荷葉山楂杜仲葉復配提取物對大鼠脂質代謝的協同調控作用

任思敏，徐維佳，陳昭聞，王詳，侯歡，葛建*

（1.中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018；2.浙江山嶼海康養產業發展有限公司，浙江杭州 310011）

脂質代謝紊亂是當今社會一類普遍發生的機體脂質代謝綜合征，是動脈粥樣硬化、脂肪肝等疾病最主要病因[1]。目前，臨床上主要以化學藥物干預為主[2]，但效果并不理想而且具有一定的毒副作用[3]。因此，從日常膳食角度進行干預是調控機體脂質代謝紊亂的重要途徑。目前有大量研究表明植物源提取物對脂質代謝紊亂具有顯著調控功能[4-7]，其主要功能成分包括黃酮[8]、類黃酮[9]、皂苷[10]以及生物堿類[11-12]，研究主要采用單一組分或單一植物提取物進行研究。而單一植物往往功能有限，很難達到理想效果，張月月等[13]研究結果表明雷公藤甲素配伍槲皮素對肺癌和食管癌細胞均有抗癌增效作用，并均呈現出良好的量效關系。因此通過多個藥食同源類成分復配來實現功能上的協同作用成為近年來關注的熱點，也與當今“全食品”[14-15]和“復配食品”[16-17]理念一致。

荷葉（Nelumbinisfolium）、山楂（CrataeguspinnatifidaBunge）和杜仲葉（EucommiaulmoidesOliv）都屬我國重要的藥食同源類新食品資源[18]。荷葉味苦、性平，歸肝、脾、胃、心經，具有清暑化濕、升發清陽、涼血止血等功效，荷葉中含豐富的黃酮和生物堿類化合物，其中荷葉堿是荷葉中富含的一種異喹啉類生物堿，不僅是荷葉中的指征成分，也是產生藥理作用的重要成分，荷葉堿通過激活肝臟PGC1α，引起PPARα上升，下游脂肪酸氧化基因上調表達，促進氧化代謝，改善脂質分布，起到降脂作用[19-20]。山楂味酸、甘，性微溫，歸肝、脾、胃經，具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂功效，含有大量有機酸和黃酮化合物等，山楂及山楂黃酮可能通過增強低密度脂蛋白受體活性和提高抗氧化能力預防脂質代謝紊亂[21]。杜仲葉性溫、味甘，歸肝、腎經，作為一種新資源食品具有調控高血壓、高血脂和高血糖等功能，其中杜仲葉總黃酮通過調節血脂參數，降低總膽固醇、甘油三酯、載體脂蛋白B 和低密度脂蛋白膽固醇的水平，并顯著提高高密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白A 的含量，從而發揮降脂作用[22]。因此，綜合荷葉、山楂和杜仲葉的食品性味歸經優勢，研究其復配物協同調控脂質代謝功能及其機理，為荷葉、山楂和杜仲葉等藥食同源類功能食品功效機制以及新產品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷葉、山楂、杜仲葉：市售，經中國計量大學現代科技學院孫駿威副教授鑒定，為藥食同源類荷葉、山楂和杜仲葉。乙醇（95%，分析純）、石蠟、二甲苯（98.5%，分析純）、蘇木精染液（99%）、伊紅染液（5%）：杭州米克化工儀器有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒：南京建成生物工程有限公司；TRIzol?Plus RNA Purification 試劑盒、SuperScript?III First-Strand Synthesis SuperMix 試劑盒：美國Thermo Fisher 公司；雄性Wistar 大鼠[（200±20）g]：上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證編號為SCXK（滬）2017-0005。

1.2 儀器與設備

SpectraMax M5 多功能酶標儀：美國Molecular Devices 公司；HWS-24 恒溫水浴鍋：上海常思工貿有限公司；DTH-2050R 離心機：上海德洋意邦儀器有限公司；OLYMPUS BX60 型熒光顯微鏡攝像機：日本OLYMPUS 公司；Leica HI120 型攤片機、TP1020 全自組織脫水機：德國Leica 公司；CFX384 多重實時熒光定量PCR 儀：美國Bio-Rad 公司；MV-10 全自動超臨界萃取儀/Waters XevoG2-XSQTof 高分辨液質聯用系統：美國Waters 公司；Eclipse Ci-E/L/S 光學顯微鏡：日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 復配提取物制備及化學成分表征

