耐熱嗜酸β-甘露聚糖酶TaMan5A在畢赤酵母中高效表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

王家強(qiáng),鄭鋒振

(浙江樹人學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州,310015)

半纖維素是一種復(fù)雜的多糖類化合物,主要是由甘露聚糖和木聚糖組成的[1]。被木質(zhì)纖維素包裹致密的半纖維素難以被降解,限制了木材的強(qiáng)度[2]和硬度,降低了資源的利用率。因此如何提高半纖維素降解效率、改善木質(zhì)纖維素[3]的結(jié)構(gòu)成為增強(qiáng)木材性能的主要問題。

降解半纖維素的方法有很多[4],使用β-甘露聚糖酶酶解是一種高效、清潔的方法。β-甘露聚糖酶廣泛存在于動物、植物和微生物中,但大部分都來自于微生物[5],青霉屬 (Penicillium)和木霉屬 (Trichoderma)[6]微生物是生產(chǎn) β-甘露聚糖酶的重要來源,且多數(shù)分泌到細(xì)胞外。

甘露聚糖酶的耐熱特性使其在飼料工業(yè)[7-8]、造紙工業(yè)、食品工業(yè)[9]中有著廣泛的應(yīng)用。并且甘露聚糖酶在降解玉米和小麥秸稈廢棄物方面也做出了重要貢獻(xiàn)。目前,焚燒仍是處理秸稈的一種重要的方式[10],但焚燒會產(chǎn)生大量CH4、CO、CO2[11-13],最終會導(dǎo)致溫室效應(yīng)。2020年秸稈焚燒量已經(jīng)達(dá)到了114.8萬t[13]。而使用酶處理是一種溫和的方式,基本不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物,為實(shí)現(xiàn)“碳中和,碳達(dá)峰”的國家戰(zhàn)略目標(biāo)提供了新研究思路。

畢赤酵母(Komagataellaphaffii)作為異源蛋白的表達(dá)宿主具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)易于操作,生產(chǎn)成本低廉且與先進(jìn)的真核表達(dá)系統(tǒng) (如CHO細(xì)胞系)高度相似。與大腸細(xì)菌相比,K.phaffii表達(dá)系統(tǒng)可以對異源蛋白進(jìn)行正確的折疊并形成二硫鍵,這些特性使該表達(dá)系統(tǒng)比細(xì)菌更有利于重組表達(dá)真核蛋白。同時,K.phaffii將異源蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中,且內(nèi)源蛋白的分泌水平較低,很大程度降低了下游蛋白純化所需成本。此外,線性化的外源DNA通過交叉重組整合到K.phaffii基因組中,產(chǎn)生比較穩(wěn)定的工程菌株。與Saccharomycescerevisiae不同,K.phaffii將幾乎所有的葡萄糖都轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)而不轉(zhuǎn)化為乙醇和有機(jī)酸,這使得K.phaffii在有氧條件下可以達(dá)到較高的細(xì)胞密度[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棘孢木霉(T.asperellum)ND-1源自內(nèi)蒙古土壤樣品,大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和BL21(DE3)購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司,畢赤酵母X-33由本實(shí)驗(yàn)室保存。刺槐豆膠(locust bean gum, LBG), 美國Sigma-Aldrich公司。Xmark酶標(biāo)儀,美國伯樂bio-rad有限公司;DYY-C電泳儀,北京六一生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

BMMY種子培養(yǎng)基:酵母粉10 g,胰蛋白胨20 g,100 mL 1 mol/L的磷酸鈉緩沖液 (pH 6.0),去離子水定容至1 L。使用前加入無菌的100 mL 13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基和2 mL 0.02%生物素 (配方選自生工生物工程股份有限公司)。BMGY發(fā)酵培養(yǎng)基:在BMMY培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加甘油10 g。LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。YPD培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20。

1.3 TaMan5A基因的克隆與表達(dá)

以新鮮菌絲為材料,利用試劑盒QIAGEN提取T.asperellumND-1基因組,具體操作參考說明書。不同種類的微生物具有不同的密碼子偏愛性,密碼子的優(yōu)化能夠進(jìn)一步提高重組蛋白在K.phaffii中的表達(dá)水平[15]。將TaMan5A送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化,有效提高甘露聚糖酶TaMan5A在畢赤酵母中表達(dá)水平。

1.4 TaMan5A酶活力測定

用50 mmol/L,pH 4.0乙酸鈉緩沖液配制5 g/L LBG溶液,將50 μL酶液與450 μL LBG混勻,65 ℃反應(yīng)10 min,加入750 μL DNS,沸水浴5 min,測定OD540值。以緩沖液反應(yīng)體系為空白對照,參考甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力。上述條件下,將1 min內(nèi)水解LBG產(chǎn)生1 μmol甘露糖所需的酶量作為一個酶活力單位。

