基于鐵蛋白納米籠構(gòu)建傳感元件及其在食品檢測(cè)中的研究進(jìn)展

韓雪兒,謝江,虎夢(mèng)吉,馬良,2,3,郭婷,2,3,張宇昊,2,3,尚永彪,2,3*,陳海,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(川渝共建特色食品重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400715) 3(發(fā)光分析和分子傳感教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400715)

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái),我國(guó)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展,人民生活水平不斷提高,人們對(duì)食品安全的意識(shí)也在不斷提升。黨的十九大報(bào)告明確提出要實(shí)施食品安全戰(zhàn)略,讓人民吃得安心,這對(duì)于食品行業(yè)的質(zhì)量監(jiān)控和安全檢測(cè)提出了更高的要求和期望。近十幾年來(lái),食品安全事故給人民群眾的生命和健康帶來(lái)了嚴(yán)重危害,通過(guò)行之有效的方法檢測(cè)食品中的有毒有害物質(zhì)具有重要意義。當(dāng)前,食品安全領(lǐng)域常用的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法[1]、氣相色譜法[2]、氣相色譜-質(zhì)譜法[3]和比色分析法[4]等,這些檢測(cè)方法的測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高且已具備成熟的系統(tǒng)理論支撐,但仍存在成本高、檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)不便利等缺點(diǎn)。近年來(lái),納米材料如分子印跡聚合物、金納米粒子、適配體、鐵蛋白納米顆粒等因具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和特性從而被廣泛應(yīng)用于新型傳感器的構(gòu)建,并展現(xiàn)出良好的靈敏度、分辨率和生物相容性,已逐漸成為檢測(cè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。

鐵蛋白(ferritin)作為一種天然的籠形蛋白納米顆粒,其天然的納米空腔結(jié)構(gòu)、良好的水溶性、穩(wěn)定性和生物相容性使其在構(gòu)建檢測(cè)傳感器方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。自1937年LAUFBRERGER[5]采用鎘鹽對(duì)鐵蛋白進(jìn)行提純以來(lái),科研工作者對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用進(jìn)行了廣泛且深入的研究。鐵蛋白是由24個(gè)亞基自組裝成分子質(zhì)量約為450～500 kDa的中空籠形結(jié)構(gòu)蛋白,內(nèi)、外直徑分別約為8 nm和12 nm,其內(nèi)部空腔可容納4 500個(gè)鐵原子,在體內(nèi)主要參與鐵代謝平衡[6]。值得注意的是,鐵蛋白獨(dú)特的納米尺度內(nèi)部空腔可以有效地裝載過(guò)渡金屬、熒光分子、納米顆粒等物質(zhì)[7],并且鐵蛋白的外殼還可以很容易地進(jìn)行化學(xué)或生物修飾從而引入特定功能基團(tuán)[8-10],因此,通過(guò)物理、化學(xué)或生物的方法可以賦予鐵蛋白獨(dú)特的功能特性,進(jìn)而用于傳感元件的構(gòu)建和有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)。比如,AKANDA等[11]使用Ru(NH3)63+作為OSR-親氧氧化還原介質(zhì),H2O2作為ISR-親氧氧化劑,在玻碳(glassy carbon,GC)電極上構(gòu)建了由鐵蛋白介導(dǎo)的氧化還原循環(huán)免疫傳感器,通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),此方法對(duì)于食源性大腸桿菌抗原表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測(cè)性能。目前,越來(lái)越多的研究表明,對(duì)鐵蛋白進(jìn)行修飾來(lái)構(gòu)建傳感器從而應(yīng)用于檢測(cè)食品中的有害物質(zhì)已展現(xiàn)出良好的測(cè)試效果。

本文首先對(duì)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹,總結(jié)了鐵蛋白制備傳感器元件的常用策略,并重點(diǎn)綜述了鐵蛋白納米顆粒在食品有毒有害物質(zhì)檢測(cè)方面的應(yīng)用,以期為構(gòu)建靈敏度好、分辨率高、攜帶方便和生物相容性好的食品檢測(cè)傳感器研究提供新的視角。

