4種不同來源花青素的穩定性及抗氧化性比較

馬孟佳，趙娟，陳鵬飛，陳祥貴，3，黃玉坤，3*

（1.西華大學食品與生物工程學院，食品微生物四川省重點實驗室，四川成都 610039；2.四川合泰新光生物科技有限公司，四川成都 610000；3.川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，四川成都 610039）

花青素廣泛存在于植物的果實、葉、種子，是一種天然著色劑，賦予植物從紅橙色到藍紫色的顏色呈現[1]。其在自然界中不穩定，所以通常以糖苷鍵與糖結合形成花色苷而存在[2]。常見植物中的花青素有天竺葵素、矢車菊素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛色素和錦葵色素6 種[3]。研究表明，花青素具有多種生理活性，包括抗氧化、抑制腫瘤細胞、抑菌、調節腸道微生物等[4]，其中抗氧化功能最為顯著，這得益于其優異的自由基清除能力。

藍莓中含有豐富的花青素且功能活性顯著[5]，被廣泛應用于保健品行業。紫薯因其價格低廉，在活性色素提取中應用廣泛，是天然花青素色素的重要來源[6]。此外，紫甘藍和黑豆也是常見的富含花青素的食品原料，研究發現黑豆的花青素濃度和抗氧化能力高于其他豆類（平豆、紅豆、海軍豆和大北方豆）[7]。盡管花青素有較好功能特性，但由于分離出來的花青素高度不穩定，在各種環境因素下會變得非常敏感而使其降解，限制了其在食品中的應用[8]。并且已有研究主要對單一原料花青素的功能性質進行探討，鮮見對不同原料花青素穩定性及抗氧化性進行比較。因此將上述4 種原料花青素的含量、穩定性、抗氧化性進行比較對不同原料花青素在工業上的應用有重要意義。

本文研究光照、pH 值、溫度、金屬離子、氧化劑、還原劑、葡萄糖、蛋白質對花青素的影響并比較4 種原料花青素的穩定性，探究4 種原料花青素對羥自由基、DPPH 自由基、ABTS+自由基清除率及總還原能力，以期為不同原料的加工利用和花青素的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆、純牛奶：市售；鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖（一水）、過氧化氫、無水亞硫酸鈉、氯化鈣、氯化鉀、硝酸鋁、乙酸鈉、三氯化鐵（Ⅲ）六水合物、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazide，DPPH）、抗壞血酸、鐵氰化鉀、過硫酸鉀：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；五水硫酸銅：成都市科隆化學品有限公司；2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸亞鐵：天津市致遠化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：鄭州長城科工貿有限公司；超聲波細胞粉碎機（SCIENTZ-ⅡD）：寧波新芝生物科技有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1900）：成都艾普瑞實驗設備有限公司；多功能酶標儀（SpectraMax i3x）：美谷分子儀器（上海）有限公司；旋轉蒸發儀（IKA-RV10）：艾卡（廣州）儀器設備有限公司；顯數式pH 計（PHS-320）：成都世紀方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

紫薯、紫甘藍、黑豆在避光條件下烘干（50 ℃）、經粉碎機粉碎得到干粉狀原料。在60 ℃黑暗條件下按料液比1∶20（g/mL）用浸提劑[（1%檸檬酸水溶液∶無水乙醇=1∶1（體積比）]浸提10 min 后，采用開2 s、關2 s方式多次超聲（15 min，100 Hz，60 ℃）。藍莓經清洗、研磨，在40 ℃按料液比1∶15（g/mL）用浸提劑[60% 乙醇（pH3）]浸提120 min。每種原料浸提液在60 r/min、50 ℃條件下旋轉蒸發濃縮45 min 得到花青素濃縮液，所有樣品避光保存備用。使用前將濃縮液進行稀釋（1%，pH2）。

1.3.2 pH 示差法測定花青素含量

取1 mL 樣品，分別用pH 值為1.0 和4.5 的緩沖溶液定容至10 mL，用去離子水作空白對照，分別在520、700 nm 處測吸光值（A）[9]。花青素含量按下列公式計算。

A=（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5

X=（A×Mw×DF）× 1 000/ε× 1

式中：A為花青素的吸光值；（A520-A700）pH1.0為pH1.0的緩沖溶液中花青素在520 nm 與700 nm 處吸光值的差值：（A520-A700）pH4.5為pH4.5 的緩沖溶液中花青素在520 nm 與700 nm 處吸光值的差值；X為花青素含量，mg/L；MW= 449.2 g/mol（以矢車菊素葡萄糖苷計）；ε=26 900 L/（mol·cm）；DF為樣品的稀釋倍數。

