天然低共熔溶劑提取柑橘籽類(lèi)檸檬苦素的工藝優(yōu)化

王夜梅,李江南,尹會(huì)平,張耀海,蘇學(xué)素,焦必寧*

1(西南大學(xué)柑桔研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督 檢驗(yàn)測(cè)試中心,重慶,400712)2(西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,重慶,400715)

柑橘(CitrusreticulataBlanco.)為蕓香科柑橘屬植物,是全世界種植的最重要水果作物之一,每年全世界柑橘類(lèi)水果廢棄物的數(shù)量幾乎占新鮮水果的一半,對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[1]。柑橘富含類(lèi)黃酮、類(lèi)檸檬苦素、生物堿等生物活性物質(zhì),其中類(lèi)檸檬苦素是柑橘類(lèi)水果廢物(種子、果皮為主)的重要成分。檸檬苦素、諾米林和黃柏酮是柑橘類(lèi)檸檬苦素的3種主要苷元[2]。現(xiàn)代研究表明,檸檬苦素具有消炎、抗病毒、抗癌、抗氧化作用,諾米林和黃柏酮在癌癥和病毒的治療中也表現(xiàn)出重要作用[2-3]。

目前,檸檬苦素類(lèi)化合物主要采用液-固萃取[4-5]、超聲輔助萃取[6-7]和微波輔助萃取[8-9]進(jìn)行提取,在這個(gè)過(guò)程中會(huì)使用有機(jī)溶劑(例如甲醇、丙酮和二氯甲烷),這些試劑具有易揮發(fā)、易燃、有毒對(duì)環(huán)境和人體健康有害等缺點(diǎn)[10]。自ABBOTT等[11]發(fā)現(xiàn)季銨鹽和酰胺在低溫下能形成透明均勻的液體,首次提出了共晶溶劑的概念。作為綠色可持續(xù)溶劑,天然低共熔溶劑(natural deep eutectic solvents,NADESs)是在深共熔溶劑(deep eutectic solvents,DESs)之后出現(xiàn)的,氫鍵受體(hydrogen-bond acceptor, HBA)和氫鍵供體(hydrogen-bond donor, HBD)主要通過(guò)分子間氫鍵結(jié)合,通過(guò)調(diào)節(jié)HBAs與HBDs的類(lèi)型和摩爾比,可以獲得不同理化性質(zhì)的NADESs[12]。NADESs的熔點(diǎn)極低,具有綠色、無(wú)毒、生物降解性好等優(yōu)點(diǎn),克服了傳統(tǒng)有機(jī)溶劑易揮發(fā)、毒性大的缺點(diǎn)[13-14]。因此NADESs在天然成分提取中的應(yīng)用越來(lái)越多,例如提取酚類(lèi)[15]、黃酮類(lèi)[16]、生物堿[17]、多糖[18]和植物色素[19]等物質(zhì),其中以氯化膽堿為氫鍵受體的研究較多[20]。

本研究采用超聲輔助提取法提取柑橘籽中的檸檬苦素類(lèi)化合物,共制備了13種NADESs,篩選出最佳提取溶劑。采用響應(yīng)面法對(duì)液固比、含水量、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳提取工藝,旨在建立一種綠色環(huán)保的類(lèi)檸檬苦素的提取方法,為柑橘類(lèi)水果廢棄物的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

柑橘籽,實(shí)驗(yàn)室自制;檸檬苦素、諾米林和黃柏酮標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%),上海源葉生物科技有限公司;尼羅紅,上海麥克林生化科技有限公司;用于制備N(xiāo)ADESs的試劑包括氯化膽堿(ChCl,98%)、檸檬酸(Ca,≥99.5%)、DL-乳酸(La,85%～90%)、二氯乙酸(Bca,95%),上海麥克林生化科技有限公司;丙二酸、DL-酒石酸、蔗糖、葡萄糖為分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;乙二醇、丙三醇、脲素、甲酸、無(wú)水乙醇為分析純,重慶川東化工(集團(tuán))有限公司;1,2-丙二醇,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈(HPLC),上海星可高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q AdvantageA10超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore;NDJ-5S數(shù)字顯示黏度計(jì),中國(guó)LICHEN-BX有限公司;S230 Seven Compact電導(dǎo)率儀,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PHSJ-3F雷磁pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;cary50紫外分光光度計(jì),美國(guó)Agilent公司;SB5200D型超聲波清洗器,寧波新芝儀器公司;UPLC色譜儀(2996PDA檢測(cè)器),美國(guó)Waters公司;IECCL31R臺(tái)式冷凍離心機(jī),德國(guó)Thermo Fisher公司;SZCL智能型數(shù)字式恒溫加熱磁力攪拌器,鄭州科泰有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