1 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

1.1 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)

天然的鐵蛋白主要包含鐵核和蛋白質(zhì)外殼兩部分。鐵蛋白外殼通常稱為鐵蛋白或脫鐵鐵蛋白,其結(jié)構(gòu)是由24個(gè)亞基自組裝而成的中空籠形結(jié)構(gòu),內(nèi)部鐵核是由氫氧化鐵和磷酸鹽組成的非均勻的無(wú)機(jī)鐵顆粒結(jié)構(gòu),一般情況下,鐵核結(jié)構(gòu)中含有2 500個(gè)以上的三價(jià)鐵離子[12]。對(duì)于鐵蛋白外殼而言,其結(jié)構(gòu)在動(dòng)物、植物和微生物中高度保守,通常是由24個(gè)相同或者相似的蛋白質(zhì)亞基以F432對(duì)稱的方式自組裝而成,內(nèi)外徑分別約為8 nm和12 nm[13]。由于其高度的對(duì)稱性,鐵蛋白分子包含3個(gè)C4旋轉(zhuǎn)軸,4個(gè)C3旋轉(zhuǎn)軸和6個(gè)C2旋轉(zhuǎn)軸,并形成了6個(gè)四重軸通道,8個(gè)三重軸通道,這些通道的直徑介于0.3～0.5 nm(如圖1所示)。并且,它們是離子或者分子進(jìn)出鐵蛋白內(nèi)部空腔的重要路徑,在合成無(wú)機(jī)納米顆粒以及裝載小分子等方面發(fā)揮著重要作用。鐵蛋白每個(gè)亞基的外形呈圓柱體,主要由α螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成,包含A、B、C和D長(zhǎng)螺旋結(jié)構(gòu)和C末端一個(gè)較短E螺旋結(jié)構(gòu),B螺旋和C螺旋之間由一段被稱為BC-loop的氨基酸鏈連接,E螺旋位于C端并與α螺旋簇成60°夾角[14]。植物鐵蛋白的N端還包含一個(gè)EP肽段,位于鐵蛋白的外表面。最近的研究表明,該EP肽段是植物鐵蛋白具有高熱穩(wěn)定(Tm,108 ℃)的重要原因。

a-鐵蛋白的四重軸通道;b-鐵蛋白的三重軸通道; c-鐵蛋白的二重軸通道圖1 鐵蛋白的三種通道結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Diagram of the three channels of ferritin

1.2 鐵蛋白的理化性質(zhì)

鐵蛋白在自然界中分布十分廣泛,不同來(lái)源的鐵蛋白均具有較好的水溶性,而且,動(dòng)物鐵蛋白的水溶性普遍優(yōu)于植物鐵蛋白。另外,大多數(shù)鐵蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性,可耐受80 ℃加熱30 min而不發(fā)生結(jié)構(gòu)變性。其中,日本對(duì)蝦來(lái)源的鐵蛋白熱變性溫度高達(dá)100 ℃,植物鐵蛋白H2亞基的變性溫度高達(dá)106 ℃。不僅如此,鐵蛋白對(duì)尿素、鹽酸胍等變性劑也具有良好的耐受性[15-16]。此外,鐵蛋白還具有pH值響應(yīng)的可逆組裝性質(zhì),即在pH≤2.0或pH≥11.0的條件下,鐵蛋白納米籠能解離成單亞基狀態(tài),當(dāng)溶液pH恢復(fù)至中性時(shí),解離的亞基又自發(fā)地重新組裝,形成中空球狀結(jié)構(gòu)[17]。對(duì)于鐵蛋白的籠形結(jié)構(gòu),其包含了3個(gè)典型的界面,即內(nèi)表面、外表面和亞基間界面,這3個(gè)界面的化學(xué)性質(zhì)不盡相同,但可通過(guò)化學(xué)或生物的方式進(jìn)行修飾從而實(shí)現(xiàn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控[18]。