準確稱取一定質量的荷葉、杜仲葉和山楂（去核），粉碎后過60 目篩，然后稱取單一粉末各100 g 加入超臨界萃取儀的萃取罐中，同時加入100 mL 乙醇溶液（體積分數70%）作為夾帶劑，在室溫條件下浸泡過夜，萃取壓力控制在25～30 MPa，萃取劑二氧化碳流速保持10 L/h，分離釜I 和II 溫度分別控制在70 ℃和75 ℃，萃取壓力均為6.0 MPa。將萃取物濃縮成50 g 生藥/mL的復配提取液。取25 mL 復配提取液蒸干，殘渣加25 mL 甲醇溶解，離心（12 000 r/min，10 min）取上清液，過0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

1.3.2 色譜與質譜條件

色譜條件：采用Waters XevoG2-XSQTof 高分辨液質聯用系統，色譜柱為ODS C18 HSS T3 系列（1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；保護柱為XBridge C18（1.8 μm，20 mm×2.1 mm）；流動相A 為水（含0.1% 甲酸）、流動相B 為甲醇；流速0.3 mL/min ；進樣體積5 μL，梯度洗脫條件見表1。

表1 荷葉山楂杜仲葉復配提取物色譜梯度洗脫條件Table 1 Chromatographic gradient elution conditions for the compound extracts of lotus leaf，hawthorn，and Eucommia ulmoides leaf

質譜條件：采用電噴霧離子源，正、負離子模式檢測；掃描范圍m/z100～900 Da；毛細管電壓2 kV；碎裂電壓130 V；碰撞電壓30 V；脫溶劑溫度320 ℃；脫溶劑氣體流速600 L/h。數據工作站為Waters MassLynxV4.1。

1.3.3 動物實驗

首先將實驗大鼠于實驗動物中心無特定病原體（specific pathogen free，SPF）動物房中適應性飼養7 d，實驗室相對濕度（60±5）%，白天/夜晚設置為12 h/12 h。實驗方案由中國計量大學實驗動物倫理委員會批準（2022-005）。適應性養殖后，將36 只大鼠隨機分為6 組，每組6 只，分別為空白對照組、高脂模型組、荷葉組、山楂組、杜仲葉組以及復配干預組，空白對照組和高脂模型組大鼠分別飼喂正常飼料和高脂飼料，每天定期口灌生理鹽水，干預組為飼喂高脂飼料，每天定期口灌提取物，單一提取物劑量均為100 g 生藥/kg，復配提取物劑量為16 g 荷葉+80 g 山楂+4 g 杜仲葉生藥/kg。大鼠正常飼料營養指標如表2所示，高脂飼料配方為10% 豬油、10% 蛋黃粉、2% 膽固醇、0.1% 膽酸鹽、6%酪蛋白、1.2%預混料、3%麥芽糊精，其余基礎日糧。

表2 大鼠正常飼料配方Table 2 Normal diet of rats

1.3.3.1 血清生化檢測

不同處理組大鼠于8 周后，眼靜脈叢采血，離心（4 ℃，3 500 r/min，15 min）分離血清。根據試劑盒說明書，檢測不同處理組大鼠血清中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 濃度變化。

1.3.3.2 肝臟病理組織學檢查

切除大鼠肝臟左側葉部分，于10%福爾馬林溶液中固定，于自動脫水機內脫水后，進行透明和浸蠟及石蠟包埋，然后石蠟切片機切片，制備厚度3～4 μm 切片，烘箱烘干后用于蘇木精-伊紅染色法（hematoxylineosin staining，HE）染色。染色前對切片進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蘇木精和伊紅染色，中性樹膠封片，于普通光學顯微鏡下觀察細胞結構變化。

