的常用藥[7]。如《本草經(jīng)疏》言：“血行則月水自通,血結(jié)自散”,本品逐瘀通經(jīng),故能“療婦人月水不通,血結(jié)”(《名醫(yī)別錄》)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),川牛膝含有多糖、甾酮類、皂苷、阿魏酸等活性成分,具有調(diào)節(jié)血液黏稠度、改善微循環(huán)等藥理作用[8]。其所含的甾酮類化合物為天然植物雌激素,可有效治療女性生殖內(nèi)分泌疾病[9]。但目前川牛膝治療SA的作用機(jī)制研究尚且缺乏,對(duì)川牛膝藥效成分、靶點(diǎn)及通路的相互作用關(guān)系尚不清楚。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討川牛膝治療SA的可能作用機(jī)制,為川牛膝的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 川牛膝活性成分及作用靶點(diǎn)篩選通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)檢索川牛膝的活性成分,藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)設(shè)置為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18,從而篩選川牛膝的活性成分與作用靶點(diǎn)。

1.2 SA疾病靶點(diǎn)獲取以“Secondary Amenorrhea”為檢索詞,通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/)獲取SA相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選采用R軟件獲取川牛膝作用靶點(diǎn)與SA疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn),將其作為川牛膝治療SA的關(guān)鍵靶點(diǎn),并繪制韋恩圖。將關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.string-db.org/),設(shè)置物種為Homo sapiens,置信度為0.9,隱藏游離節(jié)點(diǎn),得到PPI網(wǎng)絡(luò)。然后,通過(guò)Cytoscape 3.8.2軟件的MCODE插件進(jìn)行聚類分析。

1.4 “藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選將川牛膝活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件,從而構(gòu)建“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Network Analyzer插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?以度值(degree)中位數(shù)的2倍、介度中心性(between centrality,BC)中位數(shù)和緊密中心性(closeness centrality,CC)中位數(shù)為條件篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析利用R軟件對(duì)川牛膝治療SA的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析,以P<0.05為篩選條件,取各項(xiàng)結(jié)果的前10條數(shù)據(jù)繪制富集圖,并將其作為川牛膝治療SA的關(guān)鍵通路和功能。

1.6 分子對(duì)接通過(guò)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取川牛膝活性成分的小分子結(jié)構(gòu),將其作為配體蛋白;通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.rcsb.org/)獲取核心靶點(diǎn)的PDB結(jié)構(gòu),將其作為受體蛋白;然后,通過(guò)AutoDock Tools 1.5.6軟件對(duì)受體和配體進(jìn)行去水、加氫等處理,采用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 川牛膝活性成分及作用靶點(diǎn)基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)初步檢索獲得川牛膝化學(xué)成分41個(gè),根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18進(jìn)行篩選,最終獲取4個(gè)活性成分,見表 1。基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取川牛膝的作用靶點(diǎn)178個(gè),其中槲皮素136個(gè),β-谷甾醇26個(gè),甜菜素15個(gè),紅莧甾酮1個(gè)。

表1 川牛膝活性成分信息

2.2 川牛膝治療SA的關(guān)鍵靶點(diǎn)基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取SA相關(guān)靶點(diǎn)1 366個(gè),利用R軟件繪制川牛膝作用靶點(diǎn)和SA疾病靶點(diǎn)的韋恩圖,得到56個(gè)交集靶點(diǎn),將其作為川牛膝治療SA的關(guān)鍵靶點(diǎn),見圖1。

圖1 川牛膝作用靶點(diǎn)與SA相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及川牛膝治療SA的核心靶點(diǎn)根據(jù)活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)構(gòu)建“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),見圖2。由圖可知,川牛膝通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用,活性成分以槲皮素的作用最為顯著。將56個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),獲取川牛膝治療SA的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。應(yīng)用Cytoscape 3.8.2軟件的MCODE插件進(jìn)行聚類分析,獲取3個(gè)子網(wǎng)絡(luò),其中A有5個(gè)節(jié)點(diǎn)、10條邊,得分5.0;B有6個(gè)節(jié)點(diǎn)、9條邊,得分3.6;C有4個(gè)節(jié)點(diǎn)、5條邊,得分3.3,見圖4。應(yīng)用Network Analyzer插件進(jìn)行拓?fù)浞治?根據(jù)“Betweenness Centrality”“Closeness Centrality”“Degree”值篩選得到9個(gè)核心靶點(diǎn),包括絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase 1,MAPK1)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等,見表2。