2 基于鐵蛋白傳感器的構(gòu)建策略

鐵蛋白作為一種天然的生物大分子蛋白質(zhì),通常情況下并不具備光、電、磁等可用于檢測(cè)信號(hào)傳導(dǎo)的物理化學(xué)性質(zhì),但是其獨(dú)特的納米籠形結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,為構(gòu)建具有光、電等特殊理化性質(zhì)的鐵蛋白復(fù)合納米顆粒提供了便利。目前,利用鐵蛋白構(gòu)建傳感元件主要有兩種途徑[19]:(1)模板合成法;(2)表面修飾法。

2.1 模板合成法

鐵蛋白通過(guò)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化、成核等步驟將鐵離子以鐵核的形式儲(chǔ)存在內(nèi)部空腔,從而調(diào)節(jié)體內(nèi)的鐵代謝平衡。20世紀(jì)90年代,科研工作者利用生物礦化的思路在馬脾鐵蛋白腔內(nèi)合成了氧化鐵納米顆粒,隨后又合成了50多種金屬納米顆粒,如Fe3O4[20],Gd2O3[21]、Co3O4[22]、CdS[23]等,這使得鐵蛋白納米籠已經(jīng)成為一種優(yōu)良的生物模板可以用來(lái)合成各種各樣的納米材料,并用于檢測(cè)領(lǐng)域。目前,利用鐵蛋白合成無(wú)機(jī)納米顆粒的方法主要分為以下兩類:

(1)共沉淀法,即兩種不同的物質(zhì)在鐵蛋白腔內(nèi)發(fā)生特異性吸附、靜電作用或化學(xué)反應(yīng)等從而形成納米顆粒(如圖2-a所示)。XING等[24]利用乙二胺四乙酸介導(dǎo)Cd2+和Se2-進(jìn)入脫鐵蛋白,通過(guò)這種方法得到的CdSe量子點(diǎn)的水溶性大大提高,潛在的細(xì)胞毒性得到有效預(yù)防。與此類似,LI等[25]將水性Na2CO3/氣態(tài)CO2添加到由脫鐵蛋白、聚甲基丙烯酸(polymethacrylic acid,PMAA)和CaCl2組成的混合物中,TEM圖像證實(shí),PMAA抑制了CaCO3在混合物溶液中形成,而充分在鐵蛋白內(nèi)成核。這種策略為以鐵蛋白為模板調(diào)控?zé)o機(jī)納米材料的尺寸和范圍具有普遍意義。LIU等[26-27]在pH 2.0的磷酸鹽緩沖液中解離脫鐵鐵蛋白,繼而引入金屬離子并提高環(huán)境的pH值(pH≥5),使解離的亞基重組恢復(fù)成籠狀結(jié)構(gòu)。因此,捕獲的金屬離子和H2PO4-在其內(nèi)表面形成金屬磷酸鹽沉淀。通過(guò)以上方法制得的金屬(鎘和鉛)磷酸鹽鐵蛋白可作為傳感元件,采用生物素標(biāo)記后可用于檢測(cè)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α),檢測(cè)限約為2 pg/mL。

a-共沉淀法;b-氧化還原法圖2 基于鐵蛋白納米籠合成納米顆粒示意圖Fig.2 The schematical illustration of inorganic nanoparticle synthesis by using ferritin nanocages

