多功能針式過濾器凈化超高效液相色譜法測定大米和花生中玉米赤霉烯酮

覃國新，王海軍，何潔，陳泳锨，周其峰，李慧玲，勞水兵，羅麗紅，莫仁甫，唐莉，陸瑋璠，韋宇寧

（廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院農產品質量安全與檢測技術研究所，南寧 530007）

玉米赤霉烯酮(ZEN)又稱為F-2毒素，主要是由鐮刀菌屬真菌產生的一種非甾體霉菌毒素，不僅具有致癌性、雌激素樣效應[1]，而且對神經、心臟、腎臟等產生毒害[2]。據文獻報道，全球范圍內真菌毒素每年污染約25%的糧食作物及其制品，尤其以大米、花生、黃豆、玉米等食品和食品原料的污染最為嚴重[3]，且霉變的玉米、高粱、大麥、小麥等谷類作物易發(fā)生ZEN 污染[4-5]。若污染了ZEN 的食品進入人體，將危害人們的健康，所以糧食中ZEN 等真菌毒素污染物的早期快速篩查、確證檢測尤為重要。

為了控制ZEN污染食品帶來的危害，許多國家規(guī)定了食品中ZEN的限量值，如意大利規(guī)定在谷物和谷類產品中ZEN 的最大含量不能超過100 mg/kg；澳大利亞規(guī)定ZEN 在谷物中的最大限量值不能超過50 mg/kg[6]；我國國家強制性標準GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》規(guī)定，谷物及其制品中ZEN 的最大限量值為60 mg/kg。

目前，糧谷類食品中玉米赤霉烯酮的檢測方法主要有高效液相色譜法[7-9]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[10-12]等，其中以高效液相色譜法應用最為廣泛。在GB 5009.209—2016 《食品安全國家標準 食品中玉米赤霉烯酮的測定》中，糧谷類食品檢測ZEN的樣品處理采用免疫親和柱凈化。該方法特異性高，富集能力強，凈化效果好，但上樣、淋洗、洗脫等較繁瑣，難以滿足大批量樣品的高通量檢測需求。

多功能針式過濾器凈化是基于QuEChERS 原則[13]，將凈化材料(PSA、C18、GCB 等)填充于帶有濾膜的一次性注射針管中，樣品提取溶液以一定速度通過該針管，凈化和過濾一步完成。與免疫親和柱凈化相比，該方法簡單、快速，適合大批量樣品的檢測分析。近年來，多功能針式過濾器凈化技術用于食品中有毒有害物質檢測的樣品處理已有報道[14-15]，筆者曾采用多功能針式過濾器凈化處理樣品，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蔬菜中克百威和涕滅威殘留[16]，該方法可以有效縮短樣品凈化時間，從而提高檢測效率，具有操作簡單、準確可靠等優(yōu)點。目前多功能針式過濾器凈化技術用于大米和花生中ZEN 的檢測未見報道。筆者基于多功能針式過濾器凈化技術，采用乙腈提取，經多功能針式過濾器通過式凈化，建立了超高效液相色譜法檢測大米和花生中ZEN的分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：ACQUITY UPLC H-Class型，美國沃特世公司。

電子天平：BP211D 型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。

旋渦振蕩器：3340025型，德國IKA公司。

低速臺式離心機：TDZ5-WS 型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

多功能針式過濾器：內含150 mg 硫酸鎂(MgSO4)、50 mg 乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、50 mg十八烷基鍵合相硅膠(C18)，天津阿爾塔科技有限公司。

玉米赤霉烯酮對照品：100 μg/mL，批號為STD#4012-1，青島普瑞邦生物工程有限公司。

乙腈：色譜純，賽默飛世爾(中國)科技有限公司。

氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑上海有限公司。

大米、花生樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司)；流動相：甲醇-乙 腈-水(體 積 比 為8∶46∶46)，流 量 為0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測器：熒光檢測器；檢測波長：激發(fā)波長為274 nm，發(fā)射波長為440 nm；進樣體積：2.0 μL。

1.3 樣品處理

提取：取大米、花生樣品，粉碎并混勻，準確稱取2.00 g，加入約2 mL 水浸濕，加入20.0 mL 乙腈，渦旋提取1 min，再加入3 g 氯化鈉，繼續(xù)渦旋提取1 min，以4 500 r/min 轉速離心5 min，收集上清液，待凈化。

凈化：取上述上清液2 mL 以2 滴/s 的速度通過多功能針式過濾器于進樣瓶中，作為樣品溶液。

1.4 溶液配制

玉米赤霉烯酮標準儲備液：準確移取玉米赤霉烯酮對照品溶液，用乙腈配成質量濃度為10.0 mg/L的標準儲備液。

基質匹配玉米赤霉烯酮系列校準溶液：取未檢出玉米赤霉烯酮的空白大米、花生樣品，按照1.3方法處理，得到空白基質提取凈化液，用此基質提取凈化液逐級稀釋玉米赤霉烯酮標準儲備液，配制成質量濃度分別為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL的基質匹配系列校準溶液。

1.5 測定方法

取基質匹配玉米赤霉烯酮系列校準溶液及樣品溶液，按照1.2儀器工作條件分析，繪制色譜峰面積—玉米赤霉烯酮質量濃度校準曲線，利用校準曲線法計算樣品中玉米赤霉烯酮標準溶液殘留量。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑選擇

真菌毒素檢測時，樣品處理通常選用的提取液有甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水等[17]。根據目標毒素的溶解性，分別考察甲醇、乙腈、甲醇-水(體積比為9∶1)和乙腈-水(體積比為9∶1)作為提取溶劑對目標物的提取效果，結果見表1。由表1可知，4種提取溶劑的提取回收率均大于78.0%，而使用乙腈作為提取溶劑時，玉米赤霉烯酮的回收率最高(93.5%以上)，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

