基于Wnt/β-catenin 信號通路探索芪蛭通絡方對糖尿病腎病大鼠腎間質纖維化的作用機制

申晨卉 常蕊蕊 張 堯 楊 冰 檀 淼 唐 淼 檀金川

（1.河北中醫藥大學研究生學院，河北石家莊 050200；2.河北省中醫院，河北石家莊 050011；3.河北醫科大學第四醫院，河北石家莊 050010；4.河北醫科大學第二醫院，河北石家莊 050004）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是由糖尿病（diabetes mellitus，DM）遷延日久發展而來，最終可能會演變為慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）和終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD）[1]，對人類健康造成了巨大的威脅。DKD的病理變化包括結節性或彌漫性腎小球硬化、腎小管炎癥、萎縮和腎間質纖維化（renal interstial fibrosis，RIF）[2]。其中，腎間質纖維化是DKD晚期主要的病理改變，同時也是促進疾病進展的一個重要因素。腎間質纖維化是纖維化基質的沉積和因嚴重或持續損傷而形成的疤痕[3]，持續的纖維化狀態會損害腎臟組織結構和器官功能。DKD是一種多系統性疾病，其發病過程涉及多個細胞因子和分子信號通路的相互作用，其中Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路的異常可能是DKD發生發展的重要病理機制之一，該通路在進化上高度保守，在高糖狀態下被異常激活，加劇足細胞損傷程度，從而引起腎間質纖維化。相關研究表明，抑制Wnt/β-catenin信號通路的異常激活可起到延緩RIF進展的作用[4]，從而延緩DKD進程。

大量研究證實，中醫藥可通過調控Wnt/β-catenin信號通路延緩腎間質纖維化，從而發揮對DKD的治療作用[5-7]。基于趙玉庸教授提出的“腎絡瘀阻”理論[8]，河北省名中醫檀金川教授進一步提出DKD病機總屬脾腎兩虛、濁瘀互結，并總結經驗方芪蛭通絡方（黃芪、燙水蛭、黨參、丹參、川芎、全蝎、地龍、茯苓、醋龜甲）以健脾補腎、化濁祛瘀，臨床療效顯著[9]。前期藥理研究證實，單味藥黃芪、丹參、川芎、地龍均具有抑制腎纖維化作用[10]，因此本研究觀察復方芪蛭通絡方對DKD模型大鼠腎間質纖維化的影響，并以Wnt/β-catenin信號通路為切入點探究其作用機制，以為臨床運用該方治療DKD提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及飼料 SPF級8周齡雄性SD大鼠，體質量為（150±20）g，購自河北醫科大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（冀）2018-004，飼養于河北醫科大學第四醫院實驗動物中心。飼養環境：（20±2）℃，（50±10）%濕度，12 h/12 h明暗交 替，自由進食。本研究經河北中醫藥大學動物倫理委員會批準（批號：DWLL202302010）。普通飼料，購自河北醫科大學動物實驗中心，合格證號SCXK（冀）2018-003。高糖高脂飼料，購自吉林賽諾生物有限公司，批號：20180819。

1.2 實驗藥物 芪蛭通絡方，藥物組成：黃芪25 g，燙水蛭3 g，黨參15 g，丹參12 g，川芎9 g，全蝎3 g，地龍9 g，茯苓12 g，醋龜甲15 g。使用顆粒劑，購自廣東一方制藥有限公司，批號分別為：1109623，1110473，1092273，1101773，1104393，1102783，1106103，1101343，1055703。臨用前使用蒸餾水配制成0.1215 g/mL、0.2430 g/mL、0.4860 g/mL的溶液。厄貝沙坦片，浙江華海藥業股份有限公司生產，批號：YBH06232017，規格：75 mg/片，臨用前碾碎，溶于蒸餾水中，配制成濃度為1.4 mg/mL的混懸液。

