柱前衍生-高效液相色譜法測定魚類中組胺

郭新穎

（南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通 226001）

組胺是由組氨酸在脫羧酶的作用下產(chǎn)生的一種有機含氮化合物。天然寄生的微生物菌會通過繁殖分泌出組胺酸脫羧酶，并與生物體內(nèi)的組胺酸轉(zhuǎn)化為組胺，因此組胺更易存在于蛋白質(zhì)含量豐富的魚類水產(chǎn)品中[1-2]。已有研究報道，金槍魚、鯖魚、秋刀魚等魚類及其制品是組胺含量較高的食品之一[3-4]。組胺不慎被人體攝入將引發(fā)健康風險，中毒癥狀輕者表現(xiàn)為惡心、嘔吐、頭痛、心悸、暈眩及出疹，重者會引發(fā)哮喘及突發(fā)心臟疾病[5-6]。目前一些國家已經(jīng)規(guī)定了組胺的限量標準，如美國規(guī)定水產(chǎn)品及其制品中組胺含量不得超過50 mg/kg，歐盟規(guī)定食品中組胺含量不得超過100 mg/kg，中國規(guī)定鮐魚中組胺含量不得超過1 000 mg/kg，其它海產(chǎn)魚類中不超過300 mg/kg。我國是水產(chǎn)品養(yǎng)殖和進出口大國，水產(chǎn)品質(zhì)量安全關(guān)系到國際貿(mào)易與人體健康，因此對水產(chǎn)品中的組胺進行定量檢測極其重要。

目前，國內(nèi)外關(guān)于魚類等水產(chǎn)品中組胺的檢測方法多采用高效液相色譜(HPLC)法[7-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法[11-14]等。其中，UPLC-MS/MS法儀器昂貴且對人員技術(shù)要求高，在一般基層檢測機構(gòu)中難以普及應(yīng)用；而HPLC 法儀器價格適中，操作簡便，分析快速，廣泛應(yīng)用于分析檢測生物胺類化合物，成為測定組胺的常用方法之一。組胺的樣品處理方法主要為固相萃取法[15-16]和柱前衍生法[17-18]。商品化固相萃取柱不僅價格高，還需要大量有機溶劑進行活化、淋洗、洗脫，過程繁瑣，耗費人力物力；另外，魚肉制品基質(zhì)復(fù)雜，樣品中組胺易分解，無法保證試劑衍生化效率，因此有必要開發(fā)簡單易操作、可靠環(huán)保、衍生效率高的樣品處理方法。

筆者建立了一種試劑衍生化效率高、衍生步驟簡單的柱前衍生-高效液相色譜法，用于測定海魚中的組胺含量，該方法可為水產(chǎn)品中組胺的含量檢測及相關(guān)標準制定提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，帶有紫外-可見檢測器裝置，美國安捷倫科技有限公司。

分析天平：AG245 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司。離心機：Primo B型，美國賽默飛科技有限公司。組胺二鹽酸鹽標準品：純度(質(zhì)量分數(shù))為99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1，7-二氨基庚烷、丹磺酰氯：質(zhì)量分數(shù)分別大于98.0%和99.0%，上海安譜試劑有限公司。

乙腈：色譜純，德國默克公司。

乙酸、鹽酸、氨水、乙醚、正己烷、氫氧化鈉、乙酸銨：均為分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

采用彩色多普勒超聲診斷儀（型號：飛利浦CV350），選用線陣探頭，頻率為10～13MHz。指導(dǎo)患者采取仰臥位，將頸部暴露，墊高肩部，后仰頭頸部，盡可能的偏向檢測對側(cè)。詳細檢查患者斑塊大小、范圍、明確斑塊位置、內(nèi)徑、內(nèi)膜、頸動脈血管走形、起點以及起源等。根據(jù)斑塊的回聲情況判斷斑塊的性質(zhì)。以彩色多普勒技術(shù)顯示出血流方向，判斷有無充盈，血流信號有無逆轉(zhuǎn)，以PW（脈沖多普勒）檢查各節(jié)段血流頻譜，測量PSV（收縮期峰值流速）、EDV（舒張期峰值流速）、Vm（平均流速）、RI（阻力指數(shù)）。局部狹窄的地方，需要測量該部位舒張末期最大峰值、收縮期最大峰值、狹窄處管腔內(nèi)徑，對狹窄程度進行全面評估。

海魚樣品：鲅魚，市售。

1.2 標準溶液配制

組胺標準儲備液：1 000 μg/mL，精確稱取組胺二鹽酸鹽標準品0.016 6 g (折算為生物胺單體量0.010 0 g)，加入0.1 mol/L 鹽酸溶液，溶解并定容至10 mL，混合均勻。

組胺標準使用液：100 μg/mL，吸取1.0 mL組胺標準儲備液，加入0.1 mol/L 的鹽酸，稀釋并定容至10 mL，混合均勻。

內(nèi)標標準儲備液：10 μg/mL，精確稱取1，7-二氨基庚烷0.100 g，加入0.1 mol/L 鹽酸溶液，溶解并定容至10 mL，混合均勻。

內(nèi)標標準使用液：200 μg/mL，準確吸取200 μL內(nèi)標標準儲備液，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容至10 mL，混合均勻。

系列組胺標準工作溶液：分別移取組胺標準使用液10、25、50、100、150、250、500 μL，各加入250 μL 內(nèi)標標準使用液，用0.1 mol/L 鹽酸溶液定容至1.0 mL，得到質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 μg/mL 含內(nèi)標的系列組胺標準工作溶液。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；紫外檢測波長：254 nm；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相：A 相為含0.1% (體積分數(shù))乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液-乙腈(體積比為1∶9)，B相為含0.1% (體積分數(shù))乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液-乙腈(體積比為9∶1)，流量為0.8 mL/min；淋洗方式：梯度洗脫[19]。