1.3.3.3 脂質代謝相關基因表達

采用TRIzol?Plus RNA Purification 試劑盒和SuperScript?III First-Strand Synthesis SuperMix 試劑盒對不同處理組大鼠肝臟和小腸組織分別進行總RNA 提取以及第一鏈cDNA 合成，具體步驟參照試劑盒說明書。實驗選取GAPDH為內參基因，采用Primer Premier 6.0 軟件設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成，引物見表3。后采用PowerUpTMSYBRTM Green Master Mix 進行熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR），反應體系：Power SYBR?Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA 模板1.0 μL，補充ddH2O 至20 μL。反應條件為95 ℃預變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸25 s，進行40 個循環。采用2-ΔΔCt法計算不同組織中基因的相對表達量。

表3 大鼠肝臟和小腸組織相關基因引物序列Table 3 Primer sequences of related genes in rat liver and small intestine

1.4 數據統計

所有檢測數據均用平均值±標準差表示，差異性分析采用SPSS18.0 軟件進行統計分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 復配提取物化學成分分析

在擬定的檢測條件下，取供試品溶液進樣分析，正負離子模式下的總提取離子流圖見圖1。

圖1 復配提取物負離子模式和正離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the compound extracts in negative and positive ion modes

通過Waters MassLynxV4.1 軟件分析一級質譜提供的化學成分的保留時間、精確準分子離子峰和碎片離子峰等信息并利用Elemental Composition 工具計算化合物元素組成和可能分子式，對各色譜峰進行初步鑒定，再結合數據庫及文獻數據、裂解規律等信息進行比對，進一步確認化學成分及結構，具體見表4。

表4 復配提取物的化合物鑒定Table 4 Compounds in the compound extracts

2.2 復配提取物對大鼠體質量的影響

不同處理組大鼠體質量變化結果見圖2。

圖2 不同處理組大鼠體質量變化Fig.2 Changes in body mass of rats in different treatment groups

由圖2 可知，不同處理組大鼠干預8 周后，與空白對照組相比，高脂模型組大鼠體質量極顯著升高（P＜0.01），而與高脂模型組相比，單一提取物組和復配干預組大鼠體質量均極顯著下降（P＜0.01），與單一提取物組相比，復配干預組大鼠體質量也有所下降，但差異不明顯。說明與高脂模型組相比，復配提取物能夠明顯降低大鼠體質量。

2.3 復配提取物對大鼠血脂水平的影響

復配提取物對脂質代謝基因表達的影響如圖3所示。

圖3 不同處理組大鼠血脂水平變化Fig.3 Changes in serum lipid levels in rats of different treatment groups

由圖3 可知，不同處理組大鼠血脂水平與高脂模型組相比存在顯著差異，與空白對照組相比，高脂模型組大鼠血脂TG、TC 和LDL-C 濃度升高，而HDL-C 濃度降低。給予不同單一提取物和復配提取物干預8 周后，與高脂模型組大鼠相比，復配干預組大鼠血脂TG、TC 和LDL-C 濃度均顯著降低（P＜0.05），同時HDL-C濃度顯著提高（P＜0.05），說明復配提取物均能夠顯著改善大鼠血脂TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平。

2.4 復配提取物對大鼠肝臟脂肪的影響

不同處理組大鼠肝臟HE 染色結果見圖4。

圖4 不同處理組大鼠肝臟HE 染色結果（100×）Fig.4 HE staining results of rat livers in different treatment groups（100×）

由圖4 可知，高脂模型組大鼠肝臟脂肪空泡明顯多于空白對照組和荷葉組、山楂組、杜仲葉組以及復配干預組，且高脂模型組部分細胞內存在氣球樣變、肝細胞變大，肝細胞核質收縮變形，肝小葉結構被破壞。與高脂模型組相比，復配干預組肝組織中脂滴空泡顯著減少，而與單一提取物組相比，復配干預組大鼠肝臟組織中細胞結構更為清晰，而且細胞核界限更明顯，同時細胞質與細胞核結構更完整，表明復配提取物較單一提取物具有更明顯的調節脂質代謝作用。

2.5 復配提取物對脂質代謝基因表達的影響

復配提取物對脂質代謝基因表達的影響結果見圖5。

本實驗選取了肝臟和小腸中5 個脂質代謝關鍵基因，圖5 結果顯示與空白對照組組相比，高脂模型組肝臟中CYP7A1和PPARα顯著下降，HMGCR表達水平顯著升高；小腸中NPC1L1表達顯著升高，而ABCG5表達顯著降低。與高脂模型組相比，復配干預組大鼠肝臟中CYP7A1和PPARα均顯著升高，HMGCR表達水平顯著降低；小腸中NPC1L1表達顯著降低，而ABCG5表達顯著升高。結果顯示復配提取物可通過上調PPARα/CYP7A1基因表達，同時在小腸層面降低NPC1L1和升高ABCG5表達，達到降低血脂的作用。