(2)氧化還原法,即利用氧化或者還原反應(yīng)將游離的金屬離子或金屬氧化物轉(zhuǎn)化成金屬納米顆粒,從而形成尺度均一的納米顆粒[28](如圖2-b所示)。KLEM等[29]用氙弧燈照射高氧化態(tài)金屬檸檬酸鹽,在氧氣存在的條件下,金屬離子在鐵蛋白空腔中發(fā)生氧化反應(yīng),這種利用光化學(xué)還原技術(shù)和鐵蛋白的納米空腔結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì),成功合成了納米尺度的Eu、Ti和Fe羥基氧化納米顆粒,并且礦化后鐵蛋白的性質(zhì)仍然完好。另外,鐵蛋白是一種天然的鐵氧化酶,可以催化Fe2+在鐵氧化中心被O2或H2O2快速氧化為Fe3+,然后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到中心空腔形成具有模擬酶活性的鐵納米核,此納米核可以在H2O2存在的情況下催化許多底物的氧化[30]。TANG等[31]發(fā)現(xiàn)合成的脫鐵蛋白-金納米簇(Au-Ft)具有過(guò)氧化物酶活性,將其與葡萄糖氧化酶結(jié)合,通過(guò)聯(lián)用3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)建立了一種檢測(cè)葡萄糖的比色傳感器。JIANG等[32]將氯化血紅素封裝到鐵蛋白(Ftn)的空腔中,構(gòu)建了一種具有模擬納米酶性質(zhì)的復(fù)合物(hemin@Ftn),與HRP相似,hemin@Ftn在H2O2存在下可有效催化TMB氧化,分別生成藍(lán)色和棕色產(chǎn)物,可用作比色傳感元件。

2.2 表面修飾法

鐵蛋白的表面修飾即在鐵蛋白表面多肽鏈上引入某些分子,就可以在保持其主要生物功能的同時(shí),賦予其傳感的能力。自20世紀(jì)70年代科研工作者就已經(jīng)開(kāi)始對(duì)鐵蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾。例如,KISHIDA等[33]將鐵蛋白標(biāo)記在抗體上并與抗原相互結(jié)合,從而可以對(duì)抗原抗體結(jié)合的部位進(jìn)行特異檢測(cè)。而且,隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展,基于生物修飾途徑改造鐵蛋白納米籠也逐步拉開(kāi)序幕。例如KRAMER等[34]在鐵蛋白L亞基C端插入一段功能肽段,報(bào)道了一種基于鐵蛋白將銀離子轉(zhuǎn)換成金屬銀的方法,據(jù)此得到的銀納米顆粒可用于檢測(cè)領(lǐng)域。本文將對(duì)鐵蛋白的化學(xué)修飾和生物修飾應(yīng)用于傳感器的制備進(jìn)行介紹[35]。

(1)化學(xué)修飾,鐵蛋白納米籠的外表面含有豐富的氨基、羥基和羧基等,因此將生物分子,如染料分子、抗體片段、DNA、蛋白質(zhì)等功能性小分子與鐵蛋白上活性基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)(如圖3所示),從而賦予鐵蛋白獨(dú)特的功能特性[36-37]。TERASHIMA等[38]在重鏈鐵蛋白(H-Fn)納米籠外表面共價(jià)連接上熒光染料(Cy5.5),制備了一種用于血管巨噬細(xì)胞成像的籠狀蛋白(HFn-Cy5.5),通過(guò)觀察其熒光信號(hào)強(qiáng)度,可用于體內(nèi)血管炎癥的無(wú)創(chuàng)成像。2013年,ZHAO等[39]通過(guò)將磁性納米顆粒與核酸適體1(Apt1)偶聯(lián),核酸適體2(Apt2)和被標(biāo)記的脫鐵蛋白相融合,依據(jù)親和作用制成了一種三明治式復(fù)合物(Apt1/凝血酶/Apt2-脫鐵蛋白NPs-HRP)。應(yīng)用差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)監(jiān)測(cè)電極響應(yīng),發(fā)現(xiàn)此復(fù)合物可以在0.5～100 pM對(duì)凝血酶濃度產(chǎn)生線性電流響應(yīng),檢測(cè)限低至0.07 pmol/L(S/N=3)。FERNNDEZ 等[40]在pH 2.0 的條件下將分別連有供體熒光分子(AF350)和受體熒光分子(AF430)的鐵蛋白解離后,在pH 7.4 條件下重組。當(dāng)同一鐵蛋白連接熒光供體和受體分子時(shí)可產(chǎn)生熒光共振,因此研發(fā)了一款通過(guò)調(diào)節(jié)兩種熒光分子的比例可產(chǎn)生不同光的鐵蛋白探針,此探針在生物標(biāo)記應(yīng)用中具有良好的潛力。通過(guò)以上化學(xué)修飾方法制備的復(fù)合物,具有粒徑均一、可靶向成像、有較大的比表面積和低免疫排斥等特點(diǎn),這些屬性為鐵蛋白在疾病檢測(cè)領(lǐng)域帶來(lái)了極大的優(yōu)勢(shì)。

