艾葉/茶葉水提物促進(jìn)皮膚感染模型大鼠創(chuàng)面愈合的協(xié)同作用及機(jī)制研究

梅瀚文,王笑笑,宗婷婷,蘇 航,歐夢喜,王一君,吳生兵

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽醫(yī)科大學(xué),安徽 合肥 230032;3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),安徽 合肥 230036;4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所,安徽 合肥 230012)

皮膚感染是指在正常皮膚屏障功能受損或免疫功能低下的情況下,病原菌侵犯皮膚組織引起的炎癥性疾病,臨床表現(xiàn)以紅、腫、熱、痛及皮膚病理改變?yōu)橹鱗1-2]。皮膚感染傷口愈合機(jī)制復(fù)雜,輕者幾天內(nèi)可以痊愈,重者則纏綿難愈,令患者痛苦不堪,甚至?xí)?dǎo)致全身敗血癥、膿毒血癥,危及患者生命[3-4]。皮膚感染臨床上常用抗生素治療,但近年來病原微生物的不斷變遷以及層出不窮的耐藥菌株加大了皮膚感染的治療難度,而且長期使用抗生素會產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)[5-6]。從天然中藥中提取藥用成分,能夠避免耐藥性、不良反應(yīng)等弊端,但單用時往往療效并不顯著[7-8]。諸多研究表明,茶葉、艾葉均有抗菌抗炎、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等功效,可以用于治療皮膚感染[9-11]。兩者能否發(fā)揮協(xié)同作用增強(qiáng)抗菌抗炎的療效,是一個值得探討的問題。本實驗嘗試將艾葉水提物與茶葉水提物以不同比例混合,探討兩者對皮膚感染模型大鼠的協(xié)同治療作用及其可能機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物 70只清潔級SD健康雄性大鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)飼養(yǎng)中心[生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)2019-0003]提供,每只大鼠體質(zhì)量(200±20)g。在室溫環(huán)境下用康為IR60獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,每日定時定量給予大鼠飼料和飲用水,保證籠內(nèi)溫度(22±1)℃,相對濕度55%～60%,1周后大鼠體質(zhì)量(220±20)g。

1.2 主要試藥及儀器 BCA蛋白定量試劑盒:上海賽默飛生物科技有限公司;黑色素瘤缺乏因子(absent in melanoma 2, AIM2)抗體:美國英杰生命技術(shù)有限公司;含有CARD的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)抗體:上海鈺博生物科技有限公司;Caspase-1:美國CST公司;β-actin:艾博抗上海貿(mào)易有限公司;羊抗兔辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記二抗:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、上海江萊實業(yè)股份有限公司;白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、IL-18酶聯(lián)免疫檢測試劑盒:上海江萊實業(yè)股份有限公司;艾葉:南陽市欣研艾草生產(chǎn)有限公司;茶葉:安徽黃大特茶健康產(chǎn)業(yè)有限公司;氣體麻醉機(jī)、異氟烷:深圳市瑞沃德生命科技有限公司;5424R低溫高速離心機(jī):艾本德上海國際貿(mào)易有限公司;莫匹羅星軟膏:湖北人福成田藥業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制與分組 參照文獻(xiàn)[12]復(fù)制皮膚感染大鼠模型:用2%異氟烷對大鼠進(jìn)行吸入麻醉,褪去大鼠背部毛發(fā),用生理鹽水清洗,干燥后無菌操作。用手術(shù)剪剪成直徑約1 cm的圓形皮膚全層切口,深達(dá)皮下,以滲血但無明顯出血為度。用棉簽擦拭傷口部位,隨后在每個切口內(nèi)注入5×108CFU/mL金黃色葡萄球菌0.2 mL,每天1次,連續(xù)3 d。隨后用無菌敷貼封閉傷口處,使皮膚創(chuàng)口與菌液充分接觸。模型復(fù)制后48 h切口周圍出現(xiàn)紅腫,可見黃色膿性分泌物,即表明皮膚感染模型制備成功。模型復(fù)制成功后將大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)。實驗分為兩個部分。第一部分:皮膚感染大鼠模型復(fù)制成功后,隨機(jī)分為模型組、西藥組、艾葉水提物組、茶葉水提物組、2∶1組(艾葉水提物與茶葉水提物質(zhì)量比為2∶1)、1∶1組(艾葉水提物與茶葉水提物質(zhì)量比為1∶1)和1∶2組(艾葉水提物與茶葉水提物質(zhì)量比為1∶2),每組7只。第二部分:隨機(jī)選出7只SD大鼠作為正常組,其余14只進(jìn)行模型復(fù)制,將模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、2∶1組(艾葉水提物與茶葉水提物質(zhì)量比為2∶1),每組7只。

