磺胺甲惡唑與納米氧化鋅對污泥活性的影響

路云霞,李 超,錢唐健,卜現亭,王超越,*

(1.南京市生態環境保護科學研究院,江蘇南京 210013;2.河海大學環境學院,江蘇南京 210019)

抗生素作為一種常用抗菌藥被廣泛應用于生產與生活的各個方面,但作為一種新污染物,其潛在的危害與污染控制問題日益引起學者們的關注。抗生素廣泛存在于水環境中,其主要來源包括生活污水、醫藥廢水以及水產或畜牧養殖廢水等。抗生素對水環境體系會造成一定程度的污染,同時導致水中微生物耐藥基因的改變,我國作為抗生素生產與使用大國,抗生素及其抗性基因成為我國水環境中的優先檢出新污染物。

人工納米材料是環境中一類特殊的新污染物,可通過多種方式進入水環境體系,并對水生動植物與生態系統造成危害。一方面,納米材料的化學特性、環境行為及毒理效應由于其納米尺度而不同;另一方面,其他污染物可以將其作為載體,以此實現長距離遷移與生物富集,從而產生更大的環境風險。因此,人工納米材料與環境中其他污染物復合影響的研究成為目前環境領域的熱點。

目前,污水處理廠普遍以生物法為主體對污水進行處理,其中活性污泥法應用最為廣泛,利用硝化菌、反硝化菌以及聚磷菌等微生物去除有機污染物。抗生素與納米材料作為近年來出現的兩種新污染物,正引起巨大的環境風險和人類健康問題[1-3],且污水處理廠是抗生素與納米材料進入自然環境的重要途徑之一。研究表明,抗生素[4]與人工納米材料[5]均對污水處理過程中的重要功能微生物產生危害,從而影響污水處理系統整體效能,進而導致潛在的環境問題。因此,本文研究污水中抗生素與納米材料共存對活性污泥系統的影響,以期完善兩種新污染物在污水處理系統的遷移轉化規律,為降低新污染物的環境風險與促進污水處理系統穩定運行提供新的理論依據和技術支持。

當前國內外的研究主要面向單一抗生素或是單一納米材料[6],而在實際水體中,兩種污染物通常同時存在,因此,本研究將探究兩者新污染物共存時對污泥系統的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

本研究采用4組序批式反應器(SBR),按照缺氧/好氧(AO)方式運行。反應器的有效容積為3 L,排水比為66.7%,運行周期為6 h,使用時控開關進行控制,其中進水10 min、攪拌75 min、曝氣225 min、沉降30 min、排水10 min、閑置10 min。進水采用人工配制模擬生活污水,選取典型抗生素磺胺甲惡唑(SMZ)與應用廣泛的ZnO納米顆粒(NPs)作為研究對象。

4組SBR反應器進水分別為生活污水、生活污水+SMZ、生活污水+ZnO NPs、生活污水+SMZ+ZnO NPs,反應器依次記作R1、R2、R3、R4。即R1為空白組,進水不投加抗生素或納米材料,R2、R3、R4為試驗組,除進水不同外,其他條件保持相同。

4組反應器的氧氣供應采用日常養魚所用的圓柱形曝氣頭,利用空氣泵和轉子流量計分別提供和控制溶氧量,反應器好氧階段溶解氧(DO)質量濃度維持在2～3 mg/L,缺氧階段DO質量濃度在0.2～0.5 mg/L。反應器培養溫度為室溫,pH值控制為6.5～7.5,運行期間定期清洗反應器、進出水管以及進出水箱,減少生物膜生長產生的影響。

1.2 接種污泥與試驗水質

試驗采用南京某污水處理廠二沉池剩余污泥作為接種污泥,污泥經充分曝氣后過1.0 mm篩,使用蒸餾水清洗后接種到反應器中。4組SBR反應器內活性污泥的初始質量濃度均維持在4 000 mg/L左右。

