肺熱普清散對低氧誘導斑馬魚運動損傷的保護作用及對Hif1α的影響

吳永昊 謝和兵 侯海榮 王榮春 陳錫強

摘要：探討藏藥復方肺熱普清散對低氧環境下斑馬魚模型的保護作用及其對低氧誘導因子1α（Hif1α）的影響。建立斑馬魚低氧運動損傷模型，分別檢測低氧條件下斑馬魚行為學和整體乳酸水平，以受精后72 h AB型斑馬魚幼魚為實驗對象，空白對照組采用正常溶氧100%（8.4 mg/L），低氧組采用純氮氣置換獲得溶氧50%（4.2 mg/L）培養水，50%低氧水加不同濃度肺熱普清散處理胚胎24 h。采用斑馬魚行為學分析儀記錄30 min游泳軌跡，使用Zeblab軟件導出30 min內運動距離和運動時間；分別對實驗后各組斑馬魚進行整體勻漿并測定組織乳酸含量和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）活力；利用蛋白印跡（western blot， WB）分析各組斑馬魚Hif1α的表達水平變化；使用免疫組織化學方法對各組魚尾鰭部Hif1α表達進行比較。結果表明，與低氧對照組比較，肺熱普清散 10～30 mg/L劑量組可顯著增加低氧誘導引起的運動距離和運動時間（p＜0.05），并且相對于低氧引起的乳酸升高（p＜0.001）， 10～30 mg/L組的乳酸含量明顯降低（p＜0.05）；同時LDH與低氧組活力比較，肺熱普清散30 mg/L組可顯著降低LDH活力（p＜0.05）；WB實驗結果顯示，與低氧組比較，肺熱普清散可抑制Hif1α表達（p＜0.05）；同時免疫組化結果顯示10 mg/L 肺熱普清散可減少Hif1α表達。由此肺熱普清散對急性斑馬魚低氧損傷模型引起的運動損傷有保護作用，其耐低氧機制與Hif1α表達有關。

關鍵詞：肺熱普清散；斑馬魚；低氧；運動損傷；低氧誘導因子1α

中圖分類號：R285.5?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1002-4026（2024）01-0032-07

Protective effect of Feirepuqing Powder on hypoxia-induced sports injury in zebrafish model by inhibiting Hif1α

Abstract∶This study aimed to investigate the protective effects of the Tibetan medicinal compound Feirepuqing Powder on a zebrafish model in a hypoxic environment and its effect on the hypoxia-inducible factor 1α （Hif1α）. Through establishing a zebrafish hypoxic injury model， behavioral and overall lactate changes under hypoxic conditions were investigated. Experiments were conducted using AB zebrafish larvae 72 h after fertilization. In the control group， 100% standard dissolved oxygen （8.4 mg/L） was used， while in the hypoxia group， pure nitrogen （N2） gas replacement was used to obtain 50% dissolved oxygen （4.2 mg/L） culture water， and the embryos were treated with 50% hypoxic water add different concentrations of Feirepuqing Powder for 24 h. The zebrafish behavioral analyzer was used to record the swimming trajectory for 30 min， and the Zeblab software was used to derive the movement distance and time during the 30 min. Following the experiment， all the zebrafish from both the groups were homogenized and the lactic acid and lactate dehydrogenase （LDH） content in their tissue were determined. The changes in the Hif1α expression level of the zebrafish in each group were analyzed via western blot （WB） analysis， and the expression of Hif1α in the caudal fin of each group of fish was compared using immunohistochemistry. The results revealed that compared with the hypoxic control group， 10 to 30 mg/L Feirepuqing Powder group significantly increased the hypoxia-induced exercise distance and exercise time （‘p<0.05）， and relative to the hypoxia-induced lactic acid increase （‘p<0.001）， the lactic acid content of the 30 mg/L Feirepuqing Powder group significantly reduced. When LDH activity was compared with that of the hypoxic group， LDH activity was significantly reduced in the 30 mg/L Feirepuqing Powder group （‘p<0.05）. The WB results revealed that when compared with the hypoxia group， Feirepuqing Powder inhibited the expression of Hif1α （‘p<0.05）. Finally， the immunohistochemical results showed that 10 mg/L of Feirepuqing Powder reduced the expression of Hif1α. The results of this study show that Feirepuqing Powder exhibits a protective effect on induced exercise injuries in an acute zebrafish hypoxic injury model and that its hypoxia-tolerance mechanism is related to the expression of Hif1α.