1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素（STZ，批號：S0103），美國Sigma-Aldrich公司；β-肌動蛋白（actin）抗體（批號：AF7018），美 國Affinity Biosciences公 司；24 h尿蛋白定量（24 h-UTP）試劑盒（批號：C035-2-1）、肌酐測定試劑盒（批號：C011-2-1）、血尿素氮（BUN）測試盒（批號：C013-2-1），南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅（HE）染色液（批號：G1120）、馬松（Masson）染色液（批號：G1340），北京索萊寶科技有限公司；一抗Wnt1試劑（批號：40023）、一 抗β-catenin試 劑（批 號42536），美 國GeneTex公 司；一 抗GSK-3β試 劑（批 號：YT2082），美 國Immunoway Biotechnology公司；一抗CTGF試劑（批號：MAB91901-100），美國R&D Systems公司；二抗（批號SC2357），美國圣克魯斯生物技術有限公司；RIPA裂解液（批號：09271919023），上海碧云天生物技術有限公司；PBS緩沖液粉末（批號：19022401），北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 主要儀器 H-7650型透射電子顯微鏡、7170A全自動生化分析儀，日本日立有限公司；穩豪型血糖儀，美國強生有限公司；Multiskan FC型酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；BX53顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；RM-2126RT切片機，上海徠卡公司；Mini PROTEAN型電泳槽、Mini Trans-Blot電泳轉移池，美國BIO-RAD公司；Kodak Image Station 2000MM成像系統，美國柯達公司。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 SD大鼠適應性喂養后予造模：高糖高脂飼料喂養4周，禁食12 h，腹腔注射1% STZ溶液35 mg/kg，3 d后尾靜脈處取血測血糖（GLU），GLU≥16.7 mmol/L即為DM造模成功，造模成功的大鼠繼續高糖高脂飼料喂養4周，定期測量GLU及24 h-UTP，第4周末隨機處死1只大鼠，觀察腎組織，若24 h-UTP＞30 mg，且腎組織存在病理改變，即為DKD造模成功[11]。取造模成功的大鼠50只，隨機分為模型組、厄貝沙坦組及芪蛭通絡方低、中、高劑量組，每組10只。造模同時另取10只大鼠作為正常組，予普通飼料喂養4周，腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，繼續普通飼料喂養4周。

2.2 給藥 依據人與大鼠體表面積折算法計算大鼠的藥物臨床等效劑量[12]：芪蛭通絡方低、中、高劑量組給藥劑量分別為1.215、2.430、4.860 g/kg，厄貝沙坦組給藥劑量為14 mg/kg。每日上午各給藥組大鼠按10 mL/kg的劑量分別灌胃給予相應藥物，正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，連續8周。

2.3 取材 末次給藥后約5 h處死各組大鼠。處死前1日用代謝籠收集大鼠24 h尿液用于檢測24 h-UTP；末次給藥后禁食不禁水5 h，尾靜脈取血測GLU；隨后采用異氟烷吸入的方式麻醉大鼠，于腹主動脈處取血，分離血清置于-80 ℃冰箱保存備用；取出雙腎，生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，冰上取左腎皮質，4%多聚甲醛固定，用于HE、Masson、免疫組化（IHC）染色；右腎保存于-80 ℃冰箱擬用于蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測。

2.4 指標檢測

2.4.1 血糖及腎功能指標檢測 取各組大鼠血清，使用全自動生化分析儀檢測大鼠BUN、Scr水平；尾靜脈取血，使用血糖儀測GLU；采集24 h尿液，使用雙縮脲法檢測24 h-UTP。

2.4.2 腎臟病理學檢查

2.4.2.1 HE染色觀察腎臟病理學改變 取各組大鼠部分左腎組織浸泡于4%多聚甲醛48 h，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，經二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇進行逐級脫蠟水化，蘇木素染色1 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗，1%氨水水溶液返藍，流水沖洗，伊紅染色，最后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察腎組織形態學改變并拍照記錄。

2.4.2.2 Masson染色觀察腎臟病理學改變 按照HE染色步驟將切片脫蠟水化，鐵蘇木素染色8 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗返藍，麗春紅染色8 min，流水沖洗，磷鉬酸處理，苯胺藍復染，1%冰醋酸分化，最后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察腎組織形態學改變并拍照記錄。

2.4.3 免疫組化法檢測腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達 取各組大鼠部分冷凍左腎組織，切片，烤片，二甲苯及乙醇脫蠟水化，抗原修復，PBS洗滌，加入內源性過氧化物酶阻斷劑，山羊血清封閉，加入一抗（1∶500），4℃孵育過夜，復溫，PBS清洗，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS清洗，DAB避光顯色，流水沖洗，蘇木素再次染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，使用Image J軟件進行半定量分析。

2.4.4 Western blot法 檢 測 腎 組 織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達 取各組大鼠右腎組織100 g，研磨均勻，置于無菌離心管中，加入RIPA裂解液，提取腎組織總蛋白，制膠、上樣、電泳、電轉轉膜，室溫封閉2 h，分別加入Wnt1抗體（1∶1000）、β-catenin抗 體（1∶1000）、CTGF抗 體（1∶2000）、GSK-3β抗 體（1∶1000）、β-actin抗 體（1∶5000），4℃孵育過夜，TBST洗膜后加二抗（1∶2000），室溫孵育2 h，再次洗膜，采用ECL法進行顯色，Image J軟件分析各組條帶灰度值。