收集實(shí)驗(yàn)室廢棄柑橘籽,洗凈后,45 ℃熱風(fēng)風(fēng)干,粉碎后過(guò)40目篩,然后加入4倍體積石油醚,常溫振蕩2次,每次10 h,除去石油醚后,放置通風(fēng)櫥揮發(fā)至無(wú)醚味,獲得脫脂柑橘種籽粉末,密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 天然低共熔溶劑的制備

根據(jù)摩爾比,將氫鍵受體與氫鍵供體混合,在60～80 ℃加熱攪拌制備13種不同的NADESs,詳見(jiàn)表1。

表1 NADESs 的組成Table 1 Composition of the NADESs

1.3.3 天然低共熔溶劑的理化性質(zhì)

1.3.3.1 極性測(cè)定

參照伏琳玥等[21]的方法,使用尼羅紅染料作為溶劑顯色探針,添加到NADESs中,在400～800 nm波長(zhǎng)下光譜掃描,記錄最大吸收波長(zhǎng),尼羅紅極性參數(shù)ENR計(jì)算見(jiàn)公式(1):

式中:ENR,尼羅紅極性參數(shù),kcal/mol;h,普朗克常數(shù);c,真空光速,m/s;NA,阿伏加德羅常數(shù);λmax,最大紫外吸收波長(zhǎng)。

1.3.3.2 黏度測(cè)定

黏度測(cè)試在室溫下使用數(shù)字黏度計(jì)進(jìn)行。所需的轉(zhuǎn)子為1#、2#、3#和4#,在6、12、30、60 r/min下測(cè)量,測(cè)量值和滿值之間的百分比值為15%～85%,確保精確度。

1.3.3.3 pH和電導(dǎo)率測(cè)定

使用pH計(jì)在室溫下檢測(cè)NADESs的pH。

電導(dǎo)率儀首先用0.000 56 mol/L KCl溶液在室溫下進(jìn)行校準(zhǔn),所有后續(xù)測(cè)試在室溫下進(jìn)行。

1.3.4 檸檬苦素類(lèi)化合物的提取

采用超聲波輔助提取法提取柑橘籽中的檸檬苦素類(lèi)化合物。具體操作方法如下:稱(chēng)取脫脂柑橘種籽粉末0.5 g,在離心管中加入5 mL NADESs(30%含水量,體積分?jǐn)?shù)),在50 ℃下超聲波提取30 min(功率200 W,頻率40 kHz)。提取后,將混合物以8 000 r/min離心8 min,在HPLC分析之前,用甲醇將上清液進(jìn)行稀釋定量,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

作為對(duì)照樣品,用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶劑按以上述操作方法提取檸檬苦素類(lèi)化合物。其得率按公式(2)計(jì)算:

式中:ρ,NADESs待測(cè)液中檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的質(zhì)量濃度,mg/mL;V,樣品體積,mL;N,稀釋倍數(shù);m,稱(chēng)取脫脂柑橘種籽粉末質(zhì)量,g。

1.3.5 類(lèi)檸檬苦素含量測(cè)定

參照孟鵬等[22]的超高效液相色譜方法并作適當(dāng)修改。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);洗脫程序:進(jìn)樣量3 μL;柱溫35 ℃;流速0.3 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水) =40∶60。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:檸檬苦素、諾米林和黃柏酮用純甲醇定容至10 mL,制得母液,然后稀釋為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L一系列混標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍Table 2 Standard curve and linear range of limonin, nomilin and phellodendron ketone

1.3.6 單因素試驗(yàn)

從1.3.4節(jié)提取結(jié)果中篩選出類(lèi)檸檬苦素得率最高的NADES組合,分別以選取的NADES摩爾比(2∶1、1∶1、1∶3、1∶4、1∶5)、含水量(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、液固比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL∶1g)]、提取時(shí)間(10、20、30、50、60 min)及提取溫度(20、30、40、50、60 ℃) 為變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.7 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則,同時(shí)結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取4個(gè)因素:(A)含水量、(B)液固比、(C)提取時(shí)間和(D)提取溫度,各取3個(gè)水平分別記為水平-1、0、1,進(jìn)行響應(yīng)曲面分析試驗(yàn),響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 3 Response surface experimental factors and level design

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均為重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”。數(shù)據(jù)采用Excel 2019、Design-Expert 10.0.7進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),使用Origin 2021進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 NADESs理化性質(zhì)