圖2 “藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 川牛膝治療SA的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 川牛膝治療SA的PPI聚類分析圖

表2 川牛膝治療SA的核心靶點(diǎn)信息

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用R軟件對(duì)56個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析(P<0.05),結(jié)果顯示,GO功能分析得到 3 255 個(gè)生物過(guò)程(biological process,BP)、171個(gè)細(xì)胞組成(cellular component,CC)、323個(gè)分子功能(molecular function,MF)。其中,BP主要涉及細(xì)胞對(duì)化學(xué)壓力的反應(yīng)、對(duì)類固醇激素的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖等,CC主要包括膜微區(qū)、質(zhì)膜筏等,MF主要包括核受體活性、類固醇激素受體活性等。KEGG通路分析得到135條通路,主要涉及HIF-1信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、雌激素信號(hào)通路等,見圖5。

圖5 GO功能和KEGG通路富集分析圖(前10位)

2.5 分子對(duì)接選擇活性成分槲皮素、β-谷甾醇分別與核心靶點(diǎn)AKT1、MAPK1進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果顯示結(jié)合能均小于-5 kcal·mol-1,活性成分與核心靶點(diǎn)通過(guò)形成氫鍵等分子作用力相互結(jié)合且結(jié)合活性較好,見圖6。

圖6 分子對(duì)接結(jié)合能熱圖

3 討論

SA歸屬于中醫(yī)學(xué)“女子不月”“血枯”等范疇[10]。《金匱要略·婦人雜病脈證并治》言：“因虛、積冷、結(jié)氣,為諸經(jīng)水?dāng)嘟^”,論述了“經(jīng)水?dāng)嘟^”的病機(jī),不外虛實(shí)兩類;精血不足,血海空虛,因虛閉經(jīng)者,補(bǔ)而通之;氣血瘀滯,血海阻隔,因?qū)嶉]經(jīng)者,瀉而通之;亦或虛實(shí)夾雜,補(bǔ)中有通,攻中有養(yǎng)[11]。中藥川牛膝始見于《仙授理傷續(xù)斷秘方》,是主產(chǎn)于四川天全的道地藥材和大宗藥材。《四川中藥志》記載：“川牛膝能活血祛瘀,催產(chǎn),引血下行,用于血滯經(jīng)閉,痛經(jīng),難產(chǎn)等[12]。”《中國(guó)藥典》也記載：“川牛膝善于逐瘀通經(jīng),性善下行(引血下行)。”此外,川牛膝能滋補(bǔ)肝腎,兼顧經(jīng)血之源,是臨床用于婦科瘀滯經(jīng)閉最為理想的藥物之一[13]。

川牛膝含有甾酮、多糖、皂苷等多種活性成分,藥理活性涉及調(diào)節(jié)血液黏稠度、改善循環(huán)、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗生育和著床等方面[8]。川牛膝中的多糖成分具有促進(jìn)血液循環(huán)的作用,可能是其發(fā)揮“逐瘀通經(jīng)”作用的藥理基礎(chǔ),作用機(jī)制可能與多糖成分降低全血和血漿黏稠度、增強(qiáng)紅細(xì)胞變形能力有關(guān)[14]。此外,川牛膝提取物能明顯增加細(xì)胞遷移,促進(jìn)血管生成,觸發(fā)血管重構(gòu)和分化的信號(hào)傳導(dǎo),這可能是其促進(jìn)月經(jīng)來(lái)潮的機(jī)制之一[15]。川牛膝對(duì)生殖系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)在對(duì)子宮的興奮作用[16]。川牛膝提取物具有抗生育作用,主要分為抗著床和抗早孕兩個(gè)環(huán)節(jié)[17]。川牛膝含有多種甾酮類天然植物雌激素,如槲皮素等異黃酮類化合物與17β-雌二醇有相似的結(jié)構(gòu),具有弱雌激素作用,其對(duì)子宮內(nèi)膜的刺激作用遠(yuǎn)小于雌激素,既能發(fā)揮雌激素樣作用,又能降低子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[15]。此外,異黃酮具有降血糖活性[18],在胰島素抵抗的細(xì)胞模型中,蛻皮甾酮能增加胰島素敏感性[15],對(duì)于PCOS所致閉經(jīng),可在一定程度上緩解內(nèi)分泌抵抗。