(2)生物修飾,采用基因工程的方法,將特定的序列插入到鐵蛋白基因序列中,可得到兼具多種功能的鐵蛋白,再通過(guò)細(xì)菌表達(dá)出所需求的新型鐵蛋白,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鐵蛋白的精確修飾。目前科研工作者利用基因重組技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)鐵蛋白的許多部位進(jìn)行修飾。KANG等[41]在超嗜熱菌鐵蛋白(Pf_Fn)亞基表面引入抗體的Fc結(jié)合肽段(FcBP),得到的融合表達(dá)產(chǎn)物(FcBP-ferritin)與兔抗葉酸受體抗體形成非共價(jià)復(fù)合物,由熒光成像得知這種復(fù)合體可以分別與乳腺癌細(xì)胞和葉酸受體過(guò)度表達(dá)細(xì)胞特異性結(jié)合,可作為分子成像探針。KIM等[42]通過(guò)將hFTN-H19的C端與增強(qiáng)型熒光蛋白[eGFP(或DsRed)]的N端結(jié)合,利用大腸桿菌作為細(xì)菌表達(dá)宿主,制備出重組熒光鐵蛋白納米粒子(FFNP),制備的FFNP具有放大熒光強(qiáng)度的顯著效果,并且穩(wěn)定性好,可用作生物分子檢測(cè)中的指示劑。

圖3 鐵蛋白的化學(xué)修飾法Fig.3 Chemical modification of ferritin

3 在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 重金屬離子

重金屬離子極難被生物所降解,從而會(huì)隨著食物鏈在人體內(nèi)富集,這不僅使內(nèi)臟器官發(fā)生病變,還會(huì)嚴(yán)重?fù)p害神經(jīng)系統(tǒng)[43]。目前,電感耦合等離子體質(zhì)譜法[44]、原子吸收光譜法[45]、原子熒光光譜[46]等常規(guī)方法可以精確測(cè)定重金屬含量,但因分析運(yùn)行成本高,操作繁瑣等缺點(diǎn)受到限制。研究表明,鐵蛋白具有鐵氧化沉淀的生物學(xué)特性,可以將外界Fe2+氧化為Fe3+并在內(nèi)部形成鐵礦核,同時(shí)其內(nèi)部的Fe3+也可以被還原成Fe2+并釋放到外界中,氧化還原的過(guò)程使鐵蛋白表現(xiàn)出傳遞電子的能力。張濤等[47]重組表達(dá)了泥蚶(Tegillarcagranosa)鐵蛋白,首先探究了其對(duì)Cd2+和Pb2+的富集能力,進(jìn)而將泥蚶鐵蛋白固定在羧基修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面,制備出可檢測(cè)Cd2+和Pb2+的生物傳感器。室溫下溶出伏安法測(cè)定的電化學(xué)信號(hào)表明,Cd2+和Pb2+在10～100 μg/L表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限均能達(dá)到10 μg/L。近幾年來(lái),由于熒光探針檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、選擇性好、應(yīng)用方便等優(yōu)勢(shì)逐漸受到了研究人員的關(guān)注[48]。WANG等[49]基于汞離子與GMTCAAC(MBP)肽段具有較強(qiáng)親和力的特點(diǎn),將特異性MBP肽段的氨基酸序列融合在鐵蛋白(HuHF)的N端,構(gòu)建了(MBP-HuHF)鐵蛋白突變體,并采用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記MBP-HuHF。在沒(méi)有Hg2+的情況下,淬滅劑氧化石墨烯的加入可以通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移很大程度上淬滅FITC的熒光。當(dāng)加入Hg2+后,Hg2+與MBP-HuHF突變體的特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化,使得熒光以劑量依賴的方式得到一定程度的恢復(fù),據(jù)此構(gòu)建了金屬Hg2+檢測(cè)生物傳感器。該傳感器對(duì)水中的汞離子表現(xiàn)出較高的選擇性和敏感性,Hg2+濃度檢測(cè)限為1.08 nmol/L。

