氨基甲酸乙酯水解酶可溶性表達及其酶學性質研究

劉鳳松,李亞杰,李亞賢,龍夢飛,陸智,*

1(無限極(中國)有限公司,廣東 廣州,510405)2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)是一種在發酵食品的儲藏和運輸過程中生成的有毒物質,對人類具有潛在的致癌性[1]。據報道,發酵酒精飲料中的乙醇可增強EC的致癌性[2],因此,為保障食品的安全性,需要對黃酒、葡萄酒、清酒、白蘭地等發酵酒精飲料中EC的含量進行嚴格控制。黃酒中EC的含量上限為100 μg/L,而目前國內黃酒釀造中EC的含量最高可達750 μg/L[3],這不但影響長期飲酒者的健康,也會造成因未達到食品安全標準而影響出口的問題。減少食品中EC的主要方法有工藝優化法[4]、發酵菌株的代謝工程改造法[5]和酶促降解法[6-7]。前兩種策略主要針對EC的底物和生成途徑進行消減和改造,但這兩種策略會產生無法完全消減EC、EC降解效率低、食品風味受損等問題。酶促降解法主要涉酸性脲酶[8]和EC水解酶[9],這2種酶能夠分別將尿素和EC轉化為乙醇、CO2和NH3[10-11]。脲酶是許多國家允許在發酵酒精飲料中添加的酶,它能通過有效地降解尿素(EC的前體)來控制EC的含量,但不能降解已形成的EC。EC水解酶可以直接水解EC,但EC水解酶難以在工業中得到應用,主要由于其乙醇耐受性較差且可溶性表達量較低,易形成不溶于水的、難以應用的包涵體。

目前,酶的改性策略包括理性設計[12]、定向進化[13]和半理性設計[14]。LIU等[15]通過對雙功能脲酶結構進行解析,篩選出預計對酶活性影響較大的目標氨基酸位點,然后通過飽和突變篩選出了活性和乙醇耐受性提高的雙功能脲酶。康婷婷[16]通過多序列比對挖掘突變位點提高了來自Agrobacteriumtumefaciens的酰胺酶AmdA的活性和乙醇耐受性。酶的理性設計中,PROSS計算是一種在服務器中能夠實現自由計算的程序,該程序通過將構象自由能和序列保守性相結合,篩選出蛋白結構中易產生錯誤折疊和不穩定的區域進行修飾和改造,從而達到可溶性表達和穩定性等酶學性質的提高[17]。PELEG等[18]將PROSS作為獨立的應用工具進行了基準測試,10個目標蛋白中有9個熱穩定性得到提高。此外,有2個野生型(wild type,WT)蛋白質在大腸桿菌中不能作為可溶性蛋白質表達,但經PROSS設計改造后,實現了高水平表達,并提高了熱穩定性,證明PROSS可提高蛋白質的熱穩定性和可溶性表達水平。因此,利用PROSS對EC水解酶的整體結構和序列進行計算,可能獲得可溶性及穩定性等酶學性質得到提升的高性能突變體。

此外,對蛋白可溶性表達的改造主要策略還有:針對蛋白表達條件的優化[19],以及針對蛋白本身添加標簽進行融合表達[20]等。表達條件的優化主要是指改變蛋白表達過程中的某些條件,從而達到促進蛋白正確折疊的目的,例如改變蛋白的表達溫度、誘導蛋白表達的誘導劑濃度或在表達環境中添加化學分子伴侶等。李京京[21]曾通過調整EC水解酶的表達培養基、IPTG濃度、培養溫度、培養時間以及添加蔗糖和山梨醇改變疏水滲透壓等方法來優化EC水解酶的可溶性表達。融合標簽能夠促進蛋白可溶性表達的原因主要有:融合標簽對分子伴侶有一定吸引作用,從而使蛋白能夠在其指導下進行折疊減少錯誤概率;融合標簽能夠隔離錯誤折疊區域,從而使正確折疊結構暴露,增加其可溶性[22];融合標簽所帶的靜電荷也可防止蛋白聚集從而形成包涵體[23]。

本研究以提高EC水解酶的工業屬性為目標,擬結合基于計算輔助的酶工程手段與促溶標簽優化表達等策略,改造獲得活力高、可溶性表達好、乙醇穩定性強的高性能EC水解酶,為促進EC水解酶的工業化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

克隆宿主大腸桿菌EscherichiacoliJM109、表達宿主大腸桿菌E.coliBL21(DE3)、空質粒pET-20b,實驗室保藏;EC水解酶基因來源于LysinibacillusfusiformisSCO2 (GenBank ID: KU353448);酵母提取物、蛋白胨、NaCl、甘油、Na2HPO4、K2HPO4、亞硝基鐵氰化鈉、苯酚、NaClO、NaOH、三氯乙酸,國藥集團化學試劑有限公司; IPTG、氨芐西林,上海生工生物工程有限公司;EC,美國Sigma公司;質粒提取試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒、Fast Mutagenesis kit V2試劑盒,TaKaRa公司。引物由金唯智公司合成,本文所用引物和序列見表1。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 計算設計方法