2.2 實驗藥材的制備 參考文獻(xiàn)[13-14],利用水蒸氣蒸餾法制備艾葉、茶葉水提物。單獨(dú)艾葉、茶葉水提物制備:分別稱取艾葉或茶葉400 g,并加入8倍純化水,倒入長頸圓底燒瓶中,開始加熱,待水沸騰后,打開冷凝管中的流動水。開始收集提取物,萃取4 h后,將收集的提取物靜置,取上清液即水提物,分裝,分別置于4 ℃冰箱內(nèi),密封避光保存。不同比例艾葉/茶葉水提物制備:將艾葉、茶葉按相應(yīng)比例稱質(zhì)量,以同樣的方式加熱冷凝收集提取物,后取上清液分裝,置于4 ℃冰箱內(nèi)密封避光保存。

2.3 給藥方法 模型組:每天1次清創(chuàng)處理,用生理鹽水擦拭傷口,共治療7 d。西藥組:每天1次清創(chuàng)處理,處理后在大鼠創(chuàng)口處涂抹莫匹羅星軟膏(3 mL/kg),共治療7 d。艾葉/茶葉水提物組:每天1次清創(chuàng)處理,處理后在大鼠創(chuàng)口處涂抹艾葉/茶葉水提物,共治療7 d。

2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.4.1 大鼠創(chuàng)面愈合情況 觀察各組大鼠治療7 d內(nèi)創(chuàng)面愈合情況和飲食變化。治療前先對各組大鼠稱質(zhì)量并測量創(chuàng)口面積,在治療3 d和7 d后,再次稱量大鼠體質(zhì)量并測量創(chuàng)口面積,拍照做記錄。

2.4.2 ELISA法檢測大鼠血清AIM2、ASC、Caspase-1及TNF-α、IL-1β、IL-18水平 大鼠治療結(jié)束后次日,對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。取腹主動脈血約4 mL于采血管中,置于4 ℃冰箱內(nèi)靜置待用。全部采血結(jié)束后,將采集的血液平衡放置到高速冷凍離心機(jī)中離心,設(shè)置時間為15 min、轉(zhuǎn)速為3 000 r/min、溫度為-4 ℃。離心結(jié)束后,用微量移液槍抽取采血管中1.5 mL淡黃色上清液,置于標(biāo)號的各組EP管中。參照試劑盒說明書用ELISA法分別檢測各組大鼠血清AIM2、ASC、Caspase-1及TNF-α、IL-1β、IL-18水平。

2.4.3 Western blot法檢測大鼠皮膚感染創(chuàng)面組織AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平 大鼠治療結(jié)束后次日,對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。在采血完成后,取1.5 cm×1.0 cm大鼠創(chuàng)面皮膚組織,放于各組EP管內(nèi),凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)待測。隨后分別從每個凍存組織中取100 mg。參照蛋白試劑盒說明書分別檢測AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平,結(jié)果以β-actin為內(nèi)參半定量進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 第一部分實驗結(jié)果

3.1.1 各組大鼠治療前后皮膚感染創(chuàng)面愈合情況比較 模型組創(chuàng)口收縮不明顯,創(chuàng)口內(nèi)仍有膿液,治療期間體質(zhì)量持續(xù)降低;西藥組、艾葉水提物組、茶葉水提物組、2∶1組(艾葉水提物與茶葉水提物質(zhì)量之比為2∶1)、1∶1組和1∶2組治療前3 d體質(zhì)量有所下降,3 d后飲食量增多,體質(zhì)量有所增長,創(chuàng)口收縮,創(chuàng)面面積明顯減小。其中西藥組和2∶1組創(chuàng)面愈合效果更明顯。見圖1。