3.2 真菌毒素

真菌毒素是真菌在一定條件下產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物,是食品原料及飼料的主要污染物之一。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)統(tǒng)計(jì),每年全球大約25%的糧油作物受到真菌毒素的污染[50]。并且真菌毒素對(duì)人體危害極大,即使低劑量攝入也可能導(dǎo)致人體肝臟、腎臟損傷,甚至死亡。

細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)是由鏈格孢霉產(chǎn)生的有毒含氮代謝產(chǎn)物,是毒性最高的鏈格孢霉毒素[51]。TeA廣泛存在于水果、谷物、蔬菜及農(nóng)作物中,給食品安全帶來(lái)極大隱患[52]。最近,WANG等[53]以TeA為目標(biāo)分析物,利用鐵蛋白納米籠成功構(gòu)建了一種增強(qiáng)型無(wú)毒免疫檢測(cè)方法。首先采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)評(píng)價(jià)方法從噬菌體展示庫(kù)中篩選出具有TeA“內(nèi)影像”的3種特異性β型抗獨(dú)特型納米體(β-AIds-Nbs),并選取對(duì)TeA具有最佳特異性識(shí)別的AId-Nb 2D作為無(wú)毒免疫檢測(cè)的抗獨(dú)特型納米體。在此基礎(chǔ)上,充分利用鐵蛋白納米籠的多聚體放大效應(yīng)、高表達(dá)產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn),將篩選獲得的AId-Nb 2D和熒光素酶(Nluc)基因融合到鐵蛋白的N端和C端,從而構(gòu)建了增強(qiáng)型生物發(fā)光酶免疫傳感器。采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析(icELISA)評(píng)估了鐵蛋白融合表達(dá)產(chǎn)物(2D-Nluc(F))的特異性結(jié)合活性,與未融合鐵蛋白的對(duì)照組(2D-Nluc)相比,2D-Nluc(F)表現(xiàn)出增強(qiáng)的反應(yīng)活性,IC50值為23.7 ng/mL,比2D-Nluc高2.9倍,該方法的檢測(cè)限(LOD)為0.7 ng/mL。此研究通過(guò)利用鐵蛋白的多聚效應(yīng)提高了免疫分析的靈敏度,建立了一種新型高效的無(wú)毒免疫分析方法,為食品中微量有毒污染物的檢測(cè)提供了一種新思路。

3.3 病毒

傳染性胰腺壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)是一種引起鱒魚、蛙魚等多種魚類患病的病毒病原體,能夠給魚類養(yǎng)殖行業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失,是各國(guó)進(jìn)出口魚的重要檢測(cè)對(duì)象。CHAVAN等[54]報(bào)道了一種針對(duì)魚類IPNV的即時(shí)檢測(cè)生物傳感器,該研究者通過(guò)基因融合技術(shù)在人源重鏈脫鐵蛋白(H-AFN)的C端連接了Protein G;同時(shí)在C端進(jìn)一步融合表達(dá)了His肽段,通過(guò)具有橋連作用的Ni-NTA將融合表達(dá)產(chǎn)物固定在金電極上。利用抗體抗原的結(jié)合特異性,并通過(guò)DPV和電化學(xué)阻抗譜進(jìn)行電化學(xué)分析,從而可以對(duì)魚樣本IPNV進(jìn)行快速定量化檢測(cè),檢測(cè)限為2.69 TCID50/mL。