2.5 統計學方法 使用SPSS 27.0 統計軟件對數據進行分析。本研究所有計量資料均符合正態分布，采用均值±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊則采用Tukey法，方差不齊則采用Games-Howell檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各 組 大 鼠GLU、Scr、BUN、24 h-UTP水 平 比較 模型組大鼠GLU、Scr、BUN、24 h-UTP水平均明顯高于正常組（P＜0.01）；各給藥組大鼠上述指標均明顯低于模型組（P＜0.01）；芪蛭通絡方中、高劑量組大鼠GLU、Scr、BUN水平均明顯低于厄貝沙坦組（P＜0.01），高劑量組24 h-UTP水平明顯低于厄貝沙坦組（P＜0.01）；芪蛭通絡方對DKD模型大鼠血糖及腎功能指標的改善作用表現出一定的劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠GLU、Scr、BUN、24 h-UTP水平比較（±s）

表1 各組大鼠GLU、Scr、BUN、24 h-UTP水平比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，ΔΔP＜0.01；與芪蛭通絡方低劑量組比較，▲▲P＜0.01；與芪蛭通絡方中劑量組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別 動物數/只 GLU/（mmol/L） Scr/（μmol/L） BUN/（μmol/L） 24 h-UTP/mg正常組 10 5.02±0.89 31.94±1.53 6.62±0.38 9.37±0.49模型組 10 27.65±1.73## 89.73±5.01## 10.89±0.54## 56.04±3.33##厄貝沙坦組 10 21.15±1.72##** 80.41±2.51##** 8.59±0.26##** 36.92±1.64##**芪蛭通絡方低劑量組 10 20.80±1.55##** 77.80±4.21##** 8.94±0.50##** 43.56±2.39##**ΔΔ芪蛭通絡方中劑量組 10 15.87±1.43##**ΔΔ▲▲ 55.45±0.43##**ΔΔ▲▲ 7.70±0.34##**ΔΔ▲▲ 35.37±1.15##**▲▲芪蛭通絡方高劑量組 10 14.96±1.20##**ΔΔ▲▲ 45.30±2.54##**ΔΔ▲▲☆☆ 7.33±0.39##**ΔΔ▲▲☆ 30.89±2.20##**ΔΔ▲▲☆☆

3.2 各組大鼠腎組織病理形態比較 HE染色結果顯示：正常組大鼠腎小球結構正常，形態規則，腎小管排列有序，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠腎小球結構遭到破壞，體積增大，大量的炎性細胞浸潤，基底膜增厚，系膜區變寬，間質區彌漫性水腫，腎小管擴張；芪蛭通絡方低劑量組大鼠腎組織病理形態較模型組變化不大，腎小球體積增大，系膜區增寬，基底膜增厚，腎小管擴張；芪蛭通絡方中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎小球體積雖有增大但較模型組減小，系膜擴張和基底膜較模型組明顯變薄，腎小管排列相對緊密整齊，其中芪蛭通絡方高劑量組和厄貝沙坦組改善最為明顯。見圖1。

圖1 HE染色各組大鼠腎組織病理形態（×400）

Masson染色結果顯示：模型組大鼠腎組織藍色膠原纖維分泌增多且伴病理損傷；芪蛭通絡方低劑量組大鼠腎組織膠原纖維沉積稍有減少；芪蛭通絡方中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織膠原纖維明顯減少，以芪蛭通絡方高劑量組改善最為明顯。見圖2。

圖2 Masson染色各組大鼠腎組織病理形態（×400）

3.3 各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達比較 免疫組化法結果顯示：模型組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達均明顯高于正常組（P＜0.01）；各給藥組大鼠上述指標均明顯低于模型組（P＜0.01）；芪蛭通絡方高劑量組與厄貝沙坦組大鼠上述指標均明顯低于芪蛭通絡方低、中劑量組（P＜0.01）；芪蛭通絡方高劑量組大鼠上述指標均明顯低于厄貝沙坦組（P＜0.05，P＜0.01）；芪蛭通絡方對DKD模型大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達的抑制作用表現出一定的劑量依賴性。見表2、圖3～圖6。

圖3 各組大鼠腎組織Wnt1蛋白表達比較（IHC，×400）

圖5 各組大鼠腎組織CTGF蛋白表達比較（IHC，×400）

圖6 各組大鼠腎組織GSK-3β蛋白表達比較（IHC，×400）

表2 免疫組化法各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白相對表達量比較（±s）

表2 免疫組化法各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白相對表達量比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與芪蛭通絡方低劑量組比較，▲▲P＜0.01；與芪蛭通絡方中劑量組比較，☆☆P＜0.01。