將AlphaFold2所建模的EC水解酶結構上傳至PROSS程序中,排除催化活性位點后進行計算[24]。PROSS程序識別序列后生成同源序列,通過比對后可以得出高分突變結果,對突變結果計算自由能變化,并根據能量的高低進行突變體的組合(https://pross.weizmann.ac.il)。此外,研究利用了2種通過支持向量機(support vector machine, SVM)模型設計的標簽,一種為已報道的通過機器學習設計的通用促溶標簽,另一種為利用MATLAB R2021b軟件對EC水解酶蛋白序列分析后得出的特定提高EC水解酶可溶性表達的促溶標簽[25]。

1.2.2 突變體構建及表達

以EC水解酶WT質粒為模板,采用Fast Mutagenesis kit V2試劑盒進行突變體表達質粒的構造。采用LB培養基培養菌株和TB培養基表達EC水解酶。重組菌株接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的20 mL LB培養基中,37 ℃過夜培養。將接種量3%的種子液轉入含100 μg/mL氨芐青霉素的200 mL TB培養基中,37 ℃培養。當菌液OD600值達到0.4時加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG,然后在25 ℃下培養18 h。

1.2.3 酶純化方法

菌株表達后離心收集,重懸于磷酸鹽緩沖液中。4 ℃超聲波處理30 min后,離心收集上清液。通過親和層析的方法純化與Ni+相連的帶His標簽的目標蛋白酶。純化時,先用含100 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫未結合的雜質蛋白,再用300 mmol/L的咪唑磷酸鹽緩沖液洗脫目標蛋白,收集的洗脫蛋白經超濾管濃縮脫鹽,適當稀釋后用于酶學性質測定。

1.2.4 酶活性測定方法

通過反應中NH3的生成來測定EC水解酶的活性[26]。在最佳反應條件下單位時間降解EC產生1 μmol氨所需的酶量為一個酶活力單位。酶活力測定方法:反應底物1 mL 30 g/L的EC溶液,加入1 mL酶溶液37 ℃條件下反應15 min,反應結束后添加1 mL 10%三氯乙酸使酶失活。隨后加入1 mL顯色劑I (15 g苯酚和0.625 g硝普鈉溶解至250 mL)和1 mL顯色劑Ⅱ (13.125 g NaOH和7.5 mL NaClO溶解至250 mL) 混勻,37 ℃保溫20 min后將反應體系稀釋至10 mL并在625 nm處測定樣品的吸光度,測定NH3含量。酶活性按公式(1)計算:

式中:ΔOD625,樣品與空白對照的吸光度值之差;n,酶溶液的稀釋倍數;k,標準曲線斜率的倒數,15,反應時間,min。

標準曲線的測定方法為:顯色劑Ⅰ和Ⅱ按照如上反應方法和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L的NH4+標準溶液反應后測得吸光值并繪制吸光度-濃度標準曲線。

1.2.5 酶學性質測定方法

為了測定蛋白的最佳反應溫度,在不同溫度條件下(30～60 ℃)測定酶活性,計算各條件下的相對酶活力。為驗證酶的穩定性,將酶在不同溫度(30～60 ℃)下保溫30 min后再進行測定。測定不同乙醇體積分數(5%～20%)下的酶活性,計算各條件下的相對酶活力為蛋白的乙醇耐受性。在不同體積分數的乙醇(5%～20%)下保溫1 h后測定蛋白酶活力,以表征其在乙醇中的穩定性。通過改良的Bradford蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度以計算蛋白的比酶活力。在0～300 mmol/L的EC濃度范圍內測定了WT EC水解酶及突變體的動力學參數,通過Origin軟件繪制了酶活性與底物濃度的關系,擬合Michaelis-Menten方程,得到Vmax和Km。按公式(2)計算kcat:

式中:E為摩爾濃度。

1.2.6 模擬酒樣實驗方法

模擬酒樣中乙醇體積分數為15%,pH值為4.5,底物EC質量濃度為500 μg/L。在模擬酒樣中加入終質量濃度約為1.5 mg/mL的WT和突變型EC水解酶,在30 ℃下反應12 h。反應溶液分別在1、3、7、12 h后取樣,用GC-MS精確檢測殘留的EC以判斷其對EC的水解能力。在模擬酒樣中測定EC水解酶的最適pH,將模擬酒樣設置成不同pH值(4、5、6、7、8、9)后測定其在37 ℃中的酶活力。以模擬酒樣為底物測定金屬離子對EC水解酶活力的影響,將1 mmol/L的不同金屬離子(Fe2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ba2+)及終濃度為0.1 mmol/L的化學試劑與酶液混合,然后于37 ℃條件下測定其在模擬酒樣中的酶活力。最后將模擬酒樣中的EC分別替換為同濃度的氨基甲酸甲酯(methyl carbamate, MC)、氨基甲酸丁酯(butyl carbamate, BC)、丙烯酰胺(acrylamide, AM)、甲基丙烯酰胺(methacrylamide, MAM),探究其對氨基甲酸酯類底物和酰胺類底物的水解能力。