高致病禽流感H5N1是一種禽類烈性傳染病,可以跨越種屬障礙感染人類,曾在亞洲、歐洲等多個(gè)國(guó)家流行并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[55]。目前,從非免疫合成文庫(kù)中獲取的納米抗體對(duì)其目標(biāo)抗原表現(xiàn)出較低的親和力;而且該類型納米抗體具有較短的血清半衰期,極大限制了在生物分析或治療中的應(yīng)用。近年來(lái)的研究表明,納米抗體的低聚化是提高其親和能力的有效途徑。最近,FAN等[56]將鐵蛋白C端的第五螺旋(即E螺旋結(jié)構(gòu))替換為納米抗體,從而得到了一種新型納米抗體,命名為Fenobody。透射電子顯微鏡分析顯示Fenobody在鐵蛋白四重軸通道表面形成了4聚體納米抗體束,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)表明Fenobody能夠以最大限度地暴露抗原結(jié)合位點(diǎn),相比于單體狀態(tài)的納米抗體,Fenobody對(duì)H5N1病毒的親和力增加了約360倍,并且熱穩(wěn)定性極強(qiáng),采用FITC標(biāo)記 Fenobody和納米抗體,發(fā)現(xiàn)Fenobody在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)了近10倍,更為重要的是,ELISA雙抗體夾心法表明Fenobody比普通的納米抗體的敏感性高100倍。由此可見(jiàn),此研究對(duì)于養(yǎng)禽業(yè)和人類公共安全具有重要意義。

3.4 其他有毒有害物質(zhì)

H2O2具有高效殺菌、漂白與防腐的作用,被作為食品添加劑廣泛地用于食品加工中。相關(guān)研究表明過(guò)量H2O2進(jìn)入人體后可能會(huì)引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和損傷,導(dǎo)致人體遺傳物質(zhì)損傷、加快衰老、癌癥、神經(jīng)性退行疾病等問(wèn)題產(chǎn)生。利用電化學(xué)傳感器是高效、快速檢測(cè)H2O2的方法之一,RAFIPOUR等[57]以鐵蛋白納米籠模板在其內(nèi)部空腔合成鈷納米顆粒,并將其共價(jià)修飾在金電極表面,構(gòu)建出H2O2電化學(xué)傳感器。相比于裸金電極而言,鈷納米顆粒-鐵蛋白復(fù)合顆粒(CoNP-Fn)修飾后的電極表現(xiàn)出更好的電催化活性。該傳感器對(duì)H2O2的響應(yīng)在2.49×10-9～1.91×10-8mol/L具有良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為2.48×10-9mol/L。最近,TAMLEH等[58]將鈷納米顆粒-鐵蛋白復(fù)合顆粒(CoNP-Fn)共價(jià)連接在多壁碳納米管/殼聚糖(MWCNTS/CS)復(fù)合物修飾的玻璃碳電極表面,構(gòu)建了CoNP-Fn/MWCNTS/CS電化學(xué)傳感器,并通過(guò)DPV和循環(huán)伏安法評(píng)價(jià)了該傳感器的性能,結(jié)果表明CoNP-Fn/MWCNTS/CS電化學(xué)傳感器對(duì)H2O2檢測(cè)的檢測(cè)具有良好的線性響應(yīng),檢測(cè)限為1.29 nmol/L,具有較好的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性。除此之外,鐵蛋白內(nèi)部空腔還可以合成其他金屬納米顆粒,并用于構(gòu)建電化學(xué)傳感器。例如,WANG等[59]利用鐵蛋白納米籠模板合成優(yōu)勢(shì),在其內(nèi)部空腔合成了雙金屬Au-Ag納米顆粒(Au-Ag-Fn),將其修飾在石墨烯納米片(GN)上,從而構(gòu)建了可檢測(cè)H2O2的GN/Au-Ag-Fn生物傳感器。相比于單獨(dú)的GN/Au和GN/Ag,基于GN/Au-Ag-Fn構(gòu)建的生物傳感器對(duì)H2O2具有更高的電催化活性。