組別 動物數/只 Wnt1 β-catenin CTGF GSK-3β正常組 10 0.288±0.002 0.252±0.009 0.311±0.008 0.229±0.007模型組 10 0.387±0.003## 0.485±0.016## 0.521±0.024## 0.404±0.017##厄貝沙坦組 10 0.331±0.006##** 0.311±0.010##** 0.380±0.003##** 0.264±0.010##**芪蛭通絡方低劑量組 10 0.371±0.002##**ΔΔ 0.396±0.010##**ΔΔ 0.476±0.010##**ΔΔ 0.338±0.010##**ΔΔ芪蛭通絡方中劑量組 10 0.349±0.004##**ΔΔ▲▲ 0.361±0.009##**ΔΔ▲▲ 0.414±0.011##**ΔΔ▲▲ 0.288±0.005##**Δ▲▲芪蛭通絡方高劑量組 10 0.307±0.006##**ΔΔ▲▲☆☆ 0.288±0.007##**Δ▲▲☆☆ 0.353±0.009##**Δ▲▲☆☆ 0.244±0.003**Δ▲▲☆☆

蛋白免疫印跡法結果顯示：模型組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達水平均明顯高于正常組（P＜0.01）；各給藥組大鼠上述蛋白表達水平均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；芪蛭通絡方高劑量組大鼠腎組織Wnt1、GSK-3β蛋白表達水平均明顯低于厄貝沙坦組（P＜0.01，P＜0.05），β-catenin、CTGF蛋白表達水平與厄貝沙坦組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；芪蛭通絡方對DKD模型大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達的抑制作用表現出一定的劑量依賴性。見表3、圖7。

圖7 各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白條帶圖

表3 蛋白免疫印跡法各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白相對表達量比較（±s）

表3 蛋白免疫印跡法各組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白相對表達量比較（±s）

注： 與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與厄貝沙坦組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與芪蛭通絡方低劑量組比較，▲▲P＜0.01；與芪蛭通絡方中劑量組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別 動物數/只 Wnt1 β-catenin CTGF GSK-3β正常組 10 0.229±0.043 0.246±0.043 0.311±0.050 0.317±0.050模型組 10 0.922±0.057## 0.878±0.168## 0.919±0.116## 0.714±0.038##厄貝沙坦組 10 0.513±0.090##** 0.534±0.058##** 0.463±0.057#** 0.590±0.043##**芪蛭通絡方低劑量 10 0.796±0.064##*ΔΔ 0.679±0.051##* 0.621±0.073##**Δ 0.616±0.027##*芪蛭通絡方中劑量 10 0.722±0.092##**ΔΔ 0.559±0.071##** 0.521±0.067##** 0.574±0.034##**芪蛭通絡方高劑量 10 0.387±0.059#**Δ▲▲☆☆ 0.410±0.026#**▲▲☆ 0.346±0.038**▲▲☆ 0.424±0.058#**ΔΔ▲▲☆☆

4 討論

DKD發病隱蔽，早期僅有持續的微量白蛋白尿及腎小球高濾過率，極易忽視，若不及時加以干預，可能導致腎間質纖維化，最終進展為尿毒癥。目前DKD發病機制尚不清晰，西醫亦無特異性治療，主要以降壓、控糖、減少蛋白尿等對癥治療為主，起不到關鍵作用。近年來中醫藥治療DKD療效顯著，諸多研究表明中藥復方辨證施治，多靶點整體調節，可在根本上增強體質，顧護正氣，減輕腎纖維化程度，降低死亡率[13]。

DKD以腎病綜合征、高血壓等臨床表現為主，可歸屬于中醫學“水腫”“虛勞”等范疇。檀金川教授根據多年臨證經驗提出DKD病機總屬本虛標實，以脾腎兩虛為本，濕、濁、瘀互結為標[14]。《諸病源候論》云：“夫水腫病者，皆由榮衛痞澀，腎脾虛弱所為。”脾虛無以運化，腎虛則氣化不利、開闔失司，致使精微下注，水液代謝失常，發為蛋白尿、水腫；《血證論》[15]曰：“故氣不得通，不能載水津上升，是以發渴，名曰血渴，瘀血去則不渴矣……”濕濁內蘊，氣血運行不暢，氣滯則血瘀，血瘀則濕濁內生，三者相互影響、膠著，共同作用，推動疾病進展。芪蛭通絡方以健脾補腎、化濁祛瘀為出發點。方中黃芪、黨參健脾益氣，現代藥理研究表明黃芪有增強免疫、改善腎臟微循環、降低蛋白尿的功效[16]，為臨床治療腎臟病常用中藥；醋龜甲滋陰潛陽，在補腎的同時亦能顧護肝陰；丹參、川芎相須為用，活血祛瘀，丹參中的丹酚酸、鞣酸等成分具有降血脂、抗炎的作用[17]；茯苓健脾寧心、利水消腫；蟲類藥燙水蛭、全蝎、地龍，善行走竄之勢，搜風通絡化濁，檀師臨床善用此類藥物，因其活血化瘀力強，又能引諸藥直達病所[18]。