試驗采用人工配水方式模擬生活污水,以乙酸鈉為碳源,NH4Cl和KH2PO4分別提供微生物生長所需氮源和磷源,同時添加氯化鈣、硫酸鎂等微生物生長所需元素。

1.3 兩種新污染物濃度選擇與儲備液配制

結合國內外相關研究[7-9],本研究中SMZ質量濃度選擇為50 μg/L,ZnO NPs質量濃度選擇為5 mg/L。試驗所用SMZ生產于Sigma-Aldrich有限公司,為白色粉末,在水中幾乎不溶。準確稱量10 mg SMZ粉末溶于甲醇,再用超純水定容至1 000 mL即得10 mg/L的SMZ儲備液,轉移至棕色瓶備用。試驗所用ZnO NPs生產于Sigma-Aldrich有限公司,為亮白色粉末。準確稱量100 mg ZnO NPs粉末置于1 000 mL超純水,超聲分散1 h(25 ℃,250 W,40 kHz)后即得100 mg/L的ZnO NPs懸浮液[10],粒徑為(50±10)nm,儲存備用;每次使用前超聲分散,并根據所需濃度進行稀釋使用。

1.4 常規指標檢測方法

試驗中的常規檢測指標與方法如表1所示,分析方法選取參照《水和廢水監測分析方法》第四版。

表1 水質指標分析方法

1.4.1 溶解性微生物產物(SMP)的提取與測定

反應器沉降時間段,取上清液過0.45 μm醋酸纖維素膜,即得SMP溶液。SMP中所含多糖采用蒽酮比色法測定,以葡萄糖作為標準;蛋白質和腐植酸采用改進Lowry法測定,分別以牛蛋白血清與腐植酸作為標準。SMP含量為多糖、蛋白質和腐植酸三者含量總和。

1.4.2 乳酸脫氫酶(LDH)的測定

LDH的測定釆用LDH細胞毒性檢測試劑盒(南京建成),測定方法參照說明書,具體操作步驟如表2所示。

表2 LDH檢測步驟

1.4.3 三磷酸腺苷(ATP)的測定

采用ATP含量試劑盒測定(南京建成)活性污泥中的ATP含量。取1 mL活性污泥混合液離心5 min(12 000 r/min),去上清液后加入200 μL裂解液裂解細胞;裂解后離心5 min(12 000 r/min),取100 μL上清液于含有100 μL ATP檢測工作液的96孔細胞培養板中,使用多功能酶標儀測定。

1.4.4 活性氧(ROS)的測定

ROS的測定利用ROS檢測試劑盒(南京建成),取一定量的活性污泥離心5 min(12 000 r/min),以磷酸緩沖溶液沖洗3次,并將活性污泥重新懸浮于稀釋好的2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)(10 μmol/L)中;37 ℃細胞培養箱內解育30 min后,用磷酸緩沖液洗滌細胞3次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA;利用多功能酶標儀,在激發波長(Ex)為500 nm、發射波長(Em)為525 nm下檢測所生成2,7-二氯熒光素(DCF)的熒光強度,以反映ROS的水平。

1.4.5 污泥比耗氧速率(SOUR)的測定

污泥的SOUR采用溶解氧儀測定。從反應器中取100 mL污泥混合液放入250 mL錐形瓶內,并向錐形瓶內插入溶解氧儀探頭,曝氣充氧至飽和后迅速封好錐形瓶口,使用磁力攪拌器攪拌,每隔10 s記錄一個DO值,直至錐形瓶內DO質量濃度降至1 mg/L以下時停止。根據DO值隨時間的變化率與污泥濃度計算得到污泥的SOUR。

2 結果與討論

2.1 SMZ與ZnO NPs對活性污泥性能影響

采用MLSS與MLVSS這兩個指標表征活性污泥中生物量的相對值,兩者比值(MLVSS/MLSS)表征污泥活性部分相對含量,污泥容積指數(SVI)來衡量活性污泥凝聚、沉降性能。反應器初始污泥濃度約為4 000 mg/L,裝置運行60 d后取各反應器污泥樣分別測定其污泥濃度,結果如圖1所示。

