交泰丸穴位貼敷對(duì)心腎不交失眠模型大鼠HPA 軸相關(guān)激素的影響

趙心含 胡霖霖

失眠是臨床多發(fā)病、常見(jiàn)病，表現(xiàn)為入睡困難和/或難以維持睡眠，導(dǎo)致患者對(duì)睡眠時(shí)間或質(zhì)量不滿(mǎn)意[1]。失眠影響全球約22%的成年人，且發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[2]。長(zhǎng)期失眠患者常伴有不同程度的抑郁和焦慮，明顯影響患者的生活質(zhì)量[3-4]。交泰丸穴位貼敷是一種操作簡(jiǎn)單、副作用小且療效肯定的治療方法，但是其作用機(jī)制尚未明確[5]。研究表明，應(yīng)激引起的下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能的紊亂可表現(xiàn)為睡眠的開(kāi)始和持續(xù)困難，因此調(diào)節(jié)HPA 軸亢進(jìn)已成為治療失眠的關(guān)鍵靶標(biāo)[6]。本研究采用對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）腹腔注射和多因素共同作用建立大鼠失眠模型，研究交泰丸穴位貼敷對(duì)下丘腦病理?yè)p傷修復(fù)和HPA 軸相關(guān)激素的影響，探討交泰丸防治失眠的作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、雄性成年SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（250±50）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2022-0004。于浙江中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2021-0012，溫度（23±2）℃，濕度（56±2）%，依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)食和飲水，并遵循12 h 進(jìn)行明暗循環(huán)處理。本實(shí)驗(yàn)全程嚴(yán)格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范（倫理批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-202206-0454）。

1.2 主要藥物 交泰丸組方成分為黃連（浙江英特醫(yī)藥藥材有限公司，批號(hào)202203016）和肉桂（華東醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)20220822）以10∶1 配比，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院制藥廠研磨成細(xì)粉，再以醋和氮酮調(diào)配。艾司唑侖片（山東信誼制藥有限公司，批號(hào)2360712）。

1.3 儀器及試劑 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（MK3FC 型，美國(guó)Thomer Fisher 公司）；RM2255 全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（Leica Microsystems，Inc）；HE 染色機(jī)（Leica 公司）；貝克曼Allegra X-15R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）等。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)MM-0520R1）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）（批號(hào)MM-0565R1）、皮質(zhì)酮（CORT）試劑盒（批號(hào)MM-0559R1），均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 失眠模型的建立 采用腹腔注射PCPA 和多因素共同刺激的方法復(fù)制失眠動(dòng)物模型[7]。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠分別于第8～21 天隨機(jī)給予以下刺激：四肢束縛2 h、4 ℃冰水游泳5 min、禁食禁水24 h、夾尾1 min、明暗顛倒24 h、鼠籠傾斜45°24 h、潮濕墊料24 h，每天僅接受一種刺激且相鄰2 天的刺激不重復(fù)，第22～24 天上午8∶00～8∶30 腹腔注射PCPA 混懸液（450 mg/kg），連續(xù)給藥3 d。

1.5 分組和干預(yù)方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5 組：空白對(duì)照組、模型組、穴位貼敷組、艾司唑侖組、聯(lián)合干預(yù)（穴位貼敷聯(lián)合艾司唑侖）組，每組10 只，標(biāo)記后稱(chēng)重。造模完成后第2 天，穴位貼敷組和聯(lián)合干預(yù)組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》取心俞（雙側(cè)）、腎俞（雙側(cè)）、神闕、涌泉（雙側(cè)）貼敷0.5 cm×0.5 cm 的交泰丸藥餅，每天1 次，每次1 h，連續(xù)14 d。艾司唑侖組：造模成功后第2 天上午8∶00 給予0.3 mg/kg 艾司唑侖灌胃，連續(xù)14 d。聯(lián)合干預(yù)組：在穴位貼敷的基礎(chǔ)上給予0.3 mg/kg 劑量的艾司唑侖灌胃14 d（以下稱(chēng)為聯(lián)合干預(yù)組）。空白對(duì)照組和模型組大鼠進(jìn)行相同時(shí)間的抓取固定，但不進(jìn)行其他干預(yù)。

1.6 大鼠一般情況 每日觀察大鼠行為狀態(tài)、生理狀態(tài)、睡眠情況、毛發(fā)情況、活躍程度、精神狀態(tài)、體質(zhì)量及其他失眠引發(fā)的伴隨癥狀。

1.7 戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn) 連續(xù)給藥14 d，末次給藥1 h 后，各組大鼠腹腔注射閾下劑量的戊巴比妥鈉40 mg/kg，以大鼠能保持60 s 不翻動(dòng)為入睡指標(biāo)，以此記錄睡眠潛伏期，翻動(dòng)反射恢復(fù)為蘇醒指標(biāo)，以此記錄睡眠時(shí)間。