DKD發病機制與高糖環境、血流動力學改變、氧化應激及炎癥反應等有關，多種信號通路的異常激活可導致DKD細胞損傷、細胞外基質過剩[19]。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在DKD腎纖維化中起著關鍵作用[20]，通過介導上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）來引發RIF。該通路在正常腎臟中處于沉默狀態，Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白表達很低或無表達[21]，GSK-3β、β-catenin參與細胞增殖、分化及凋亡[22]。GSK-3β作為Wnt/β-catenin信號通路中的傳遞器之一，以“破壞復合物”的形式存在，在磷酸化β-catenin后再降解方面發揮著重要作用。研究表明，GSK-3β在纖維化的腎小管上皮細胞中高度表達，特異性的GSK-3β抑制劑可以減少GSK-3β表達，緩解RIF[23]。在高糖條件下，Wnt/β-catenin信號通路可被異常激活，Wnt1蛋白在腎臟中表達水平增加，此時Wnt1與其跨膜受體卷曲受體家族蛋白（Fzd）、低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）5和6 結合，蓬亂蛋白（Dishevelled，Dvl）被激活，GSK-3β被磷酸化，導致β-catenin不能降解而積累轉移到細胞核，然后與轉錄因子聚合成復合物，誘導靶基因的過度表達，從而促進EMT的進程，進而引發RIF[24-25]。CTGF是一種促纖維因子，大量實驗證明，CTGF作為預測RIF進展的指標，其表達隨著DKD的進展而增加[21]。CTGF下游可促進成纖維細胞合成、分泌大量膠原纖維，并通過與Wnt通路LRP6結合以異常激活Wnt通路，從而加重RIF[26]。孔維瑋[27]發現Nrf2可以通過下調CTGF表達水平來抑制Wnt通路以減輕RIF程度。由此表明，Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白均在RIF進展中發揮著重要的作用。本研究結果表明，模型組大鼠腎組織Wnt1、β-catenin、CTGF、GSK-3β蛋白含量均明顯高于正常組，與前述報道一致；芪蛭通絡方及厄貝沙坦對上述指標均有明顯的干預作用，推測這可能是其干預DKD的作用機制，其中芪蛭通絡方高劑量對上述指標的改善或明顯優于厄貝沙坦，或與厄貝沙坦相當，部分指標甚至接近正常組水平。本研究部分指標免疫組化法與蛋白免疫印跡法檢測結果存在不一致的現象，推測可能與樣本量偏小或者樣本誤差有關，未來將進一步觀察若延長給藥時間，芪蛭通絡方高劑量是否較厄貝沙坦療效顯著。

本實驗通過高糖高脂飲食與STZ注射制備DKD大鼠模型，選取臨床療效顯著的厄貝沙坦為陽性藥物。結果表明，芪蛭通絡方及厄貝沙坦對DKD大鼠血糖及腎功能指標、腎組織病理改變均有明顯的改善作用，說明兩種藥物對DKD均有治療作用，而芪蛭通絡方療效更優。在對比芪蛭通絡方各劑量組各指標的檢測結果發現，芪蛭通絡方對DKD大鼠血糖、腎功能指標、腎組織病理改變的改善作用均表現出一定的劑量依賴性，提示藥物濃度與治療效果可能存在著正相關，可為臨床用藥劑量提供參考。

綜上，我們推測芪蛭通絡方高劑量可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，減少Wnt1、CTGF活性，防止GSK-3β磷酸化，使泛素介導的β-catenin磷酸化后降解而處于沉默狀態，從而起到減輕RIF、保護腎臟的作用。然而本研究仍存在一定的局限性，如樣本量偏少、給藥和觀察期較短等，同時中藥復方成分復雜，可能涉及多個信號通路，下一步本課題組將增加樣本量，延長給藥時間，進一步挖掘芪蛭通絡方通過作用于其他靶點延緩RIF，保護腎臟的作用機制。