1.3.3 花青素穩定性比較

1.3.3.1 色素保存率測定

以色素保存率為指標評價花青素穩定性，按如下公式計算色素保存率。

Y=A1× 100/A0

式中：Y為色素保存率，%；A1為花青素保存后吸光值；A0為花青素保存前吸光值。

1.3.3.2 光照對花青素穩定性的影響

取40 mL 樣品測其吸光值，在室溫條件下分別放置于室外日光、室內自然光及暗柜，每24 h 測1 次吸光值，持續7 d。

1.3.3.3 pH 值對花青素穩定性的影響

分別取40 mL 樣品，調整pH 值為2、4、6、8、10 并立即測定其吸光值。然后在室溫避光條件每24 h 再次進行掃譜，持續7 d。

1.3.3.4 溫度對花青素穩定性的影響

取40 mL 樣品測其吸光值，分別于4、25、37、50、70 ℃下避光保溫，每12 h 測1 次吸光值，持續2 d。

1.3.3.5 金屬離子對花青素穩定性的影響

取40 mL 樣品測其吸光值，分別加入2.5 mL 濃度為0.1 mol/L 的氯化鉀、硫酸鎂、五水硫酸銅、氯化鈣、硝酸鋁、三氯化鐵（Ⅲ）六水合物的金屬離子溶液于室溫下避光條件下放置，每24 h 測1 次吸光值，持續7 d。

1.3.3.6 氧化劑及還原劑對花青素穩定性影響

取30 mL 樣品，加入質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 的H2O2溶液配成最終質量濃度為0.03 g/L的混合溶液；加入質量濃度分別為2、4、6、8、10 g/mL的Na2SO3溶液配成最終質量濃度為0.1 g/L 的混合溶液。立即測定吸光值并于室溫避光條件下放置，每24 h 測1 次吸光值，持續7 d。

1.3.3.7 葡萄糖對花青素穩定性影響

取30 mL 樣品，分別加入質量濃度為2、4、6、8、10 g/mL 的葡萄糖溶液配成最終質量濃度為0.1 g/L 的混合溶液。立即測定吸光值并于室溫避光條件下放置，每24 h 測1 次吸光值，持續7 d。

1.3.3.8 蛋白質對花青素穩定性影響

取40 mL 樣品測其吸光值，分別加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 的乳清蛋白溶液并于室溫避光條件下放置，每24 h 測1 次吸光值，持續7 d。

1.3.4 花青素抗氧化性比較

1.3.4.1 羥自由基清除率的測定

取50 μL 樣品于96 微孔板中，加入0.07 mL H2O2（6.0 mmol/L）、0.1 mL FeSO4溶液（1.5 mmol/L）、0.03 mL水楊酸溶液（20 mmol/L），混合均勻后恒溫處理1 h（37 ℃），在510 nm 處測定吸光值，按如下公式計算羥自由基清除率[10-11]，以VC為陽性對照。

Z=[（A0-AS）/A0]× 100

式中：Z為羥自由基清除率，%；AS為樣品的吸光值；A0為空白組（去離子水代替樣品）的吸光值。

1.3.4.2 DPPH 自由基清除率的測定

取2 mL 濃度為0.01 g/L 的樣品，加入2 mL DPPH溶液（0.008 g 的DPPH 固體用無水乙醇溶解并定容至100 mL 容量瓶）振蕩混合，30 min 后在517 nm 處測定吸光值。以VC為陽性對照。第2 組用無水乙醇代替DPPH 的醇溶液，其他操作一致。第3 組用去離子水代替樣品，其他操作一致[9]。按如下公式計算DPPH自由基清除率。

P=[1 -（Ai-Aj）/Ac]× 100

式中：P為DPPH 自由基清除率，%；Ai為樣品與DPPH 溶液混合后的吸光值；Aj為樣品與溶劑混合后的吸光值；Ac為DPPH 溶液與溶劑混合后的吸光值。

1.3.4.3 ABTS+自由基清除率的測定

用去離子水配制7 mmol/L 的ABTS 與2.45 mmol/L的過硫酸鉀的混合溶液，在23 ℃避光存放12～16 h 后得到ABTS+自由基基礎液體。取3.9 mL ABTS 工作液加入5 mL 樣品，放置6 min，測定在734 nm 處的吸光值[9]。以VC為陽性對照。去離子水做空白對照。

H=（1 -A1/A2）× 100

式中：H為ABTS+自由基清除率，%；A1為試驗組吸光值；A2為空白組吸光值。

1.3.4.4 總還原能力測定

取樣品、鐵氰化鉀溶液（質量分數1%）、磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）各2.5 mL 混勻，放置在50 ℃水浴鍋中20 min，冷卻后加入2.5 mL 三氯乙酸溶液（質量分數10%）振蕩混合后，3 000 r/min 離心10 min，取2.5 mL 上清液，加入2.5 mL 去離子水和0.5 mL 三氯化鐵溶液（質量分數0.1%），混勻，測700 nm 處的吸光值[9]。

1.4 數據處理

試驗數據用平均值±標準差表示，利用Excel 和SPSS 進行數據統計分析，使用Origin 2021 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 4 種原料花青素的含量

利用pH 示差法測得藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆4種原料花青素的總含量見圖1。

圖1 藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素的總含量Fig.1 Total content of anthocyanins in blueberry，purple sweet potato，purple cabbage，and black bean