1.5 TaMan5A酶學(xué)性質(zhì)

1.5.1 最適pH及其穩(wěn)定性

最適pH:配制50 mmol/L pH 2.0～8.0的緩沖液各100 mL[16],并用不同pH緩沖液配制底物,稀釋酶液,測定不同pH條件下的酶活性,將最大酶活力作為100%。

pH穩(wěn)定性:將用不同pH緩沖液稀釋了100倍的酶液放入4 ℃冰箱中,孵育1 h,重復(fù)測定最適pH的實(shí)驗(yàn)步驟。以未孵育酶液測得的酶活力為100%。

1.5.2 最適溫度及其穩(wěn)定性

最適溫度:設(shè)定了7個溫度梯度(20～80 ℃),用50 mmol/L pH 4.0的醋酸鈉緩沖液溶解底物并稀釋酶液。設(shè)定最大酶活力為100%,分別測定不同溫度下的酶活性。

溫度穩(wěn)定性:將稀釋100倍的酶液在不同溫度下孵育30 min。以未孵育的酶液測得的酶活力作為100%,分別測定不同溫度下的酶活性。

1.5.3 乙醇和NaCl濃度變化對TaMan5A酶活性的影響

在2 mL離心管內(nèi)分別加入2.5%、5%、10%、20%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇和稀釋了10倍的酶液,在另外的2 mL離心管內(nèi)分別加入50、100、150 g/L的NaCl溶液和稀釋了10倍的酶液,同放入4 ℃冰箱內(nèi)孵育1 h,將未加乙醇和NaCl溶液的純酶液組所測得的酶活力作為100%,測定不同乙醇和NaCl濃度處理組別的相對酶活力。

1.5.4 金屬離子對TaMan5A酶活性的影響

用50 mmol/L pH 4.0的醋酸鈉緩沖液稀釋金屬離子溶液和酶液,使得金屬離子終濃度分別為1、5 mmol/L。將酶與金屬混合液放入4 ℃冰箱內(nèi)孵育1 h,將未加金屬離子的酶液組所對應(yīng)的酶活力作為100%,測定不同濃度金屬離子處理酶液的相對酶活力。

1.6 曲面優(yōu)化

1.6.1 單因素試驗(yàn)

以溫度50 ℃、pH 4.0、玉米秸稈用量0.25 g、TaMan5A用量0.2 g、纖維素酶用量0.3 g、水解2 d為基礎(chǔ)組合條件。首先采用單因素的方法優(yōu)化秸稈降解效率,依次對pH值(2.0～8.0),玉米秸稈用量 (0.1～0.75 g),TaMan5A用量 (0.1～0.5 g),時間(1～3 d)進(jìn)行優(yōu)化,每次均以最佳條件作為定量值,以需優(yōu)化單因素作為變量,獲得單因素最佳優(yōu)化條件。設(shè)計(jì)方案如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平分析Table 1 Analysis of experimental factor levels

1.6.2 曲面優(yōu)化

在優(yōu)化單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上,以pH、玉米秸稈用量、TaMan5A用量、時間為自變量,以O(shè)D值為響應(yīng)量對秸稈的降解效率進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design scheme and experimental results

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

酶學(xué)性質(zhì)測定均作了2次重復(fù),并設(shè)定了空白對照,采用Origin 2017對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露聚糖酶基因TaMan5A的克隆

基于前期基因組測序信息,課題組從T.asperellumND-1基因組中篩選了一個GH5家族的甘露聚糖酶基因TaMan5A,根據(jù)酵母密碼子偏愛性,將甘露聚糖酶基因TaMan5A進(jìn)行優(yōu)化合成,并將其連在 pPICZαA表達(dá)質(zhì)粒上,命名為pPICZα-TaMan5A。利用限制性內(nèi)切酶SacI對質(zhì)粒pPICZα-TaMan5A進(jìn)行線性化, 濃縮之后電轉(zhuǎn)入K.phaffii中, 并在含有100 μg/mL Zeocin抗性的YPDS平板上進(jìn)行培養(yǎng)和純化。重組菌株命名為TaMan5A-X33。利用引物 (AOX-F:GACTGGTTCCAATTGACAAGC,AOX-R:GCAAATGGCATTCTGACATCC)對其進(jìn)行PCR驗(yàn)證。由圖1對比DNA marker可得,該基因的長度為941 bp;且3和4泳道上均得到了很亮的PCR擴(kuò)增條帶,說明2個工程菌均為真陽性。故本實(shí)驗(yàn)得到的K.phaffii重組子為陽性克隆。

