強化鼠李糖合成途徑基因調控丁烯基多殺菌素合成的研究

摘要：目的 探究鼠李糖合成途徑基因強化對須糖多孢菌生長及丁烯基多殺菌素合成的影響及調控機制。方法 在Saccharopolyspora pogona ASAGF58中過表達鼠李糖合成途徑基因，并且在發酵培養基中添加不同濃度鼠李糖探究其對須糖多孢菌生長和次級代謝的影響。利用qRT-PCR對23個合成途徑基因以及菌株生長相關基因的轉錄水平進行比較，挖掘影響產量的關鍵基因。結果 通過過表達鼠李糖合成途徑基因，得到3株高產菌株Rha1、Rha2和Rha3，丁烯基多殺菌素產量分別提高1.82倍、2.12倍和2.54倍。結論 優化鼠李糖供應能促進丁烯基多殺菌素的合成，其中葡萄糖核苷轉移酶gtt和鼠李糖基轉移酶busG可能是影響丁烯基多殺菌素合成的關鍵基因。

關鍵詞：須糖多孢菌；丁烯基多殺菌素；鼠李糖基合成基因；工程菌構建；高產機制

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Research on gene regulation of the synthesis of butenyl-spinosyn by enhancing rhamnose synthetic pathways

Li Xinying1，2， Wang Jingnan1，2， Guo Chao1， Pang Jian3， Li Chun2，3， and Wang Chao1

（1 Academy of National Food and Strategic Reserves Administration， Beijing 100037; 2 Key Laboratory of Medical Molecule Science and Pharmaceutics Engineering， Ministry of Industry and Information Technology， Institute of Biochemical Engineering， School of Chemistry and Chemical Engineering， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081; 3 Institute of Biochemistry， Department of chemical engineering， Tsinghua University， Beijing 100084）

Abstract Objective This study explored the influence and mechanism of overexpression of rhamnose synthesis genes on the growth of Saccharopolyspora pogona and the synthesis of butenyl-spinosyn. Methods The influence of the rhamnose synthesis genes on growth and secondary metabolism was explored by overexpressing the rhamnose synthesis genes or culturing with various concentrations of rhamnose in S. pogona ASAGF58， A qRT-PCR analysis of 23 structure genes and the genes associated with cell growth was performed to identify the key genes that played an important role in yield. Results By overexpressing genes involved in the rhamnose synthesis pathway， three high-yielding strains Rha1， Rha2， and Rha3 were obtained， resulting in a 1.82 fold， 2.12 fold， and 2.54 fold increase in butenyl-spinosy production， respectively. Conclusion The titer of butenyl-spinosyn could be improved by optimizing the supply of rhamnose. And gtt and rhamnosyltransferases busG were inferred to be the key genes affecting the production.

Key words Saccharopolyspora pogona; Butenyl-spinosyn; Rhamnose synthesis gene; Construction of engineered strains; High-yield mechanism

丁烯基多殺菌素（butenyl-spinosyn）是由須糖多孢菌所產生的一類大環內酯類化合物，由大環內酯糖苷配基及兩側的糖基福樂糖胺基團和鼠李糖基團所組成（圖1），其與多殺霉素結構相似，但獨特的攝食和觸殺毒性可滅殺蘋果蠹蛾、煙青蟲、馬鈴薯甲蟲等多殺霉素難以防控的害蟲，是一種具有應用前景的綠色生物殺蟲劑[1]。

目前，須糖多孢菌合成丁烯基多殺菌素的能力極低，難以滿足工業生產的需求，亟需提高其產量。由于其遺傳代謝背景不清晰，當前多采用理化誘變及培養條件優化提升產量[2-6]，但這些方法工作量大、易回復突變，精準的基因工程手段有望改善這一問題[7-15]。丁烯基多殺菌素生物合成基因簇長達79 kb（鼠李糖合成基因位于簇外），包含23個基因，其中含有5個復雜的聚酮合酶[16]，酶的結構復雜、代謝途徑長、限速步驟不明等因素，阻礙了對須糖多孢菌的基因工程改造。