表1 不同提取溶劑時玉米赤霉烯酮的回收率Tab.1 Recovery rate of zearalenone by different extraction solvents

2.2 凈化方式選擇

樣品提取和凈化作為液相色譜檢測方法的關鍵步驟，直接影響分析方法的靈敏度及準確度，因此選擇合適的樣品凈化方式尤為重要。傳統(tǒng)的真菌毒素檢測時樣品凈化方式主要是基于免疫親和柱的凈化方法，該方法操作較繁瑣，耗材成本較高[18]。多功能針式過濾器凈化主要是基于QuEChERS原則，將凈化材料(PSA、C18等)填充于帶有有機濾膜的一次性注射針管內，以簡化樣品提取溶液的凈化過程，具有簡單、快速、可靠等優(yōu)點，適合大批量樣品的檢測分析。筆者采用乙腈渦旋提取1 min 后，加入適量氯化鈉，再繼續(xù)渦旋提取1 min，離心后，上清液直接經多功能針式過濾器凈化吸附蛋白質、磷脂等干擾物質。與免疫親和柱凈化方式相比，該方法不涉及洗脫和濃縮程序，將凈化和過濾一步完成，不僅提高了檢測效率，而且方法回收率和精密度均滿足檢測要求。

2.3 色譜條件選擇

分別對比了甲醇、乙腈和甲醇-乙腈作為有機流動相的分析效果，發(fā)現當采用甲醇-乙腈為有機流動相時，得到的色譜峰形比較理想，且響應值較高，因此選擇甲醇-乙腈-水為流動相進行等度洗脫，并優(yōu)化了流動相比例，最終以甲醇-乙腈-水(體積比為8∶46∶46)為流動相，可獲得較好的靈敏度和重現性。在優(yōu)化的色譜條件下，基質匹配玉米赤霉烯酮校準溶液、空白樣品溶液及加標樣品溶液色譜圖如圖1～圖6所示。結果表明，玉米赤霉烯酮色譜保留時間約為3.2 min，色譜峰形理想。空白樣品溶液及加標樣品溶液均無干擾，滿足檢驗要求。表明該方法具有良好的專屬性。

圖1 大米基質匹配玉米赤霉烯酮校準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of calibration solution of zearalenone in matrix of rice

圖2 空白大米樣品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank rice sample solution

圖3 加標大米樣品溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of spiked rice sample solution

圖4 花生基質匹配玉米赤霉烯酮校準溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of calibration solution of zearalenone in matrix of peanut

圖5 空白花生樣品溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of blank rice sample solution

2.4 樣品基質效應

在1.2儀器工作條件下，分別進樣測定基質匹配系列校準溶液，以玉米赤霉烯酮質量濃度為橫坐標，以相對應的色譜峰面積為縱坐標，繪制基質匹配校準曲線。通過基質匹配校準曲線斜率與純溶劑標準曲線斜率的比值計算基質效應，用來評價大米和花生基質對玉米赤霉烯酮的基質效應，基質效應越接近1，表示對測定結果的影響越小，測定結果見表2。由表2 可知，玉米赤霉烯酮在花生基質中存在較大的基質效應，而在大米基質中的基質效應較小，綜合考慮，選擇以空白樣品提取凈化液配制基質匹配校準溶液進行定量。

表2 大米和花生中玉米赤霉烯酮的基質效應Tab.2 Matrix effects of zearalenone in matrix of rice and peanut

2.5 線性范圍、檢出限與定量限

由表2可知，在大米和花生基質中，玉米赤霉烯酮的質量濃度在2.5～500 ng/mL范圍內具有良好的線性關系，相關系數大于0.999 5。

在空白樣品中加入適量的玉米赤霉烯酮標準儲備液，在1.2 儀器工作條件下測定，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對應的質量濃度作為方法檢出限和定量限。計算得玉米赤霉烯酮在大米和花生基質中的檢出限分別為15.0、30.0 μg/kg，定量限分別為50.0、100.0 μg/kg。在大米和花生基質中，該方法的檢出限均比GB/T 2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》規(guī)定的值低，滿足日常檢測需求。

2.6 加標回收與精密度試驗

取未檢出玉米赤霉烯酮的大米和花生樣品為空白，進行3個濃度水平的加標回收試驗，計算玉米赤霉烯酮的回收率及測定結果的相對標準偏差。稱取粉碎的大米和花生樣品各2 g，玉米赤霉烯酮加標質量分數分別為500、2 500、5 000 μg/kg，每個加標水平平行測定6 次，結果列于表3。由表3 可知，玉米赤霉烯酮在大米和花生中的平均加標回收率為77.11%～93.65%，相對標準偏差為0.49%～4.95%。表明該方法的準確度及精密度良好，而且操作簡便，耗時短，適合大批量樣品的分析檢測。

表3 加標回收與精密度試驗結果Tab.3 Results of spiked recovery and precision test

3 結語

基于通過式固相萃取原理，建立了多功能過濾器凈化-超高效液相色譜檢測大米和花生中玉米赤霉烯酮含量的分析方法。采用多功能針式過濾器一步式凈化，不但能除去提取溶液中磷脂等干擾雜質，而且對玉米赤霉烯酮能保持較高的回收率，解決了傳統(tǒng)固相萃取柱凈化繁瑣復雜的問題，提高了檢測效率。該方法具有操作簡便，穩(wěn)定可靠和準確度高等特點，適合糧谷類食品中玉米赤霉烯酮含量的快速檢測。