M-DNA marker;1-負(fù)對照;2-正對照;3,4-構(gòu)建的工程菌株圖1 PCR驗(yàn)證K.phaffii重組Fig.1 PCR verification of K.phaffii recombination

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)

將成功設(shè)計(jì)的K.phaffii重組菌株 TaMan5A-X33在含Zeocin抗性的YPD平板上進(jìn)行劃線。28 ℃, 200 r/min培養(yǎng), 利用1%的甲醇誘導(dǎo)132 h后, 收集上清液。利用SDS-PAGE對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析,得到一條分子質(zhì)量約為67 kDa的蛋白條帶(圖2), 與分子質(zhì)量的理論值相一致。隨著誘導(dǎo)時間的延長, TaMan5A的表達(dá)量逐漸增多,說明TaMan5A在X-33中表達(dá)成功, 且蛋白純度較高, 可直接進(jìn)行后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)研究。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量marker;1-0 h;2-24 h; 3-48 h;4-72 h;5-96 h;6-120 h圖2 TaMan5A 0～120 h搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 Induced expression of TaMan5A in shake flasks from 0 to 120 hours

2.3 TaMan5A酶學(xué)性質(zhì)的分析

2.3.1 最適pH及其穩(wěn)定性

離心獲得的上清液即為實(shí)驗(yàn)測定酶液TaMan5A,如圖3-a所示,在pH 2.0～8.0,酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,相對酶活力都高于35%,pH 4.0條件下測得最高酶活力,pH 5.0～8.0的條件下,酶活力不斷下降,是一類中性嗜酸酶。來源不同的甘露聚糖酶pH偏好不同,從枯草桿菌YZ-21中克隆出的甘露聚糖酶,其最適pH值為7.0,是一種pH中性酶[17]。如圖3-b所示,pH 2.0～6.0的范圍內(nèi)殘留酶活力都在80%以上,TaMan5A在該pH條件范圍內(nèi)穩(wěn)定性高。pH>6.0時,殘留酶活力下降明顯,穩(wěn)定性降低,但最低剩余酶活力也在43%以上。表明TaMan5A有較強(qiáng)的pH穩(wěn)定性。

a-最適pH;b-pH穩(wěn)定性圖3 TaMan5A的最適pH 及pH穩(wěn)定性Fig.3 Optimal pH and pH stability of TaMan5A

2.3.2 最適溫度及其穩(wěn)定性

如圖4-a所示,在20～65 ℃時,隨著溫度升高,酶活力不斷提升,20 ℃下,酶活力達(dá)到56%,在65 ℃下,酶活力最高,70 ℃～80 ℃時,酶活力下降明顯,但80 ℃下仍有57%的剩余酶活力。從地衣芽孢桿菌KD-1中克隆出來的甘露聚糖酶的最適溫度為60 ℃,2種酶都具有嗜高溫屬性[18]。如圖4-b所示,該酶在20～60 ℃內(nèi)相對穩(wěn)定。高于60 ℃,相對酶活力略有下降,在80 ℃仍有75%的剩余酶活力。可知,TaMan5A具有耐高溫,溫度穩(wěn)定性強(qiáng)的特質(zhì)。

2.3.3 乙醇和NaCl濃度變化對TaMan5A的影響

如圖5-a所示,各乙醇濃度下的相對酶活力都略有下降,但最低也能夠達(dá)到90%。如圖5-b所示,50 g/L NaCl條件下,酶活力提升了8%,對酶活力起促進(jìn)作用。100、150 g/L NaCl條件下,相對酶活力都有所下降,對酶活力起抑制作用。但最低酶活力也能達(dá)到94%,表明TaMan5A對乙醇和NaCl有較好的耐受力。

a-最適溫度;b-溫度穩(wěn)定性圖4 TaMan5A的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.4 Optimal temperature and temperature stability of TaMan5A

a-乙醇體積分?jǐn)?shù);b-NaCl質(zhì)量濃度圖5 乙醇及NaCl濃度對TaManA的影響Fig.5 Effect of changes in ethanol and NaCl concentration on TaMan5A

2.3.4 金屬離子對TaMan5A的影響

如圖6-a所示,與對照相比,1 mmol/L的Co2+、脲使酶活力有所提升,Co2+使酶活力提高了18%,促進(jìn)效果最明顯。Cu2+使酶活力降低了30%,抑制效果最強(qiáng)。如圖6-b所示,5 mmol的SDS、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Co2+、Ni+均使酶活力有所提升,其中在Fe2+、Co2+使酶活力分別提升了17%和15%,促進(jìn)效果最明顯。Mg2+、脲、Pb2+條件下,相對酶活力只有49%、55%和68%,對酶活力抑制能力強(qiáng)。