本研究發(fā)現(xiàn)川牛膝主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、紅莧甾酮、甜菜素,其中槲皮素作用靶點(diǎn)達(dá)136個(gè),表明川牛膝促進(jìn)月經(jīng)來(lái)潮具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。黃酮類化合物槲皮素通過(guò)抑制血小板聚集和5-羥色胺釋放從而調(diào)節(jié)血液循環(huán),同時(shí)具有雌激素效應(yīng)。β-谷甾醇是一種植物甾醇,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗衰老等多種藥理活性[19]。下丘腦功能性閉經(jīng)常由于精神刺激、體重驟降及過(guò)度運(yùn)動(dòng)等應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)分泌抑制,形成低GnRH狀態(tài)[2]。研究發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇結(jié)合在小鼠下丘腦GnRH神經(jīng)元GT-17細(xì)胞膜上,通過(guò)影響雌激素受體信號(hào)通路抑制NF-κB上游因子降解,阻斷NF-κB信號(hào)通路激活,從而緩解GnRH分泌減少的狀況[20]。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)川牛膝治療SA主要涉及受體配體活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑、RNA聚合酶Ⅱ特異的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物過(guò)程。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),川牛膝治療SA的通路主要包括HIF-1信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗和雌激素信號(hào)通路等。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,由氧調(diào)節(jié)亞基α和組成型表達(dá)的β亞基組成,能夠誘導(dǎo)血管形成蛋白表達(dá)。HIF-lα是低氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。Critchley等[21]發(fā)現(xiàn)女性月經(jīng)周期分泌中期、晚期及月經(jīng)期的子宮內(nèi)膜HIF-1αmRNA表達(dá)量顯著增加。周芳[22]研究發(fā)現(xiàn)HIF-lα在低氧狀態(tài)和月經(jīng)出血非缺氧狀態(tài)均被激活,子宮內(nèi)膜崩解的關(guān)鍵時(shí)期環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX2)和HIF-1αmRNA表達(dá)均增加。張玲[23]研究發(fā)現(xiàn)雌激素通過(guò)受體抑制HIF-1α降解,激活HIF-1α信號(hào)通路,啟動(dòng)下游靶基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)合成,促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的粘附、侵襲和血管生成。

SA以持續(xù)性月經(jīng)停閉為特征[24],治療重點(diǎn)在于順應(yīng)月經(jīng)周期中陰陽(yáng)轉(zhuǎn)化和氣血盈虧的變化規(guī)律,調(diào)控腎-天癸-沖任-胞宮軸,從而恢復(fù)正常的月經(jīng)周期[25]。腎虛血瘀型SA是臨床常見證型,李靈芝教授認(rèn)為SA以腎虛為本、血瘀為標(biāo),治療當(dāng)以祛瘀為先,繼以補(bǔ)腎[26]。“瘀血不祛,新血不生”,瘀血阻滯于經(jīng)絡(luò),阻礙氣血的運(yùn)行則月經(jīng)停閉。川牛膝苦泄甘緩,長(zhǎng)于活血通經(jīng),善引血下行,常與當(dāng)歸、桃仁、紅花等同用治療血瘀經(jīng)閉[27]。《名醫(yī)別錄》記載川牛膝可治療“婦人月水不通、血結(jié)、益精、利陰氣、止發(fā)白。”腎為先天之本,主藏精納氣,肝主藏血,肝腎同源;川牛膝歸肝、腎兩經(jīng),可以調(diào)補(bǔ)肝腎,調(diào)理內(nèi)分泌,發(fā)揮雌激素樣作用,改善子宮狀態(tài),增加子宮血流量[28],提高人體免疫力,延緩衰老,符合中醫(yī)學(xué)的整體觀念[29]。

本文初步探索了川牛膝治療SA的作用機(jī)制,挖掘槲皮素、β-谷甾醇等4種活性成分,膜筏、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)及核受體活性等過(guò)程,HIF-1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗等通路。但川牛膝的產(chǎn)地豐富、品種多樣,他們的化學(xué)成分可能存在差異,其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在不斷完善,各數(shù)據(jù)庫(kù)之間存在數(shù)據(jù)差異,提高數(shù)據(jù)庫(kù)的共享性、精度和準(zhǔn)確度也是未來(lái)的研究方向之一。