圖1 SMZ與ZnO NPs對活性污泥性能影響

由圖1(a)可知,連續運行60 d后,空白組R1中MLSS、MLVSS質量濃度分別為4 273、3 468 mg/L,MLVSS/MLSS值約為0.812。R2與空白組R1相比,MLSS、MLVSS及MLVSS/MLSS變化較小;而R3與R4反應器的MLSS、MLVSS及MLVSS/MLSS與前兩者相比均明顯降低。其中,R3反應器MLSS質量濃度與VSS/SS分別降至3 633 mg/L和0.713,R4反應器MLSS質量濃度與MLVSS/MLSS則分別降至3 518 mg/L和0.733,R4相比于R1,MLSS與MLVSS/MLSS分別降低了17.67%和9.73%。

SMZ或ZnO NPs的長期脅迫均會對活性污泥生長代謝產生抑制作用,且ZnO NPs比SMZ的抑制作用更強,這可能與Zn2+溶出、氧化脅迫等方式影響微生物生長代謝有關,從而導致生物增長速率減慢、污泥生物量減少[8-9]。

圖1(b)為4組反應器運行期間污泥SVI值變化情況,污泥出現顆粒化趨勢,初始沉降性能較好,SVI值約為46 mL/g。運行期間R1反應器中SVI值呈現逐漸降低的趨勢,而R2、R3、R4均呈現先升高后降低的變化趨勢。SMZ或ZnO NPs的投加均對活性污泥產生一定毒性,污泥初期未適應環境變化,造成其沉降性降低、SVI值升高,但未出現絲狀菌膨脹;隨著時間推移,污泥中微生物逐漸適應所處環境,自身做出相應調整,沉降性能則有所恢復。反應器運行至第60 d時,R1～R4反應器的SVI值分別為30.42、42.24、46.79、49.31 mL/g,可以看出SMZ或ZnO NPs的長期脅迫均造成污泥沉降性能降低,且以兩者共存時的降低程度最大[10-12]。

2.2 SMZ與ZnO NPs對污泥代謝產物的影響

SMP是影響系統處理水質的重要因素[13],可根據其變化分析活性污泥系統的整體運行狀況。試驗中每7 d對反應器出水SMP各組分含量進行檢測,結果如圖2所示。

注:A—R1;B—R2;C—R3;D—R4。

由圖2可知,試驗初始時各反應器出水SMP含量基本相同,SMP質量濃度約為8.5 mg CODCr/L,其中多糖、蛋白質、腐植酸分別為2.3、4.3、1.9 mg CODCr/L。相比于空白組R1,R2～R4反應器出水SMP含量呈現逐漸升高的趨勢。運行至60 d時,空白組R1出水SMP質量濃度為9.0 mg CODCr/L,R2～R4反應器出水SMP質量濃度依次為10.6、11.8、12.3 mg CODCr/L,相比于R1分別增加了17.8%、31.1%、36.7%。

SMP又稱溶解態胞外聚合物(EPS)[14],實際上SMP與EPS之間可以相互轉化,EPS可以通過水解產生與微生物內源呼吸相關的產物BAP[15]。SMZ或ZnO NPs的投加會促使微生物分泌更多EPS以抵御毒性,而EPS的部分水解會造成SMP含量升高。此外,通過污泥處理性能與形態結構的變化,可以看出R2～R4反應器中污泥代謝活性降低,微生物生長代謝相應受到抑制,微生物活性的降低可能影響了其對SMP的生物降解,一定程度上造成了出水SMP含量的明顯升高。

運行至60 d時,R2～R4反應器出水SMP的多糖含量較對照組R1反應器分別增長10.6%、30.7%和39.0%,蛋白質含量分別增長42.1%、52.9%和63.3%,腐植酸含量增加相對較小,表明SMP總量的增加以蛋白質含量增加為主,從而造成了蛋白質組分占比的提高。此外,R4反應器出水SMP各組分含量增加均為最高,表明SMZ與ZnO NPs共存對污泥代謝產生的影響最大,使微生物生長代謝受到明顯抑制。