丁烯基多殺菌素需在大環糖苷配基的基礎上，連接鼠李糖基團和福樂糖胺基團后具有高效殺蟲活性[17]。因此，充足的NDP-L-鼠李糖和福樂糖胺基團供給對提高丁烯基多殺菌素產量至關重要。研究顯示，過表達NDP-L-鼠李糖合成基因能夠提高多殺霉素及丁烯基多殺菌素的產量。Madduri等[18]過表達了刺糖多孢菌的gtt和gdh，使得多殺霉素產量提高近3倍；陳代杰等[19]利用ermE*p啟動子在刺糖多孢菌中增加gtt和gdh的拷貝數，使多殺霉素產量提高3倍；夏立秋等[20]在須糖多孢菌NRRL 30144中過表達了gtt-gdh-epi-kre，使丁烯基多殺菌素產量提高2.7倍。由此可見，鼠李糖基團的合成基因gtt、gdh、epi和kre對于產物的合成至關重要。前期研究發現，鼠李糖合成基團的轉錄水平隨著發酵時間的延長呈現逐漸下降的趨勢。本研究通過對鼠李糖基團合成基因的不同強化組合來探究其對丁烯基多殺菌素合成的影響。

首先在課題組篩選得到的Saccharopolyspora pogona ASAGF58[17]發酵培養基中外源添加鼠李糖，探究鼠李糖對丁烯基多殺菌素合成的影響，然后在S. pogona ASAGF58中單獨或組合過表達鼠李糖合成基因（gtt、gdh、kre和epi），通過工程菌株生長代謝特性及基因轉錄水平的研究，確定影響丁烯基多殺菌素合成的關鍵基因，并探究工程菌株的高產機制，為后續基因工程改造提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

本研究用于構建須糖多孢菌基因工程菌株的相關質粒菌株見表1。

1.2 培養基及培養條件

大腸埃希菌培養基為LB培養基（tryptone 10 g/L，NaCl 10 g/L，yeast extract 5 g/L，瓊脂20 g/L）；須糖多孢菌的培養使用種子培養基及發酵培養基[21]，在30 ℃、200 r/min條件下培養7 d。

外源添加鼠李糖實驗組培養基中，在發酵培養基中加入60 g/L葡萄糖以及不同濃度（0.1、0.5、1、5、10和20 g/L）鼠李糖，115 ℃滅菌25 min。每組設置3個平行，HPLC測定丁烯基多殺菌素產量，通過Origin、SPSS軟件進行擬合、差異顯著性分析。

1.3 主要試劑

各抗生素購自Sigma公司，使用濃度分別為：安普霉素（apramvcin）50 μg/mL；卡那霉素（kanamycin） 50 μg/mL；氯霉素（chloramphenicol）25 μg/mL；萘啶酮酸（nalidixic acid）25 μg/mL。

PrimeSTAR DNA聚合酶購自Takara，質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Gibson mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司。本研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 構建工程菌株

構建單獨或組合過表達鼠李糖合成基因的質粒pSET159-gtt、pSET159-gtt-gdh、pSET159-gtt-gdh-kre-epi（圖2）。以課題組前期構建的位點特異性重組質粒pSET159-ermE*p為模板，使用159-F/permE-R引物擴增6 kb的片段為載體，以S. pogona ASAGF58基因組為模板擴增分別得到gtt/gdh/kre/epi基因，上述片段擴增引物含25 bp同源臂用于Gibson組裝，轉化到感受態細胞DH5α過夜培養。在強啟動子上游及目的基因下游設計驗證引物verif-F/attR2，驗證正確的菌落過夜培養提取質粒，轉化到ET12567/pUZ8002后作為供體菌株，通過接合轉移[22]方式轉化到須糖多孢菌基因組的attB上。在須糖多孢菌基因組attB位點上游設計引物attF5，在質粒attP位點下游設計引物attR-GC，成功整合的菌株可擴增出1.5 kb的片段，對驗證正確的接合子進行搖瓶發酵檢測丁烯基多殺菌素產量。相關引物見表2。

1.5 須糖多孢菌發酵參數檢測

1.5.1 丁烯基多殺菌素的提取與檢測

取2 mL混勻的發酵液至10 mL EP管內，加入6 mL甲醇混勻，超聲15 min，取上清液1 mL至新的1.5 mL EP管內，于12000 r/min離心10 min后過0.22 μm有機濾膜進行HPLC檢測。分析條件為：安捷倫反相C18柱；流動相為乙腈：甲醇：水=45：45：10（V/V/V），水中含0.05%乙酸銨；流速為1.0 mL/min；紫外檢測器檢測波長為244 nm。

1.5.2 pH值

梅特勒托利多儀器有限公司的FE20型pH計測定。

1.5.3 生物量

采用濕重法測定，用10 mL EP管，空管重量M1，裝8 mL種子液后管重為M2，于4000 r/min離心10 min，倒掉上清液后管重為M3。生物量（100%）=（M3-M1）/（M2-M1）×100%。