1.8 ELISA 法檢測(cè)血清和毛發(fā)中CRH、ACTH、CORT 含量 實(shí)驗(yàn)干預(yù)完成后，采集大鼠腹主動(dòng)脈血3～5 mL、腦后及頸背部新生毛發(fā)，毛發(fā)用不銹鋼碾磨成粉末加入甲醇溶解，靜置后將血清和毛發(fā)勻漿液5000 g 離心5～10 min，取上清，根據(jù)ELISA 試劑盒制造商的說(shuō)明書(shū)，測(cè)定血清和毛發(fā)內(nèi)的CRH、ACTH、CORT 的含量。

1.9 HE 染色法觀察大鼠下丘腦組織病理變化 采血結(jié)束后斷頸，參照大鼠大腦立體定位圖，用止血鉗取出下丘腦，并用生理鹽水洗去血污，放入10%的中性甲醛中固定24 h 以上，經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察下丘腦組織病理?yè)p傷。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 空白對(duì)照組大鼠的晝夜節(jié)律正常，白天安靜多眠，夜晚較活躍，精神良好，皮毛光亮；與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠晝夜節(jié)律紊亂甚至消失，白天活動(dòng)增多，攻擊性增加，精神狀態(tài)欠佳，毛發(fā)黃失去光澤，失眠大鼠模型造模成功；干預(yù)后，與模型組比較，穴位貼敷組、艾司唑侖組和聯(lián)合干預(yù)組三組大鼠晝夜節(jié)律恢復(fù)，白天活動(dòng)減少，能入睡，精神改善，毛發(fā)恢復(fù)光澤。與空白對(duì)照組比較，模型組體質(zhì)量增加緩慢（P＜0.05）；與模型組比較，穴位貼敷組、艾司唑侖組和聯(lián)合干預(yù)組的增重顯著（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較（g，±s）

注：空白對(duì)照組及模型組進(jìn)行相同時(shí)間的抓取固定，但不進(jìn)行其他干預(yù)；穴位貼敷組給予1 h 的交泰丸穴位貼敷；艾司唑侖組給予0.3 mg/kg艾司唑侖灌胃；聯(lián)合干預(yù)組給予1 h 的交泰丸穴位貼敷和0.3 mg/kg艾司唑侖灌胃；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組穴位貼敷組艾司唑侖組聯(lián)合干預(yù)組鼠數(shù)10 10 10 10 10干預(yù)前體質(zhì)量230.3±24.5 236.0±26.3a 239.1±27.4b 235.9±23.5b 235.9±23.5b干預(yù)后體質(zhì)量383.1±15.1 298.1±36.5a 355.6±12.9b 347.8±22.5b 351.8±21.5b

2.2 各組大鼠戊巴比妥鈉睡眠翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較與空白對(duì)照組比較，模型組失眠大鼠睡眠潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），睡眠持續(xù)時(shí)間明顯縮短（P＜0.05）；與模型組比較，穴位貼敷組、艾司唑侖組和聯(lián)合干預(yù)組的睡眠時(shí)間均延長(zhǎng)（P＜0.05），睡眠潛伏期縮短（P＜0.05），戊巴比妥鈉的催眠作用增強(qiáng)。提示交泰丸穴位貼敷后睡眠潛伏期減少，睡眠時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)失眠大鼠具有良好的催眠作用，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠戊巴比妥鈉睡眠翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表2 各組大鼠戊巴比妥鈉睡眠翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：空白對(duì)照組及模型組進(jìn)行相同時(shí)間的抓取固定，但不進(jìn)行其他干預(yù)；穴位貼敷組給予1 h 的交泰丸穴位貼敷；艾司唑侖組給予0.3 mg/kg艾司唑侖灌胃；聯(lián)合干預(yù)組給予1 h 的交泰丸穴位貼敷和0.3 mg/kg 艾司唑侖灌胃與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組穴位貼敷組艾司唑侖組聯(lián)合干預(yù)組鼠數(shù)10 10 10 10 10睡眠潛伏期（s）176.5±23.8 251.1±49.5a 199.8±28.0b 203.2±30.7b 203.9±38.6b睡眠時(shí)間（min）80.1±11.1 54.9±5.7a 71.7±13.6b 71.8±15.5b 71.8±15.5b

2.3 各組大鼠血清CRH、CORT、ACTH 水平比較與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清CRH、CORT、ACTH 的水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，穴位貼敷組、艾司唑侖組和聯(lián)合干預(yù)組的大鼠干預(yù)后血清ACTH、CORT 水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CRH 的下調(diào)雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有改善趨勢(shì)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清CRH、CORT、ACTH 水平（ng/L，±s）