2 結果與分析

2.1 基于PROSS計算的EC水解酶突變體構建及性質表征

利用AlphaFold2對EC水解酶序列進行結構建模,建模后上傳至PROSS程序進行計算。PROSS的計算結果中共有9個突變體,其中突變位點最少的突變體包含了18個位點的突變,其余組合突變均突變了30個位點以上。通常情況下突變位點個數過多會導致結構變化過大從而使酶活力降低[27],所以本研究選擇了最少的18點突變體進行了單突變位點的拆分和構建。如圖1-a所示,大部分突變體的酶活性高于WT。其中酶活力提高最多的突變體為S21E,其比酶活力為2.47 U/mg,是WT比酶活力(1.89 U/mg)的1.31倍。如圖1-b所示,耐受性增加最多的3個位點為S21E、H197Y及S292L。S21E在5%乙醇的相對酶活力為88.32%,高于WT的64.26%,雖在20%乙醇的相對酶活力下降至11.26%但仍高于WT的8.12%。另2個位點,在低乙醇濃度條件下所表現出的酶活力也較好,隨著乙醇濃度升高酶活力下降較緩慢,在20%乙醇下H197Y的相對酶活力為20.75%,P348I的相對酶活力為12.87%。

a-基于PROSS計算的單突變體相對酶活力;b-單突變體的乙醇耐受性;c-組合突變體的相對酶活力;d-組合突變體的乙醇耐受性圖1 基于計算設計的突變體的相對酶活力和乙醇耐受性Fig.1 Relative enzyme activity and ethanol tolerance of various mutants constructed by computer-aided design

為進一步提高突變體的活性和乙醇耐受性,本研究選擇了酶活力及乙醇耐受性都提高較多的3個突變體:S21E、H197Y及P348I進行組合突變。表達了S21E/H197Y、S21E/P348I、H197Y/P348I、S21E/H197Y/P348I并測定了其相對酶活力結果如圖1-c所示,其中酶活力提高最多的突變體S21E/P348I/P348I的酶活力為2.06 U/mg,僅為WT的1.09倍,提高效果較差。因此,本研究結合前期篩選得到的能夠提高EC水解酶活力的突變位點Q328C[28],構建的新突變體S21E/H197Y/Q328C/P348I命名為EC4,EC4比酶活力為2.93 U/mg,相較于WT提高了約1.55倍。如圖1-d所示,20%乙醇中的相對酶活力為21.03%,相較于WT(8.2%)提高了約2.56倍。此外還測定了EC4的動力學常數如表2所示,其Km值為29.31 mmol/L,小于WT的37.67 mmol/L,表明其對底物的親和力有所提高。

表2 野生型和突變體EC水解酶的動力學參數Table 2 Enzymatic kinetic parameters of EC hydrolase WT and variants

2.2 融合標簽優化EC水解酶的表達

進一步地,為提高EC水解酶的可溶性表達,本研究選擇了兩大類融合標簽優化EC水解酶的表達,其中一類為通過機器學習設計獲得的短促溶標簽,分別為已報道的通用標簽SVM1、SVM2及本研究針對EC水解酶計算所得的促溶標簽SVM3。另一類為幾個天冬氨酸所組成的短肽,有研究認為在蛋白的氮端添加帶負電的氨基酸可以幫助蛋白更好的折疊和表達,而天冬氨酸的輔助效果會優于谷氨酸,機器學習所選擇的短促溶標簽主要由谷氨酸組成,因此研究選擇5個和7個天冬氨酸所組成的短肽作為促溶標簽與EC水解酶相連,探究其對EC水解酶可溶性表達的提高效果[29]。上述5種短促溶標簽序列見表3。

表3 促溶標簽序列Table 3 Sequence of solubility-enhancing tag

如圖2-a所示,標簽SVM1和5D對EC水解酶活力的提高最多,其中SVM1-EC4的酶活力為26.06 U/mL,約為WT的1.82倍。而5D-EC4的酶活力為23.06 U/mL,約為WT的1.61倍,添加其余5種標簽后酶活力高于WT卻低于EC4。

a-相對酶活力;b-表達驗證(S為上清液,P為沉淀)圖2 含不同融合標簽的EC4的活力與表達性能表征Fig.2 Characterization of the activity and expression performance of EC4 with different fusion tags