聚羥基脂肪酸酯(PHA)與糖原作為活性污泥中微生物細胞的碳源和能源貯存物質,與系統的生物除磷效果有著密切關系。在生物除磷過程中,厭氧階段糖原通過ED(Entner-Doudoroff)或EMP(Embden-Meyerhof)途徑分解并為PHA合成提供還原型輔酶Ⅰ(NADH),而好氧階段PHA分解產生NADH,與O2反應產生ATP為糖原合成提供能量。反應器運行至60 d,在一個完整周期不同時間點取樣,測定污泥中PHA與糖原含量,結果如圖3所示。

圖3 典型周期內活性污泥PHA與糖原含量變化

由圖3可知,PHA含量呈現缺氧升高、好氧降低的變化趨勢,而糖原含量則呈現缺氧降低、好氧升高的變化趨勢。在空白組R1中,缺氧階段PHA含量由23.9%上升至36.1%,糖原含量由18.5%逐漸降至10.7%,且在前25 min變化最快;好氧階段PHA與糖原含量逐漸恢復至起始水平,其中PHA在前25 min(總反應75～100 min)降低最快、糖原在總反應100～150 min升高最快,最后分別穩定在23.5%與18.4%。

投加SMZ的R2反應器中PHA與糖原含量變化與R1較為接近,與R2反應器中可溶性正磷酸鹽濃度變化規律相符,表明SMZ對活性污泥聚磷菌釋磷與吸磷過程影響相對較小。投加ZnO NPs的R3反應器中PHA與糖原含量變化幅度較R1明顯增大,缺氧階段PHA含量由24.6%升至38.8%,糖原含量由19.1%降至9.4%,好氧階段PHA與糖原含量逐漸恢復至起始水平。好氧階段R1反應器的PHA與糖原含量變化幅度分別為12.6%與7.7%,相比于空白組R1,R2與R3反應器PHA變化幅度分別增加0.2%、1.6%,糖原變化幅度分別增加0.6%、1.2%,而R4反應器PHA與糖原含量變化幅度最大,其變化幅度增加量超過R2與R3之和。

2.3 SMZ與ZnO NPs對污泥中微生物活性的影響

SOUR是評價活性污泥代謝活性的重要指標,能夠較為準確反映污泥處理性能的變化,圖4(a)為運行60 d后各反應器中活性污泥SOUR測定結果。從圖中可以看出,R1～R4反應器的SOUR值分別為38.5、30.5、25.8 mg O2/(g MLVSS·h)及18.1 mg O2/(g MLVSS·h),SMZ或ZnO NPs長期脅迫對活性污泥代謝活性均產生明顯抑制作用,造成SOUR顯著下降。

圖4 (a)SBR反應器活性污泥SOUR及抑制率變化;(b)SBR反應器活性污泥胞內ROS含量變化;(c)SBR反應器活性污泥ATP含量變化;(d)SBR反應器活性污泥胞外LDH釋放量

污泥SOUR與微生物的細胞呼吸相關,呼吸作用能夠提供微生物生長代謝所需能量,R2～R4反應器中微生物呼吸抑制率分別達20.8%、33.0%、53.1%。SMZ通過干擾二氫葉酸合成影響微生物遺傳物質代謝,從而對微生物生長代謝產生抑制作用,進而影響污泥代謝活性。鋅作為微生物必需元素,也是DNA、RNA聚合酶的組成組分,然而ZnO NPs的長期脅迫使Zn元素含量超過其閾值,從而影響微生物的正常代謝。此外,SMZ與ZnO NPs共存使R4反應器的呼吸抑制率接近R2與R3反應器之和,表明兩者共存使污泥代謝活性受到的抑制作用進一步增強,最終造成活性污泥處理性能顯著降低[16]。