Key words∶Feirepuqing Powder; zebrafish; hypoxia; exercise injuries; hypoxia-inducible factor 1α

高原病又稱高山病，是在高海拔地區活動引發的主要以缺氧為主的一組疾病，病變涉及呼吸系統、神經系統和循環系統等。該類疾病具有廣泛性和突發性的特點，嚴重威脅人們的生命健康，因此針對急、慢性高原病的致病機理研究和藥物研發亟待開展。高原病的發生與低氧條件下糖代謝異常密切相關，始于糖酵解的啟動，此過程組織中會積累大量乳酸，除了會影響運動系統功能外，還會誘導產生多種活性氧（reactive oxygen species，ROS），過量的ROS損害機體細胞和功能，引起炎癥因子并促進其釋放，同時細胞內低氧誘導因子家族（hypoxia inducible factor，Hif）受到刺激開始表達[1-3]，其中Hif1α是低氧誘導損傷引起的低氧調控的關鍵因子[4-5]。斑馬魚模型是近年藥物篩選應用中常用的動物模型，基于遺傳學和器官發育的研究成果，該模型在藥物低氧的保護作用評價中也有獨特的優勢，利用低含氧的培養水可以復制魚缺氧反應，低氧刺激在行為學和分子機制方面都與哺乳動物類似，近年來借助斑馬魚低氧模型針對相關疾病機理和信號通路的研究已有報道[6-7]。

高原病屬于疑難病之一，對癥治療是目前的首選治療手段，針對高原病的特效藥物仍然處于空白，因而針對高原病的藥物研發是大健康的重要議題。藏藥是我國民族醫藥重要的組成部分，在臨床上有百年的應用歷史，在高原地區患者中得到廣泛認可，但針對藏藥復方的現代藥學系統性研究還遠遠不足，其作用機制和相關的藥效學研究尚處于起步階段。肺熱普清散是收錄于藏醫學《四部醫典》中的效驗方，在小兒難治性肺炎的治療中有較佳效果[8]。肺熱普清散具有經典藏藥組方特點，主藥包含多種芳香性中藥，其中紅花、檀香、丁香、降香、木香等為主要成分，共同發揮清肺泄熱的功效，較早的研究發現該復方具有較強的抗炎作用[9]。臨床報道證明其對高原地區的支氣管和肺部感染有明確療效[10]。現代研究發現該復方中多個成分具有抗ROS活性：紅花黃色素、檀香油、降香黃酮具有顯著的抗氧化應激和抗炎的活性[11-13]；而丁香的主要成分丁香酚不僅具有抗菌的作用，而且有較強抗氧化和抗炎的活性；木香的水提物研究發現可顯著恢復心肌乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，復方整體顯示出較強的抗氧化應激作用[14]。

本研究利用斑馬魚低氧損傷實驗模型，對肺熱普清散在低氧損害保護中的作用進行評價，并考察其對低氧誘導Hif1α的表達影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

肺熱普清散由西藏神猴藥業有限公司提供（國藥準字Z54020045， 批號20210601），取原藥粉末制成100 g/L母液，有微量沉淀，置于4 ℃保存，用前混勻。

鏈霉蛋白酶E（Pronase E，脫膜劑）和胚胎麻醉劑MS222購自北京索萊寶公司，Multiskan FC型酶標儀購自美國Thermo公司，Hif1α 一抗和GAPDH一抗購自美國CST公司，乳酸ELISA法試劑盒（D799851）和LDH測定試劑盒（BL853B）分別購自碧云天公司和賽國生物科技公司，超凈工作臺購自蘇州安泰凈化消毒設備廠， IX51倒置顯微鏡購自奧林巴斯（日本），DYY-6D電泳儀和DYZC-24C轉印電泳儀購自北京六一公司，LiCOR-odyssey 400化學成像儀購自美國Genetech 公司，Zebrabox斑馬魚行為分析儀購自法國Viewpoint公司，斑馬魚養殖飼養系統購自北京愛生科技公司。

1.2 實驗動物

本實驗所選斑馬魚野生型AB系由山東省科學院生物研究所藥物篩選平臺提供，培養方法按照《斑馬魚及相關實驗技術》操作[15]， 實驗所用為斑馬魚受精后72 h胚胎，受精24 h使用1.0 g/L Pronase E溶液脫去卵膜。在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚胚胎，移入24孔培養板中。動物實驗方案經山東省科學院生物研究所實驗動物福利倫理委員會審查，審查批件號為SDSW20220606。