1.4 樣品處理

樣品的提取和凈化：參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》進行。

空白樣品溶液：準確稱取不含目標組分的空白樣品基質(zhì)，同法制備空白樣品溶液。

1.5 測定方法

在1.3儀器工作條件下，對系列組胺標準工作溶液進行測定，以組胺標準工作溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，以標準工作溶液的色譜峰面積響應(yīng)值(y)為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。樣品中的組胺采用色譜峰面積外標法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱選擇

分別選擇ZORBAX Eclipse XDB C18柱和Dikma Diamonsil C18柱兩種C18色譜柱進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目標物色譜保留時間基本一致，且目標峰附近無干擾峰，色譜峰分離良好，峰形對稱完整，說明在相同的測試條件下，選擇通用型C18色譜柱均可滿足測試要求，實驗室可根據(jù)實際情況選擇色譜柱。

2.2 衍生條件選擇

2.2.1 衍生試劑

分別選擇丹磺酰氯和苯磺酰氯對樣品中的組胺進行衍生試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當使用丹磺酰氯衍生試劑時，組胺衍生物和內(nèi)標物均能夠正常出峰，且目標組分的線性良好，而苯磺酰氯衍生劑在相同使用劑量和測試條件下未能檢出衍生產(chǎn)物，說明丹磺酰氯的衍生效果好，適于本方法組胺衍生，因此選擇丹磺酰氯作為衍生試劑。

2.2.2 衍生溫度

分別選擇在25、30、40、50、55、60 ℃條件下進行衍生試驗，空白加標樣品中組胺的回收率列于表1。由表1 可知，當溫度不高于50 ℃時，組胺的回收率極低，衍生效果差；當溫度達到55 ℃時，組胺的回收率較高，衍生效果較好；當溫度為60 ℃時，組胺的回收率為98.4%。說明低溫不利于組胺鹽與衍生試劑的衍生反應(yīng)，最終將反應(yīng)溫度設(shè)定為60 ℃。

表1 不同衍生溫度下加標樣品中組胺的回收率Tab.1 Recoveries of histamine in spiked samples at different derivative temperatures

2.2.3 衍生反應(yīng)時間

分別選擇衍生反應(yīng)時間為20、30、40、45、50、60 min 進行試驗，空白加標樣品中組胺的回收率列于表2。

表2 不同衍生反應(yīng)時間時加標樣品中組胺的回收率Tab.2 Recoveries of histamine in spiked samples at different derivative reaction times

由表2可知，當衍生反應(yīng)時間大于40 min時，目標產(chǎn)物的回收率較高并趨于穩(wěn)定；而當衍生時間小于40 min時，目標產(chǎn)物的回收率較低。說明適當延長衍生反應(yīng)時間有利于衍生反應(yīng)完全，衍生效果較好。考慮到時間成本，最終選擇衍生反應(yīng)時間為45 min。

2.3 色譜圖

在1.3 儀器工作條件下，分別測定質(zhì)量濃度為25.0 μg/mL 的組胺標準溶液、空白樣品溶液和加標樣品溶液，色譜圖如圖1～圖3 所示。由圖1～圖3可以看出，組胺衍生物色譜保留時間為19.299 min，內(nèi)標1，7-二氨基庚烷的色譜保留時間為23.263 min，兩個色譜峰形尖銳、對稱、分離度良好。在空白樣品色譜圖中對應(yīng)保留時間位置未見組胺色譜峰，說明該方法專屬性好。

圖1 組胺標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of histamine standard solution

圖2 空白樣品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample solution

圖3 加標樣品溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of spiked sample solution

2.4 線性方程與檢出限

將質(zhì)量濃度為1.0～50.0 μg/mL 的組胺系列標準工作溶液在1.3儀器工作條件下依次進樣測定，以標準工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，以不同組胺質(zhì)量濃度下對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標進行線性擬合，計算得到組胺標準工作曲線方程為y=187.1x+44.516，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。表明該方法線性良好，能夠滿足實際樣品的測定要求。

選擇質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL 的組胺標準溶液，在1.3儀器工作條件下進行測定并記錄信號強度，以將信噪比S/N分別為3和10時對應(yīng)的組胺標準溶液的質(zhì)量濃度換算為樣品中組胺的質(zhì)量分數(shù)，作為方法檢出限和定量限，得到該方法的檢出限為7.2 μg/kg，定量限為24 μg/kg。

2.5 加標回收與精密度試驗

在鲅魚樣品中分別添加2.5、10.0、25.0 μg/mL三種質(zhì)量濃度水平的組胺標準溶液進行加標回收試驗。按照1.4樣品處理方法衍生后進行定量測定，結(jié)果列于表3。由表3 可知，樣品加標平均回收率為96.8%～99.2%，測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)為1.6%～3.7%(n=6)，表明該方法的準確度、精密度較高，滿足實際樣品的測定要求。

表3 樣品加標回收與精密度試驗結(jié)果Tab.3 Sample spiking recovery and precision test results

3 結(jié)語

建立了一種柱前衍生-高效液相色譜定量檢測魚類產(chǎn)品中組胺的方法。該方法衍生反應(yīng)步驟簡單、高效，能夠一步式完成衍生反應(yīng)和樣品處理過程，大幅節(jié)約樣品處理時間。實際樣品在不同添加水平下的回收率高(大于96%)，可用于魚類產(chǎn)品中組胺的定量檢測與質(zhì)量監(jiān)控。