如圖2-b所示,添加促溶標簽的EC水解酶表達條帶均粗于WT和EC4的表達條帶,且沉淀中的包涵體含量也有所減少。其中,SVM1-EC上清液中EC水解酶對應的條帶最粗,表明其可溶性表達提高最明顯。

2.3 含不同融合標簽EC4的最適反應溫度及溫度穩定性

如圖3-a所示,其中SVM1-EC4和SVM2-EC4的最適溫度為45 ℃,在所有酶中最高,隨著溫度的升高,酶活力呈現出緩慢的下降趨勢,在50 ℃下SVM1-EC4仍保留35.66%的相對酶活力,高于WT的16.08%。如圖3-b所示,溫度穩定性波動趨勢與最適溫度相似,均在40 ℃附近出現下降趨勢,其中下降趨勢較為緩慢的酶是SVM1-EC4,可能是由于標簽蛋白的添加增強了EC水解酶整體的穩定性。

a-最適溫度;b-溫度穩定性圖3 含不同融合標簽的EC4的最適溫度和溫度穩定性Fig.3 Optimal temperature and temperature stability of EC4 with different fusion tags

2.4 含不同融合標簽EC4的乙醇耐受性及乙醇耐受穩定性

在乙醇耐受性和乙醇穩定性的測定中,SVM1-EC4表現較好,如圖4-a所示,其在15%乙醇中的相對酶活力為65.32%,是WT的3.99倍,高于連接其他融合標簽的EC4;20%乙醇的相對酶活力為31.15%,是WT的3.80倍。如圖4-b所示,隨著乙醇濃度的升高這幾種酶的酶活力下降速度變快,SVM1-EC4在5%乙醇的相對酶活力最高是58.15%,但在20%乙醇的相對酶活力僅有10.87%。5D-EC4則更加穩定,其在15%乙醇保溫的相對酶活力仍有27.41%,為WT的2.98倍。

2.5 SVM1-EC4在模擬酒樣中的應用

綜合考量改造后EC水解酶活力、溫度穩定性及乙醇穩定性的提高效果后,本研究選擇SVM1-EC4進行進一步的酶學性質測定。通過模擬真實酒樣條件下反應12 h后SVM1-EC4和WT消減EC的量來判斷其對EC的水解能力,結果如圖5-a所示,SVM1-EC4消減EC的能力為WT的2.07倍。此外,研究通過調整模擬酒樣的pH來測定SVM1-EC4最適pH,結果如圖5-b所示,pH=7.0時的酶活力最高,在pH值為6或8時,SVM1-EC4仍能保持50%以上的相對酶活,但其酶活力在pH 4～5及pH=9條件下很低,僅有5%。如圖5-c所示,其中Mg2+對其酶活力有微弱促進作用,Ba2+對該酶有輕微抑制作用,Cu2+對其抑制作用最強。如圖5-d所示,SVM1-EC4對MC和一些酰胺類物質較好的水解作用,但幾乎不能水解BC。

a-乙醇耐受性;b-乙醇耐受穩定性圖4 含不同融合標簽的EC4的乙醇耐受性和 乙醇耐受穩定性Fig.4 Ethanol tolerance and ethanol tolerance stability of EC4 with different fusion tags

a-SVM1-EC4在模擬酒樣中的應用;b-SVM1-EC4在模擬酒樣中的最適pH;c-金屬離子對SVM1-EC4的影響; d-SVM1-EC4對不同酰胺類物質的水解能力圖5 SVM1-EC4在模擬酒樣中的酶學性質Fig.5 Enzymatic properties of SVM1-EC4 in simulated wine samples

3 結論

本研究結合計算和融合標簽來優化EC水解酶的穩定性及可溶性。基于PROSS計算獲得四突變體S21E/H197Y/Q328C/P348I,其酶活力相較于WT提高了1.55倍,在20%乙醇中的相對酶活力為21.03%,相較于WT(8.2%)提高了約2.56倍。其次,選擇了基于SVM模型設計的SVM1、SVM2、SVM3標簽以及由不同數量天冬氨酸組成的短肽標簽探究其對EC水解酶可溶性表達的影響。SVM1-EC4的可溶性表達提高最顯著,且在15%乙醇中的相對酶活性是WT的3.99倍。最后,進一步探究了SVM1-EC4水解酶酶學性質及在模擬酒樣中的應用,在模擬酒樣中反應12 h后SVM1-EC4消減EC的量為WT的2.07倍。SVM1-EC4在pH=7.0條件下的酶活力最高,Mg2+對其有微弱促進作用,對除BC以外的MC、AM和MAM有較好的水解作用。總之,本研究利用基于計算輔助改造與融合標簽相結合的優化改造策略有望促進傳統發酵食品中酶法降解EC的工業化應用。