1.3 藥物處理和行為學方法

挑選健康AB系斑馬魚幼魚，隨機分為6組，每組60條，分為常氧組、低氧組、低氧加肺熱普清散多劑量組。常氧組為非密閉容器處理（8.4 mg/L）；低氧組的低氧水用純氮氣通過管道持續輸入常規培養水中制得，使用溶氧儀監控水中氧含量達到50%（4.2 mg/L），低氧組將低氧水和幼魚置于密封瓶中；將肺熱普清散樣品（質量濃度分為1、3、10、30 mg/L等4組）與[JP2]斑馬魚幼魚置于密封瓶中，28 ℃處理24 h。行為學分析采用低氧水幼魚于24孔板中，每孔1條，放入斑馬魚行為學分析系統的暗箱中，使用Zeblab軟件分別采集30 min內各組幼魚的運動軌跡，利用軟件導出游行距離和時間進行統計處理。

1.4 斑馬魚整體乳酸和LDH測定方法

乳酸測定實驗方法按照報道的實驗方法進行[16]，將實驗后的幼魚，按照每組6個樣本，每個樣本取自10條幼魚，每個樣本麻醉后冰上進行勻漿，乳酸測定方法按照試劑盒要求按步驟進行，勻漿后收集上清液，依次制作標準曲線，利用酶標儀在570 nm條件下通過吸光度測定樣品乳酸濃度。LDH測定方法按照各組取得30 mg幼魚組織，冰上勻漿，8 000 r/min離心，取上清，按照測定試劑盒步驟操作，采用標準曲線計算LDH的活性。

1.5 蛋白印跡（western blot， WB）分析實驗

WB的實驗操作流程按照已報道方法進行[17]，簡略過程如下：實驗后每組30條斑馬魚幼魚麻醉后進行冰上勻漿，用冷組織裂解液提取蛋白，使用SDS-PAGE電泳技術進行蛋白質樣本分離，隨后濕法轉膜至NC膜，一級抗體（Hif1α）和二級抗體分別進行1：1 000和1：10 000的稀釋孵育，化學發光成像選用LiCOR-odyssey 400化學成像儀（美國基因公司）顯影，利用機帶軟件Image studio1.0進行灰度分析。

1.6 免疫組化實驗方法

實驗后斑馬魚胚胎用PBS清洗2次，麻醉后放置于冰上處死，加入4%多聚甲醛過夜，用常規PBST-乙醇梯度脫水，然后用冷丙酮處理20 min，清洗后加3%馬血清封閉2 h，更換封閉液，加入Hif1α一抗（1：200），置于4 ℃過夜，換為熒光二抗（Alexa Fluor@488）4 ℃過夜， 熒光顯微鏡下觀察拍照，利用Image J軟件將照片改為灰色背景。

1.7 統計學方法

應用SPSS 13.0對實驗所得數據進行組間ｔ檢驗， 多個樣本均值比較采用單因素方差（anova）分析，各組數據以均值 ‘x±s表示，p＜0.05為顯著性差異，p＜0.01為極顯著性差異。

2 結果

2.1 肺熱普清散對低氧斑馬魚模型行為學的影響

本實驗共6組，按照每組8條置于24孔板中，每孔1條，同時進行軌跡記錄見圖1。低氧處理后行為學的實驗結果顯示：30 min內常氧對照組的運動不受影響，運動距離和運動時間均值分別達到了13.08 cm和11.97 min；低氧組的運動距離和運動時間均顯著下降， 均值分別為2.14 cm和3.78 min，與常氧組比較具有顯著性差異（p＜0.001）；低劑量肺熱普清散組與低氧組比較無顯著性差異；30 mg/L 肺熱普清散組較低氧組運動時間有明顯增強，運動距離和運動時間均值分別達到了6.47 cm和7.86 min（p＜0.05）（表1）。