制備的13種NADESs在室溫下均為透明均勻的液體。NADESs的物理和化學(xué)性質(zhì)隨著HBDs和HBAs的類(lèi)型和摩爾比而變化。制備的NADESs的極性參數(shù)、黏度、電導(dǎo)率和pH如表4所示。物質(zhì)的溶解度和熔點(diǎn)受極性影響,采用尼羅紅極性參數(shù)ENR來(lái)確定NADESs的極性(電子版增強(qiáng)出版附圖1所示https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033762)。ENR值越小,NADESs的極性越強(qiáng),13種NADESs極性表現(xiàn)為有機(jī)酸基>胺基>糖基>醇基。NADESs黏度降低可以增加液-液傳質(zhì)作用,提高天然產(chǎn)物提取效率。在制備的13種NADESs中,除NADESs10外,醇基NADESs的黏度較小,蔗糖、檸檬酸作為氫鍵供體時(shí),NADESs黏度最大,可能是因?yàn)榇嬖诟鼜?qiáng)大的三維分子間氫鍵網(wǎng)絡(luò)。從電導(dǎo)率的角度來(lái)看,除NADES10外,醇基NADESs表現(xiàn)出更高的電導(dǎo)率,其中NADES6與NADES12雖然形成了無(wú)色均一的低共熔混合物,但黏度過(guò)大,在室溫下流動(dòng)性差,無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量電導(dǎo)率和pH。NADESs的pH 受氫鍵供體影響較大,由表看出,氯化膽堿-醇基、氯化膽堿-糖類(lèi)的NADESs體系為弱酸性到弱堿性,氯化膽堿-有機(jī)酸的NADESs為酸性,氯化膽堿-脲素的NADESs為堿性。

表4 十三種NADESs的極性參數(shù)、黏度、電導(dǎo)率和pHTable 4 Polarity parameters, viscosity, conductivity and pH of 13 NADESs

2.2 NADESs 提取柑橘籽檸檬苦素類(lèi)化合物的比較

制備了由HBA(氯化膽堿)和4類(lèi)HBDs(有機(jī)酸、多元醇、糖和胺)組成的13種不同的NADESs來(lái)提取柑橘籽的檸檬苦素類(lèi)化合物。提取參數(shù)設(shè)定為液固比10 mL/g,含水量30%,提取時(shí)間30 min,提取溫度50 ℃,超聲波功率200 W。檸檬苦素、諾米林和黃柏酮是柑橘籽中主要的檸檬苦素類(lèi)化合物,以其為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)果如圖1和電子版增強(qiáng)出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033762)。

圖1 不同NADESs對(duì)柑橘籽中檸檬苦素、 諾米林和黃柏酮的得率Fig.1 The yield of limonin, nomilin and phellodendron ketone in citrus seeds by different NADESs

NADESs的類(lèi)型對(duì)從柑橘籽中提取檸檬苦素類(lèi)化合物的效率有顯著影響。以有機(jī)酸為氫鍵供體的低黏度NADESs表現(xiàn)出較好的提取率,NADES10提取效率最高[檸檬苦素為(8.64±0.81) mg/g、諾米林為(3.77±0.17) mg/g、黃柏酮為(0.26±0.02) mg/g]。有機(jī)酸基NADESs可以更好地破壞和溶解細(xì)胞壁,這是提高提取率的原因之一[23],另一方面柑橘籽中類(lèi)檸檬苦素主要是檸檬苦素,其在酸性條件下容易發(fā)生閉環(huán)反應(yīng),較低的pH可以促進(jìn)檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶催化檸檬苦素A環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成檸檬苦素[24],從而提高類(lèi)檸檬苦素化合物的總量。NADES5和6雖然其pH值低,但其高黏度影響了傳質(zhì)效果,導(dǎo)致提取率較低。對(duì)醇基的 NADESs,羥基的增加使醇更容易與氯化膽堿形成分子內(nèi)氫鍵,導(dǎo)致黏度增加,提取率降低[12]。此外,為了評(píng)估NADES作為常規(guī)溶劑的可能替代品,與80%乙醇的提取效率進(jìn)行比較,結(jié)果顯示與傳統(tǒng)溶劑獲得的結(jié)果相當(dāng)。綜上所述,選擇氯化膽堿和甲酸制備的NADES作為提取檸檬苦素類(lèi)化合物的溶劑。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由于檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的提取趨勢(shì)一致,所以在優(yōu)化提取工藝時(shí),提取率以3種物質(zhì)的總和計(jì)算。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,3種成分的總含量在NADES11摩爾比為1∶4、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間30 min、含水量20%、液固比10∶1(mL∶g)時(shí)達(dá)到最高(圖2)。

a-摩爾比;b-含水量;c-液固比;d-提取時(shí)間;e-提取溫度圖2 摩爾比、含水量、液固比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)類(lèi)檸檬苦素總含量的影響Fig.2 Effects of molar ratio, water content, solid-liquid ratio, extraction time and extraction temperature on the total content of limonoids