表3 各組大鼠血清CRH、CORT、ACTH 水平（ng/L，±s）

注：空白對(duì)照組及模型組進(jìn)行相同時(shí)間的抓取固定，但不進(jìn)行其他干預(yù)；穴位貼敷組給予1 h 的交泰丸穴位貼敷；艾司唑侖組給予0.3 mg/kg艾司唑侖灌胃；聯(lián)合干預(yù)組給予1 h 的交泰丸穴位貼敷和0.3 mg/kg 艾司唑侖灌胃；CRH 為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素；CORT 為皮質(zhì)酮；ACTH 為促腎上腺皮質(zhì)激素；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組穴位貼敷組艾司唑侖組聯(lián)合干預(yù)組鼠數(shù)10 10 10 10 10 CRH 56.98±2.19 63.59±1.83a 61.23±2.23 61.48±1.50 61.24±1.42 CORT 93.00±2.95 99.73±1.09a 93.99±3.54b 94.10±2.78b 92.05±3.92b ACTH 138.24±2.71 144.74±1.15a 140.18±1.83b 140.27±2.11b 138.71±1.65b

2.4 各組大鼠毛發(fā)中CRH、CORT、ACTH 水平比較與正常組比較，模型組大鼠毛發(fā)中的CRH、CORT、ACTH 的水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，穴位貼敷組、艾司唑侖組和聯(lián)合干預(yù)組大鼠干預(yù)后毛發(fā)中的CRH、CORT、ACTH 水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠毛發(fā)中CRH、CORT、ACTH 水平比較（ng/L，±s）

表4 各組大鼠毛發(fā)中CRH、CORT、ACTH 水平比較（ng/L，±s）

注：空白對(duì)照組及模型組進(jìn)行相同時(shí)間的抓取固定，但不進(jìn)行其他干預(yù)；穴位貼敷組給予1 h 的交泰丸穴位貼敷；艾司唑侖組給予0.3 mg/kg艾司唑侖灌胃；聯(lián)合干預(yù)組給予1 h 的交泰丸穴位貼敷和0.3 mg/kg 艾司唑侖灌胃；CRH 為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素；CORT 為皮質(zhì)酮；ACTH 為促腎上腺皮質(zhì)激素；與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組穴位貼敷組艾司唑侖組聯(lián)合干預(yù)組鼠數(shù)10 10 10 10 10 CRH 56.46±1.76 61.29±0.742a 58.20±1.76b 57.66±1.53b 57.51±2.54b CORT 93.00±2.95 99.73±1.09a 93.99±3.54b 94.10±2.78b 92.05±3.92b ACTH 122.77±4.77 129.77±3.52a 123.00±1.71b 124.70±1.36b 123.30±3.44b

2.5 各組大鼠下丘腦組織HE 染色病理比較 空白對(duì)照組大鼠丘腦核團(tuán)所在區(qū)域，毛細(xì)血管不擴(kuò)張，數(shù)量不易識(shí)別，神經(jīng)元排列有序緊密，分布均勻；模型組大鼠丘腦核團(tuán)所在位置毛細(xì)血管擴(kuò)張，數(shù)量增多，血管壁增厚，神經(jīng)元排序混亂，排列疏松，膠質(zhì)細(xì)胞增生，可見(jiàn)空泡變性；穴位貼敷組、艾司唑侖組、聯(lián)合干預(yù)組大鼠丘腦核團(tuán)毛細(xì)血管擴(kuò)張不明顯，壁無(wú)明顯增厚，血管不增多，神經(jīng)元有序排序，排列緊密。見(jiàn)圖1。

3 討 論

《內(nèi)經(jīng)》對(duì)“不寐”的病因闡述為“營(yíng)衛(wèi)失和，陽(yáng)不入陰”，病機(jī)為營(yíng)衛(wèi)失調(diào)、臟腑損傷。中醫(yī)典籍《辨證錄》曾載：“蓋日不能寐者，乃腎不交于心；夜不能寐者，乃心不交于腎也”。交泰丸是中醫(yī)治療心腎不交失眠的經(jīng)典方，方中黃連性寒味苦，瀉心火燥濕；肉桂辛熱導(dǎo)火，補(bǔ)元陽(yáng)除積冷，兩藥配伍使心火下降，腎水上濟(jì)，水火既濟(jì)而陰陽(yáng)交泰。本研究采用腹腔注射PCPA 和多因素共同刺激復(fù)制失眠動(dòng)物模型，造模后大鼠表現(xiàn)出晝夜節(jié)律紊亂，白天活動(dòng)增多，攻擊性增加，精神萎靡，毛發(fā)枯槁等癥狀，與中醫(yī)臨床證候中心腎不交失眠的表現(xiàn)相符。本研究失眠模型大鼠行為學(xué)與楊鈺涵等[7]的心腎不交失眠大鼠表現(xiàn)一致。故本研究選擇交泰丸作為心腎不交失眠的辨證治療藥物。