2.2 肺熱普清散對低氧誘導運動損傷后斑馬魚整體乳酸水平和LDH活性的影響

本實驗包含6個組，每組6個樣本，單一樣本取自10條幼魚。以受精后72 h的斑馬魚幼魚為實驗動物，常氧組乳酸均值為0.35 μmol/L，用低氧培養水造模處理后，可以造成斑馬魚幼魚活動減少，乳酸的濃度會顯著增高，達到0.89 μmol/L 左右，與常氧組比較具有顯著性差異（p＜0.001）；同時LDH活性也呈現同樣的升高變化，常氧組與低氧組比較具有顯著性差異（p＜0.005）。用藥組結果表明：處理24 h后，用藥組乳酸均值均有降低，與低氧組相比，經肺熱普清散10 mg/L和30 mg/L處理后，整體乳酸水平明顯下降且具有統計學意義（p＜0.05），具有劑量依賴性的傾向（數據見表2）。LDH活力的監測結果顯示高濃度肺熱普清散與低氧組比較具有顯著性差異（p＜0.05），如圖2所示。

2.3 肺熱普清散對斑馬魚Hif1α蛋白表達水平的影響

斑馬魚整體WB結果顯示，低氧處理后Hif1α蛋白水平與常氧對照組比較呈現增高現象，肺熱普清散低劑量組（1、3 mg/L）Hif1α未出現明顯變化，而高劑量組（10、30 mg/L）可有效降低Hif1α表達水平，其中10 mg/L組抑制Hif1α表達具有極顯著意義（p＜0.01），說明肺熱普清散對該模型的Hif1α表達水平有抑制作用（圖3）。

2.4 肺熱普清散對斑馬魚Hif1α免疫組化結果

免疫組化處理后的斑馬魚全身都有熒光點分布，本研究以魚尾部位作為觀察部位，對照組僅能見到少量白色熒光小點，而低氧處理后無論是軀干部位還是魚鰭白色熒光點明顯增加（圖4白色箭頭指示）；經過10 mg/L 肺熱普清散處理后的相同部位熒光點減少，表明經過肺熱普清散處理可減少低氧條件下的Hif1α表達水平（圖4）。

3 討論與結論

普通人在高原地區活動都會受到高原低氧的影響，運動能力下降是低氧環境下的機體反應，同時低氧因素和糖酵解過程共同作用產生的乳酸在肌肉組織中積累，加重了運動障礙。本研究中低氧組的斑馬魚普遍出現了運動距離和運動時間縮短的情況，提示其運動能力顯著性下降，同時伴隨組織乳酸水平和LDH活性的升高。基于本實驗中低氧誘導下斑馬魚行為學的典型變化，利用該模型運動能力（時間和距離）可量化的優勢，評價肺熱普清散的耐低氧能力，結果表明肺熱普清散不僅能夠提升低氧處理后的運動能力，同時對低氧引起的乳酸水平和LDH活性增加均有顯著性的逆轉作用，提示肺熱普清散對于低氧引起的運動損傷具有提高缺氧耐受的作用，對于急性低氧損害引起的運動障礙有明顯的改善作用。

低氧環境不僅引起機體血氧含量降低和糖代謝紊亂，以低氧-乳酸軸激活為特征的廣泛繼發反應更為有害，同時低氧參與到了包括腫瘤、感染、局部缺血和炎癥等多個疾病過程中[18-19]。Hif1α是感知低氧和維持細胞氧內環境平衡的核心調節因子，常氧時會與VHL（Von Hippel-Lindau）蛋白結合并降解，幾乎檢測不到[20]；低氧條件下其高表達，作為最重要低氧耐受的關鍵樞紐性因子，其會調控下游的多個靶基因的表達水平，同時伴行病理性變化[21-22]。研究表明低氧刺激斑馬魚模型的通路多個基因具有較高保守性，與哺乳動物的表型相近[4， 23-24]。在本研究中經過低氧聯合肺熱普清散處理后，Hif1α的表達水平顯著降低，說明減少Hif1α表達是肺熱普清散的耐缺氧調節的作用靶點之一，這種作用是直接作用還是間接影響尚需要深入的研究。動物細胞中對氧氣的感知和反應是能量代謝中的基礎細胞應激反應過程，低氧因子的升高并不是高原病的專屬現象，低氧相關因子也參與了包括癌癥、炎癥以及血細胞發生等過程[25]，本研究揭示肺熱普清散的低氧保護作用與抑制Hif1α的表達有關，并且可以推測該復方在癌癥和炎癥等疾病中可能的應用前景。

本研究首次對傳統藏藥名方肺熱普清散進行了實驗研究，提示其具有顯著的低氧運動損傷保護作用，并對相關的Hif1α具有顯著的抑制作用。同時對肺熱普清散的藥用機制進行了初步探索，也為該類復方二次開發積累了必需的藥理學數據。

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