目前,ROS的產生及氧化應激作用被認為是評價納米材料毒性的最佳指標。因此,運行60 d后對各反應器中污泥胞內ROS含量進行測定,結果如圖4(b)所示。

從圖4(b)可以看出,R2反應器中投加的SMZ屬于有機污染物,其胞內ROS含量與空白組R1基本接近;而R3與R4反應器中污泥胞內ROS含量顯著增高,分別達到165.5%與173.4%。ZnO NPs能夠穿透細胞膜進入微生物細胞體內,并在細胞內積蓄,誘導細胞內ROS含量升高,進而導致溶酶體和線粒體的損傷、酶活性的降低[17],最終造成細胞分解凋亡。

ATP能夠作為衡量活性污泥中微生物活性的重要指標,表征生物降解過程中微生物新陳代謝速度的快慢。裝置運行60 d后,對各反應器內活性污泥中ATP含量進行測定,結果如圖4(c)所示。

從圖4(c)可以看出,以R1反應器活性污泥中ATP含量為100%,R2～R4反應器中ATP含量分別降至65.88%、33.74%和19.52%。與R3、R4反應器相比,R2反應器ATP含量降幅相對較小。SMZ能夠與污泥EPS結合形成EPS-SMZ穩定化合物以減小其毒性,而SMZ的長期脅迫也使部分微生物菌群產生抗藥性,因此微生物活性有所恢復,污泥中ATP含量受影響程度相對較小。ZnO NPs的投加造成Zn2+的溶出并產生氧化脅迫,從而導致細胞結構破壞、微生物活性降低[18]。同時投加SMZ與ZnO NPs的R4反應器活性污泥中ATP含量降幅最大,達到80.48%,兩者共存使其生物毒性顯著增加,微生物能量代謝受到影響,導致微生物活性受到嚴重抑制。

LDH釋放已被廣泛用于評估有毒物質對細胞生長代謝的影響,各反應器運行60 d后活性污泥胞外LDH釋放量如圖4(d)所示。

從圖中可以看出,R2反應器中LDH釋放量增加量較小,胞外LDH釋放相對空白組R1(100%)增長至108.8%,表明SMZ對微生物細胞膜完整性的破壞程度較小。在SMZ長期脅迫下,微生物體內儲存的葉酸被消耗殆盡后,SMZ與對氨基苯甲酸競爭阻礙四氫葉酸的合成,進而抑制微生物的生長繁殖。

R3與R4反應器胞外LDH釋放量顯著增加,分別增至169.5%與182.7%,表明ZnO NPs相比SMZ對微生物細胞完整性影響更大,這與污染物之間性質差異有關。ZnO NPs作為一種納米金屬氧化物,在細胞內產生過量ROS引起氧化應激作用,從而導致細胞膜、蛋白質等結構的破壞。此外,ZnO NPs溶出的Zn2+對微生物產生的毒性也會造成細胞凋亡。SMZ與ZnO NPs共存增加了Zn2+的溶出,對微生物活性產生更大抑制,造成更多細胞凋亡、LDH釋放。

3 結論

(1)R1反應器具有良好的脫氮除磷能力;投加的SMZ或ZnO NPs吸附在微生物表面,阻礙外部營養物質進入細胞,影響微生物生長代謝,進而導致污泥活性與處理性能降低。

(2)R2～R4反應器SMP含量隨運行時間逐漸增加,且以蛋白質組分增加為主,其中R4反應器增幅最大;PHA含量呈現缺氧升高、好氧降低的變化趨勢,糖原含量變化則相反;R2反應器中PHA與糖原周期內變化幅度與R1反應器較為接近,而R3與R4反應器中變化幅度則明顯增大,ZnO NPs的投加影響聚磷菌與聚糖菌的競爭關系,而SMZ與ZnO NPs共存使聚磷菌受影響程度增加、生物除磷能力降低。

(3)R1反應器運行至60 d時SOUR值分別為38.5 mg O2/(g MLVSS·h),R2～R4反應器SOUR明顯降低,R2反應器污泥胞內ROS含量與空白組R1基本相同,而R3與R4反應器中ROS含量分別達到165.5%與173.4%。R2～R4反應器中ATP含量相比空白組R1(100%)分別降至65.88%、33.74%和19.52%,LDH釋放量則分別達到108.8%、169.5%、182.7%。