穴位貼敷以中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論為依據(jù)，辨證選取經(jīng)絡(luò)、穴位和中藥，將針灸療法與中藥療法的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，從而達(dá)到內(nèi)病外治目的。本研究選取的心俞、腎俞位于足太陽(yáng)膀胱經(jīng)，心俞可以瀉心火下交于腎，腎俞則補(bǔ)腎陽(yáng)上濟(jì)于心，涌泉穴位于足少陰腎經(jīng)，諸穴合用可引氣血下行。神闕穴為穴位貼敷治療失眠的常用穴，具有明確的鎮(zhèn)靜安神作用。本研究選擇的交泰丸穴位貼敷是將治療心腎不交失眠的中藥外敷，經(jīng)過(guò)透皮作用吸收，再加上穴位的刺激作用，融于氣血，由經(jīng)脈入臟腑，直達(dá)病灶，因此睡眠得以改善。戊巴比妥鈉睡眠翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了交泰丸穴位貼敷能顯著延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠的睡眠時(shí)間，加快大鼠入睡時(shí)間，其中交泰丸穴位貼敷聯(lián)合艾司唑侖效果最佳，提示交泰丸穴位貼敷可以起到加強(qiáng)鎮(zhèn)靜和催眠作用。本研究取大鼠下丘腦組織通過(guò)HE染色法觀察，發(fā)現(xiàn)交泰丸穴位貼敷可以減少下丘腦核團(tuán)毛細(xì)血管擴(kuò)張和神經(jīng)元排序，一定程度上改善下丘腦的病理?yè)p傷。

研究報(bào)道對(duì)大鼠的物理刺激會(huì)導(dǎo)致HPA 軸的激活，HPA 軸在參與機(jī)體的各種應(yīng)激反應(yīng)、保持警覺(jué)和調(diào)節(jié)睡眠方面起重要作用[8]。下丘腦室旁核可通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)血清CRH、ACTH、CORT 激素水平，從而平衡HPA 軸。較高水平激活的HPA 軸會(huì)使ACTH、CRH、CORT 合成和分泌增多，導(dǎo)致睡眠變淺和夜間清醒時(shí)間增加[9]。長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致HPA軸調(diào)節(jié)能力減弱，導(dǎo)致失眠的惡性循環(huán)[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)失眠癥患者血漿CRH、ACTH、CORT 含量均升高，HPA 軸功能亢進(jìn)，因此平衡HPA 軸是治療失眠的關(guān)鍵方法[11]。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)取大鼠的新生毛發(fā)和血清進(jìn)行對(duì)比分析，ELISA 結(jié)果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與模型組比較，穴位貼敷組、艾司唑侖組、聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后毛發(fā)中的ACTH、CRH 和CORT 的激素均降低，血清ACTH和CORT 的激素水平降低。研究結(jié)果提示經(jīng)過(guò)穴位貼敷和艾司唑侖單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)后，大鼠的睡眠情況得到改善，穴位貼敷聯(lián)合艾司唑侖療效更優(yōu)。本研究顯示交泰丸穴位貼敷一定程度緩解PCPA 失眠大鼠的HPA 軸過(guò)激狀態(tài)，且可協(xié)同艾司唑侖起到更好的療效。

本研究結(jié)果顯示血清CRH 水平僅有降低趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與侵入性的采血操作伴隨著額外的壓力有關(guān)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，血清皮質(zhì)醇反映的是總皮質(zhì)醇的量，受晝夜節(jié)律、取樣操作等刺激影響較大，而毛發(fā)樣本反應(yīng)的是游離皮質(zhì)醇，可反映長(zhǎng)期HPA 軸是否平衡。因此毛發(fā)樣本相對(duì)于血清樣本更具有穩(wěn)定性，這與El 等[12]的研究結(jié)果一致。大鼠毛發(fā)的生長(zhǎng)規(guī)律與人類(lèi)不同，大鼠成年后毛發(fā)長(zhǎng)度基本不變，不能反映在過(guò)去一段時(shí)間內(nèi)皮質(zhì)醇的水平變化。因此我們?cè)趯?shí)驗(yàn)前剃除了大鼠的腦及背頸部毛發(fā)，采集新生毛發(fā)作為樣本，發(fā)現(xiàn)新生毛發(fā)才可以反映實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)皮質(zhì)醇的水平變化。

綜上所述，交泰丸穴位貼敷可以一定程度上改善大鼠失眠癥狀，其機(jī)制可能與通過(guò)下調(diào)CRH、CORT、ACTH 激素水平從而平衡HPA 軸有關(guān)，且新生毛發(fā)相對(duì)于血清更具有穩(wěn)定性。