基于H2O2參與過(guò)氧化物酶的催化過(guò)程,因而可以通過(guò)ABTS、TMB等底物的顏色變化來(lái)測(cè)定H2O2的濃度。2007年,閻錫蘊(yùn)團(tuán)隊(duì)報(bào)道了鐵磁性納米顆粒具有辣根過(guò)氧化物酶相似的催化活性,并可以用于H2O2的檢測(cè)。隨后,該研究團(tuán)隊(duì)利用鐵蛋白納米籠合成了Fe3O4-鐵蛋白納米顆粒,并證實(shí)其具備良好的過(guò)氧化物酶活性。最近,WANG等[59]利用鐵蛋白自身的鐵氧化沉淀活性,外源制備了holoferritin,并證實(shí)holoferritin具有類似的過(guò)氧化物酶活性;而且,其過(guò)氧化物酶活性與鐵離子裝載量呈現(xiàn)正比關(guān)系,該研究進(jìn)一步利用TMB為底物實(shí)現(xiàn)了H2O2的快速檢測(cè),H2O2的檢測(cè)范圍為4.85×103～14.71×103nmol/L(如圖4所示)。除此之外,JIANG等[31]發(fā)現(xiàn)利用鐵蛋白納米籠合成的金納米簇-鐵蛋白復(fù)合顆粒也具有過(guò)氧化物酶催化活性,可以有效地催化H2O2氧化TMB,從而實(shí)現(xiàn)H2O2的檢測(cè)。

圖4 含鐵鐵蛋白的合成及其過(guò)氧化物活性Fig.4 Schematic illustration of the preparation of reconstituted ferrihydrite nanoparticles within ferritin cavity and its mimetic peroxidase activity

4 結(jié)論與討論

鐵蛋白具有獨(dú)特的納米籠形結(jié)構(gòu),而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。同時(shí),其天然的空腔結(jié)構(gòu)可以作為模板合成各種具有特殊理化性質(zhì)的無(wú)機(jī)納米顆粒,使其成為一種獨(dú)具優(yōu)勢(shì)的生物納米材料,并廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)傳感器的構(gòu)建和有害物質(zhì)成分分析檢測(cè)。本文系統(tǒng)介紹了利用鐵蛋白納米籠在傳感元件構(gòu)建中的常見(jiàn)策略,即模板合成法和表面修飾法。目前,利用鐵蛋白納米顆粒構(gòu)建的檢測(cè)傳感器可以用于食品毒素、重金屬離子、病毒、過(guò)氧化氫等有毒有害物質(zhì)的檢測(cè),并且在檢測(cè)信號(hào)放大、模擬酶催化活性、易于改造等方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

然而,盡管鐵蛋白納米籠在各種傳感元件構(gòu)建及各類污染物的檢測(cè)中都有報(bào)道,仍還面臨著一些問(wèn)題。這些問(wèn)題主要包括:(1)目前利用鐵蛋白制備傳感元件應(yīng)用于食品檢測(cè)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段且對(duì)于食品中有害物質(zhì)檢測(cè)不夠充分,如農(nóng)藥、獸藥殘留、致病菌檢測(cè)等仍有待研究者給予關(guān)注;(2)利用鐵蛋白構(gòu)建傳感元件的成本仍然較高,如何進(jìn)一步解決原料獲取、簡(jiǎn)化合成途徑仍然是未來(lái)迫切需要解決的問(wèn)題;(3)鐵蛋白的化學(xué)修飾雖具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),但存在一定程度的不確定性。另外,鐵蛋白的生物修飾可通過(guò)定向改造從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制,但對(duì)可行的修飾基團(tuán)仍然具有局限性。總之,食品安全是民生大計(jì),相信鐵蛋白納米顆粒會(huì)隨著研究水平和科技發(fā)展的進(jìn)步,未來(lái)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮出更大的潛能。