3.1.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平比較 與模型組比較,西藥組、艾葉水提物組、茶葉水提物組、2∶1組、1∶1組和1∶2組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均顯著降低(P<0.05)。與西藥組比較,2∶1組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),IL-18水平顯著升高(P<0.05);艾葉水提物組、茶葉水提物組、1∶1組和1∶2組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注:A.模型組;B.西藥組;C.艾葉水提物組;D.茶葉水提物組;E.2∶1組;F.1∶1組;G.1∶2組;與模型組比較,*P<0.05;與西藥組比較,#P<0.05

3.2 第二部分實驗結(jié)果

3.2.1 各組大鼠創(chuàng)面組織AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較,模型組、2∶1組創(chuàng)面組織AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,2∶1組創(chuàng)面組織AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注:A.正常組;B.模型組;C.2∶1組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2.2 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較 與正常組比較,模型組、2∶1組大鼠血清IL-1β、IL-18水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,2∶1組大鼠血清IL-1β、IL-18水平均顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注:A.正常組;B.模型組;C.2∶1組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

皮膚感染屬中醫(yī)學(xué)“瘡瘍”范疇,其病因病機(jī)多為火熱邪毒侵入機(jī)體,導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降,氣血運(yùn)行不暢,經(jīng)脈閉阻,郁久化熱,熱盛肉腐積聚成膿[15-16]。艾葉作為灸法的材料,是治療外科瘡瘍的常用藥材,不僅能提高機(jī)體免疫力,還具有清熱解毒、祛濕止癢等功效,《本草綱目》記載艾葉可“生肌肉,拓金瘡”[17]。茶葉性苦寒,有化痰止咳、清熱解毒等功效。《新修本草》言茶葉“主瘺瘡”?；馃嶂扒秩胙?聚于局部,腐蝕血肉則發(fā)為瘡瘍癤腫[18-19]。因此,本研究發(fā)揮中醫(yī)特色,將兩者配伍應(yīng)用,通過藥性的相合與制約,選取最優(yōu)組合,達(dá)到整合調(diào)節(jié)作用。

第一部分實驗結(jié)果顯示,與模型組比較,西藥組、艾葉水提物組、茶葉水提物組和3個不同比例組均能促進(jìn)皮膚感染大鼠創(chuàng)面愈合,并能夠降低促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平(P<0.05)。其中以2∶1組和西藥組效果更明顯,兩組促炎因子TNF-α、IL-1β水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TNF-α、IL-1β、IL-18參與機(jī)體的炎癥調(diào)節(jié)和防御反應(yīng),對炎癥的蔓延和感染擴(kuò)散具有一定影響[20-22]。本實驗結(jié)果表明,艾葉水提物和茶葉水提物對促進(jìn)大鼠皮膚創(chuàng)面愈合,降低炎癥反應(yīng)存在協(xié)同作用,其中2∶1組為本次實驗最優(yōu)比例組。

有研究[23]發(fā)現(xiàn),AIM2是可以識別微生物或宿主來源的dsDNA的細(xì)胞質(zhì)傳感器,可以感應(yīng)到多種微生物病原體。在感染發(fā)生過程中,當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并通過細(xì)菌溶解釋放細(xì)菌DNA,AIM2能夠識別病毒或胞內(nèi)菌等病原微生物來源的DNA,募集接頭蛋白ASC和Caspase-1前體,裝配形成大分子復(fù)合物即AIM2炎癥體,介導(dǎo)細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的分泌和細(xì)胞焦亡[24-25]。此外,相關(guān)研究[26-27]發(fā)現(xiàn),茶葉和艾葉中有效成分可以通過不同途徑抑制AIM2炎癥小體的激活。第二部分實驗結(jié)果表明,模型組大鼠創(chuàng)面組織AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平和血清IL-1、IL-18水平明顯升高,經(jīng)涂抹最優(yōu)比例組藥物后,大鼠創(chuàng)面組織AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著下降,炎癥因子表達(dá)水平明顯減少,證明艾葉水提物和茶葉水提物可以發(fā)揮協(xié)同作用,抑制AIM2炎癥小體相關(guān)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述,艾葉和茶葉治療皮膚感染存在協(xié)同效應(yīng),艾葉水提物與茶葉水提物質(zhì)量比為2∶1是本次實驗的最優(yōu)比例,能夠產(chǎn)生最大療效。兩者可以產(chǎn)生協(xié)同作用,下調(diào)AIM2炎癥小體活化和細(xì)胞焦亡通路,減緩炎癥損傷,防止組織壞死。