3 討論

荷葉和山楂近年來一直作為藥食同源類新食品資源在功能食品領域廣泛應用。荷葉中主要活性成分為荷葉生物堿和黃酮類，研究表明生物堿類為主要降脂減肥功效成分，荷葉生物堿為有機弱堿類阿樸菲生物堿，水溶性極差（溶解度為16 mg/L）[23]，從而使得荷葉生物堿在胃腸道分散性較差，生物利用度較低。山楂性味酸，其主要含有有機酸類和黃酮類成分。因此，荷葉與山楂等酸性食品復配使用，能夠顯著達到協同增效的功能，這與本研究結果一致。

杜仲葉作為新食品資源已被收入藥食同源類新食品資源目錄，具有補肝腎、強筋骨功效，有研究顯示杜仲葉提取物能顯著降低高脂飲食誘導肥胖小鼠血脂水平，改善肝臟脂肪變性，對非酒精性脂肪肝有明顯防治作用[24]。同時，荷葉、山楂和杜仲葉都歸肝經，均具有降脂功效，從食物性味歸經和功能活性角度，均顯示荷葉、山楂和杜仲葉復配能夠顯著調控脂質代謝紊亂。因此，本文以荷葉、山楂、杜仲葉及其復配提取物為主要研究對象，深入探究荷葉、山楂、杜仲葉單一及其復配物的調節脂質代謝功能，為藥食同源類植物復配機制研究提供借鑒。

CYP7A1為肝細胞內膽固醇向膽汁酸合成的限速酶，高脂飲食能夠顯著抑制酶表達，而提取物通過明顯誘導該酶表達水平，從膽固醇排泄途徑加速了消除，從而達到降低膽固醇功能[25]。PPARα為肝細胞內一種重要轉錄因子，本研究發現提取物顯著誘導PPAR-α基因表達，從而進一步調控脂質代謝基因表達，這與文獻相關報道一致[26-27]。NPC1L1和ABCG5分別為小腸黏膜細胞中膽固醇攝取和外排的重要蛋白[28]。因此本研究結果表明，荷葉、山楂、杜仲葉單一提取物以及復配提取物均能調控脂質代謝，其中復配提取物具有更顯著調控高脂所致血脂水平能力，保護肝臟脂肪變性，且其調節機制與脂質代謝相關基因HMGCR、CYP7A1、PPARα、NPC1L1和ABCG5表達水平改變有關。

近年來，大量研究表明腸道菌群可通過影響參與脂質代謝相關基因調節宿主的物質與和能量代謝。已有研究表明若腸道微生物穩態失衡，將導致肥胖癥、糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病的發生與發展[29]。宋晶晶[30]的研究表明枸杞甘草配制酒能夠影響免疫低下的小鼠腸道菌群，提高有益菌的數量，抑制致病菌的生長繁殖。然而本實驗雖明確了荷葉、山楂和杜仲葉復配提取物具有協同增效作用，后續可從腸道菌群角度進行進行機制探究。

4 結論

本研究以與單一植物提取物相比，探究荷葉、山楂、杜仲葉復配提取物協同血脂調節作用。采用超臨界萃取技術得到荷葉、山楂、杜仲葉以及復配提取物，對高脂飼養的Wistar 大鼠進行灌胃，并進行肝臟形態學觀察和脂質代謝基因表達水平檢測。結果表明，荷葉、山楂和杜仲葉提取物均能夠顯著調控肝臟和小腸中脂質代謝相關基因表達，其調節機制通過上調PPARα/CYP7A1基因表達，同時在小腸層面降低NPC1L1和升高ABCG5，進而調節脂質代謝。同時與單一提取物相比，復配提取物又顯著增強了脂質代謝調控功能。綜上所述，將荷葉、山楂和杜仲葉復配提取后，可進一步增強調節脂質代謝，且具有協同增效特點。