1.5.4 殘糖

山東省科學院生物研究所SBA-40E型生物傳感分析儀測定。

1.6 qRT-PCR

按時間取樣發酵液，采用TRIZOL提取總RNA（見thermo fisher官網），通過thermo fisher逆轉錄試劑盒獲得cDNA：使用Takara公司SYBR熒光定量試劑盒測定基因相對表達量。結果以Log2FoldChange形式顯示，相關引物見表3。

2 結果與分析

2.1 外源添加鼠李糖對丁烯基多殺菌素合成的影響

在須糖多孢菌發酵培養基中添加不同濃度的鼠李糖，探究鼠李糖內源合成是否充足（圖3）。結果表明，添加低濃度的鼠李糖（0.1 g/L）可以顯著促進須糖多孢菌合成丁烯基多殺菌素，其可能起誘導作用；添加中濃度的鼠李糖（5 g/L）同樣可顯著促進丁烯基多殺菌素的合成，其可能執行前體功能或被作為碳源利用[23]；添加20 g/L鼠李糖時丁烯基多殺菌素合成量明顯下降。以上結果表明，添加適量的鼠李糖（0.1～5 g/L）可顯著促進丁烯基多殺菌素的合成。因此，推測過表達鼠李糖合成基因，提高內源鼠李糖合成量也能提高丁烯基多殺菌素產量。

2.2 過表達鼠李糖合成基因對丁烯基多殺菌素合成的影響

將鼠李糖合成的4個基因進行不同組合gtt、gtt-gdh、gtt-gdh-kre-epi過表達后獲得陽性接合子：Rha1、Rha2和Rha3，對工程菌株進行發酵，結果如圖4所示。工程菌株Rha1、Rha2和Rha3搖瓶發酵產量分別是出發菌株S. pogona ASAGF58的1.82倍、2.12倍和2.54倍。以上結果表明，gtt的單獨過表達能夠顯著促進丁烯基多殺菌素的合成，gtt-gdh聯合過表達可進一步提升其產量。最后，通過將鼠李糖基團合成基因模塊化過表達使丁烯基多殺菌素的產量達到最大值。

2.3 外源添加鼠李糖對工程菌株發酵性能的影響

“2.1”結果表明，外源添加0.1～5 g/L鼠李糖均能夠提升丁烯基多殺菌素合成量，為了驗證工程菌株中鼠李糖的合成是否充足，在Rha1、Rha2和Rha3搖瓶發酵中分別添加0、0.1、1和5 g/L的鼠李糖（圖5）。

結果表明，在3個工程菌株發酵培養基中添加0.1 g/L的鼠李糖均優于兩個更高濃度的添加，使工程菌株Rha1、Rha2和Rha3中丁烯基多殺菌素的產量分別提高了1.95、1.94和2.78倍。這些結果表明，工程菌株中的鼠李糖內源合成量升高有利于丁烯基多殺菌素的合成，添加高濃度鼠李糖導致細胞對其耐受能力降低。此外，外源添加鼠李糖不能顯著的提升工程菌株丁烯基多殺菌素合成量，表明鼠李糖內源供給充足。

2.4 工程菌株生長代謝特性

為了探究Rha1、Rha2和Rha3的高產機制，在發酵第0天、第3天、第5天和第7天取樣檢測其pH、生物量、殘糖和產量的變化（圖6）。相比于出發菌株S. pogona ASAGF58，工程菌株Rha1、Rha2和Rha3的pH在發酵期間呈現先上升后下降的趨勢。Rha1和Rha3的生物量在發酵初期快速上升，Rha2菌株生物量在發酵初期及中期緩慢增加，后期快速增加，較高的細胞積累促進丁烯基多殺菌素持續合成。3個菌株的葡萄糖總消耗量均高于出發菌株，葡萄糖快速利用促進了產物合成。其中，Rha3菌株在發酵前期消耗緩慢，發酵中后期加快。此外，Rha2和Rha3菌株相比于Rha1和野生型，在0～3 d開始積累丁烯基多殺菌素；在隨后的4～7 d，3株工程菌株合成丁烯基多殺菌素的速度快速上升。Rha3菌株中NDP-L-鼠李糖的合成途徑強化，促進了菌株生長和丁烯基多殺菌素的合成（圖6）。