2.4 優(yōu)化協(xié)同降解效率

2.4.1 單因素試驗(yàn)

OD540值反映了秸稈協(xié)同降解效果,OD540值越高,秸稈降解效率越高。由圖7-a所示,水解2 d,OD540值最高,是其最佳反應(yīng)時間。在最優(yōu)時間下,測定最適pH值(圖7-b),pH 4.0時OD540值最高,在pH=2.0或8.0時,秸稈幾乎不被降解。在已知的最優(yōu)條件下,測定玉米秸稈量對降解效果的影響 (圖7-c),0.5 g秸稈時OD540值最高,是最佳秸稈用量。最后,測定最適TaMan5A用量 (圖7-d),添加0.5 g TaMan5A時OD540值最高。在邵麗杰等[19]的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,pH 4.8,溫度51 ℃,水解56 h時有最高降解效率,與本實(shí)驗(yàn)最優(yōu)基礎(chǔ)條件相似。其最適半纖維素添加量為0.004 g/mL,本實(shí)驗(yàn)最佳添加量為0.05 g/mL,TaMan5A降解秸稈能力仍需優(yōu)化。

a-1 mmol/L金屬離子;b-5 mmol/L金屬離子圖6 1 mmol/L 及5 mmol/L金屬離子對TaMan5A的影響Fig.6 Effect of metal ions 1 mmol/L and 5 mmol/L on TaMan5A

a-時間;b-pH值;c-秸稈用量;d-TaMan5A用量圖7 時間、pH、秸稈用量及TaMan5A用量單因素試驗(yàn)Fig.7 Results of single-factor determinations with respect to degradation time, pH, corn stover amount, and TaMan5A amount

2.4.2 曲面優(yōu)化

通過最小二乘法回歸方程式分析得到時間、pH、秸稈用量、TaMan5A用量的二次多項(xiàng)回歸模型:OD=0.804 3+0.027 1A-0.030 7B+0.319 6C+0.191 8D-0.002 0AB-0.006 2AC-0.037 5AD-0.025 5BC-0.015 0BD+0.021 0CD-0.031 9A2-0.275 3B2-0.090 9C2-0.057 3D2,對該模型進(jìn)行方差分析,由表3可知,模型的P<0.01,說明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著;缺乏擬合項(xiàng)(P=0.303 6>0.05),決定系數(shù)R2=94.38%,該回歸方程的擬合度良好,模型成立。方程一次項(xiàng)中C、D(P<0.000 1)極其顯著,底物量、TaMan5A用量對秸稈降解效率有很大影響,根據(jù)F值大小可以判斷本實(shí)驗(yàn)所采用的4個因素對秸稈降解效率影響的主次順序?yàn)?(秸稈用量>TaMan5A用量>pH>時間),二次項(xiàng)B2極顯著 (P<0.01),pH的二次效應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中具有一定重要性。

由表3和圖8分析可得出時間、秸稈用量、TaMan5A用量,pH值的P值都大于0.01,交互都不顯著,表明因素間是獨(dú)立的。其中底物用量和TaMan5A用量的F值分別為115.96和41.78,P值都小于0.01, 在提高秸稈講解效率的過程中發(fā)揮著重要著作用。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

3 結(jié)論與討論

TaMan5A基因是從T.asperellumND-1中首次克隆出來,并在K.phaffii中成功表達(dá)的。其最適pH值和溫度分別是4.0、65 ℃,是一種耐酸、耐高溫的酶。且該酶對堿性條件也要一定的耐受力,在pH=7.0時,仍有48%酶活力,有較寬pH生長范圍。在1 mmol/L的情況下,Co2+、脲,能提高TaMan5A的酶活力。在5 mmol/L的情況下,SDS、Zn2+、Fe2+等多種金屬離子都對TaMan5A有激活作用。在秸稈降解過程中,秸稈用量和TaMan5A用量對降解效率影響最大。課題組從T.asperellum中克隆出來的TaMan5a,與李珊珊等[20]從黑曲霉克隆出來的甘露聚糖酶有很大的相似性,最適pH值同為4.0,耐酸。2種甘露聚糖酶同耐高溫,最適溫度都在65 ℃以上。研究以新選育的T.asperellumND-1為出發(fā)菌株,篩選出了TaMan5A,同時探討了其功能作用及高效表達(dá)模式,可為相關(guān)研究提供參考。

a-pH值與時間交互;b-TaMan5A用量與pH值交互; c- TaMan5A用量與時間交互;d-秸稈用量與時間交互; e-秸稈用量與pH值交互;f-秸稈用量與TaMan5A用量交互圖8 兩因素交叉作用對響應(yīng)值的影響Fig.8 Response surface diagram of the effect of the intersection of two factors on the response value