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1 回歸方程模型與方差分析

根據(jù)2.3節(jié)結(jié)果分析,設(shè)定氯化膽堿與甲酸摩爾比為1∶4,選取含水量(A)、液固比(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)作為單因素,以檸檬苦素類(lèi)化合物得率為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)電子版增強(qiáng)出版附表2所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033762)。運(yùn)用Design expert 10.0.7數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到二次多項(xiàng)回歸方程如下:

Y得率=8.88-0.81A-1.12B-0.047C-0.32D+0.15AB-0.68AC-0.025AD+0.34BC+0.043BD+0.99CD+1.17A2+1.3B2-0.04C2+1.47D2。

得率模型回歸方差分析(ANOVA)的結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知該回歸模型極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.078>0.05),模型擬合程度好,表明可用該模型對(duì)得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。同時(shí)模型回歸系數(shù)R2=0.950 7,調(diào)節(jié)后的R2=0.901 4,表明模型與實(shí)際提取過(guò)程具有較高的擬合度,方程可靠性較高。

表5 得率模型及回歸系數(shù)的回歸分析結(jié)果Table 5 Regression analysis results of yield model and regression coefficient

通過(guò)分析方差數(shù)據(jù)可以看出,一次項(xiàng)含水量、液固比對(duì)得率具有極顯著影響(P<0.01),提取溫度對(duì)得率具有顯著影響(P<0.05),分析各因素的主效應(yīng)關(guān)系為:B>A>D>C,即液固比>含水量>提取溫度>提取時(shí)間。其二次項(xiàng)交互作用CD對(duì)得率具有極顯著的影響(P<0.01),AC對(duì)得率具有顯著的影響(P<0.05),AB、AD、BC、BD對(duì)得率的影響不顯著(P>0.05)。

2.4.2 響應(yīng)面分析及最佳工藝驗(yàn)證

利用Design Expert 10.0.7軟件得到響應(yīng)面圖,可以直觀分析各因素間的交互作用強(qiáng)弱。由圖3可知,A與C、C與D之間對(duì)類(lèi)檸檬苦素的提取均有顯著影響,且C與D之間相應(yīng)曲面傾斜度最高,說(shuō)明提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)類(lèi)檸檬苦素的得率有極顯著影響,含水量與提取時(shí)間的交互作用次之。響應(yīng)曲面陡峭程度為CD>AC>BC>AB>BD>AD,這與方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)回歸方程模型,得到預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為:含水量12.038%、液固比10.229∶1(mL∶g)、提取時(shí)間33.909 min、提取溫度59.852 ℃。本著成本節(jié)約及最大限度提取有效成分的原則,將該條件依據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況修正為含水量12%、液固比10∶1(mL∶g)、提取時(shí)間34 min、提取溫度60 ℃,在此最優(yōu)條件下經(jīng)3次平行試驗(yàn)實(shí)際得率為(13.87±0.28) mg/g,與預(yù)測(cè)值總得率為14.47 mg/g,在5%偏差范圍內(nèi)相差不大,證實(shí)了預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的良好相關(guān)性。

a-液固比-含水量;b-提取時(shí)間-含水量;c-提取溫度-含水量;d-提取時(shí)間-液固比;e-提取溫度-液固比;f-提取溫度-提取時(shí)間圖3 各因素對(duì)目標(biāo)成分總提取效率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface diagram of the influence of various factors on the total extraction efficiency of target components

3 結(jié)論

綜上所述,建立了一種基于天然低共熔溶劑的綠色有效提取方法,并成功應(yīng)用于柑橘籽中檸檬苦素類(lèi)化合物的提取。對(duì)NADESs的極性、黏度、pH和電導(dǎo)率理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,在制備的13種NADESs中,氯化膽堿-甲酸(摩爾比1∶4)對(duì)檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的提取效率最好。通過(guò)響應(yīng)面法確定最優(yōu)提取工藝為液固比10∶1(mL∶g)、含水量12% (體積分?jǐn)?shù))、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間34 min,在此條件下類(lèi)檸檬苦素提取率為13.87 mg/g。NADESs 顯示了其作為提取天然產(chǎn)物中生物活性物質(zhì)的溶劑的潛力,為柑橘水果廢棄物的開(kāi)發(fā)利用提供了新型環(huán)保的研究方法。