2.5 工程菌株丁烯基多殺菌素合成途徑基因表達分析

為進一步探究工程菌株的高產機制，對菌株ASAGF58、Rha1、Rha2和Rha3中丁烯基多殺菌素合成途徑23個基因的轉錄水平進行比較（圖7）[24]。結果顯示，在Rha1菌株中，丁烯基多殺菌素合成途徑基因在發酵初期均上調，其中，福樂糖胺基團合成基因在發酵初期高表達，PKS基因在發酵中期高表達，busG和gtt在第三天的表達量分別是野生菌株的22.17倍和14.59倍。在Rha2菌株中，除busG和gtt外，丁烯基多殺菌素合成途徑其他基因在發酵第三天無顯著上調，而在第五天除busI外其他基因均上調到最高水平。在Rha3菌株中，第三天除busE、busG、kre及gtt外，其他基因未發生上調；而在第五天全部基因均上調，其中，busG和gtt的表達量較野生菌株提高了47.02倍和12.67倍。這些結果顯示，gtt和busG可能是丁烯基多殺菌素合成途徑的關鍵限速步驟。

2.6 工程菌株細胞生長基因表達水平分析

工程菌株丁烯基多殺菌素合成量提升與菌體大量積累密切相關，因此本研究對菌體生長相關基因（amfC基因參與氣生菌絲體的形成，bldD、whiA、ssgA和sigF等基因參與孢子形成[25]）的轉錄水平進行了測定（圖8）。

結果顯示，Rha2菌株中sigF在發酵第三天上調，ssgA和sigF在發酵第五天顯著上調，其余基因在各時期未上調，表明菌體生長狀況略差；Rha1菌株中whiA、ssgA和sigF在發酵第三天顯著上調，bldD和whiG在發酵第五天顯著上調；Rha3菌株中，whiA、ssgA和sigF在發酵第三天也顯著上調，孢子分化相關基因均在發酵第五天上調；Rha1和Rha3生長分化相關基因的轉錄水平的增加促進了菌體積累，從而大量合成丁烯基多殺菌素。

3 討論

本研究通過外源添加鼠李糖探究其對丁烯基多殺菌素的影響，結果顯示野生型須糖多孢菌的鼠李糖內源供給不足，阻礙了丁烯基多殺菌素的合成。因此，構建了3株過表達鼠李糖合成基因的工程菌株，其中，gtt和gtt-gdh過表達顯著提升了丁烯基多殺菌素合成量，gtt-gdh-kre-epi的聯合過表達能進一步提高丁烯基多殺菌素的合成量，這表明gtt是非常重要的調控靶點。

進一步探究了工程菌的高產機制，Rha3發酵前期葡萄糖消耗緩慢而中后期耗糖速度明顯加快，在獲得高生物量的同時，丁烯基多殺菌素的合成量為3株菌中最高。Rha1和Rha2發酵前期葡萄糖消耗較快而中后期耗糖速度變緩，丁烯基多殺菌素的合成量較出發菌株明顯提升。

從基因表達水平上來看，當鼠李糖合成途徑基因過表達后，為避免前體積累造成的代謝壓力，需改變細胞內的代謝流以維持細胞穩態，即提高丁烯基多殺菌素合成途徑相關基因的表達水平，增加對前體的消耗，進而促進了終產物的合成。Rha2菌株丁烯基多殺菌素合成基因在發酵第五天上調到較高水平，而Rha1菌株在發酵第三天上調到高水平，Rha3菌株除個別基因外，在發酵初期均下調，中期上調，3個菌株的高產機理各不相同。但是丁烯基多殺菌素合成基因表達水平結果均顯示gtt和busG發生了顯著的上調，說明其對于丁烯基多殺菌素的合成可能至關重要。

相關研究結果顯示，蛋白組和代謝組分析表明鼠李糖糖基供應不足，gtt-gdh-epi-kre和gtt-gdh的聯合過表達能提高刺糖多孢菌合成多殺菌素[19，20]，本研究采用外源添加鼠李糖的方式確定其供應不足，通過gtt單獨過表達可將丁烯基多殺菌素合成量提升至出發菌株的1.82倍，模塊化過表達gtt-gdh-kre-epi基因可進一步提升至2.54倍，表明gtt基因的調控起到決定性作用。此外，在多殺菌素的高產菌株中，鼠李糖轉移酶spnG基因表達量會在發酵后期表達減弱[26]。本研究表明，其同源蛋白busG也可能是重要的調控靶點。丁烯基多殺菌素合成途徑基因的調控對于產物產量提高至關重要，在探究限速步驟后可進行精細調控策略研究，協調各基因的表達水平并與細胞生長關聯，實現丁烯基多殺菌素的高效合成。

參 考 文 獻

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