由圖1 可知，藍莓、紫薯的花青素總含量相差不大，從大到小依次為紫甘藍＞紫薯＞藍莓。黑豆花青素總含量最少，為177.34 mg/L。

2.2 4 種原料花青素穩定性的比較

2.2.1 光照對花青素穩定性的影響

光照對4 種原料花青素穩定性的影響見圖2。

圖2 光照對藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素穩定性的影響Fig.2 Effects of light on the stability of anthocyanins from blueberry，purple sweet potato，purple cabbage，and black bean

由圖2 可知，色素保存率隨儲存時間的延長逐漸降低，黑暗條件下花青素降解速率最小，其次是室內，室外降解速率最大，可能是花青素暴露在陽光下發生了光降解作用，導致酰基脫落，使花青素的穩定性下降[12-13]。紫甘藍花青素的色素保存率最高，第7 天（黑暗條件）為80.82%，而藍莓花青素對光照較為敏感，不穩定性較強[10]，僅有65.97%。不同光照下4 種原料花青素穩定性從大到小依次為紫甘藍＞黑豆＞紫薯＞藍莓。

2.2.2 pH 值對花青素穩定性的影響

pH 值對4 種原料花青素穩定性的影響見圖3。

圖3 pH 值對藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素穩定性的影響Fig.3 Effects of pH on the stability of anthocyanins from blueberry，purple sweet potato，purple cabbage，and black bean

由圖3 可知，在pH 值為2、4 時，4 種原料的色素保存率變化不明顯，而pH 值為6、8、10 時發生明顯的降低，說明pH 值對花青素穩定性影響較大，pH 值為2 時花青素最穩定，花青素在不同pH 值條件下產生4種不同的化學形式，并且它們之間是可逆轉變的[14]。藍莓的色素保存率變化最小，可能是因為藍莓中含有多種類型的花青素，可以通過糖基化增強其在不同pH值溶液中的穩定性。不同pH 值下4 種原料花青素穩定性從大到小依次為藍莓＞紫甘藍＞黑豆＞紫薯。

2.2.3 溫度對花青素穩定性的影響

溫度對4 種原料花青素穩定性的影響見圖4。

圖4 溫度對藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素穩定性的影響Fig.4 Effects of temperature on the stability of anthocyanins from blueberry，purple sweet potato，purple cabbage，and black bean

由圖4 可知，溫度越高，花青素降解越快，這是因為在高溫條件下，花青素可能會經歷去糖基化、水親核攻擊、裂解和聚合等一系列反應而加快其降解[15]。48 h 時，色素保存率在4 ℃時高達88.41%～90.78%，而在70 ℃僅有38.74%～56.48%。溫度對紫甘藍花青素穩定性的影響最小，紫薯次之，黑豆和藍莓花青素穩定性較差。

2.2.4 金屬離子對花青素穩定性的影響

金屬離子對4 種原料花青素穩定性的影響見圖5。

圖5 金屬離子對藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素穩定性的影響Fig.5 Effects of metal ions on the stability of anthocyanins from blueberry，purple sweet potato，purple cabbage，and black bean

由圖5 可知，不同的金屬離子對不同原料花青素穩定性影響均不同。藍莓花青素在2～5 d 色素保存率達到高峰，5 d 后恢復穩定，其中Mg2+、Cu2+、Ca2+在2～5 d 提高藍莓花青素的穩定性，5 d 后破壞其穩定性；K+破壞其穩定性；Al3+提高其穩定性；而加入Fe3+雖然吸光值升高，但溶液產生沉淀，所以Fe3+破壞藍莓花青素的穩定性。紫薯花青素比藍莓花青素稍穩定，其中K+在2～5 d 提高紫薯花青素的穩定性，5 d 后破壞其穩定性；Mg2+、Cu2+、Ca2+、Al3+提高其穩定性；加入Fe3+后溶液產生沉淀，破壞花青素的穩定性。K+、Mg2+、Ca2+、Al3+在1～5 d 提高紫甘藍花青素的穩定性，5 d 后破壞其穩定性；Cu2+在1～3 d 對紫甘藍花青素的穩定性影響不大，3 d 后破壞其穩定性；Fe3+破壞其穩定性，結束時色素保存率僅為45.3%。加入Fe3+后溶液產生沉淀，破壞黑豆花青素的穩定性；在其它金屬離子的影響下，黑豆的色素保存率都呈緩慢下降的趨勢，所以金屬離子破壞黑豆花青素的穩定性。此結果和其他學者研究金屬離子對藍莓、紫薯花青素穩定性的影響基本一致（Mg2+、Cu2+的影響結果不一致，這可能是因為加入金屬離子的濃度的不同而對花青素的影響也不同）[6，16]。研究報道金屬離子提高花青素穩定性的機制可能是兩者發生絡合作用，其中花青素分子可以通過與金屬離子的空軌道進行電荷轉移，作為質子供體而與金屬離子相互作用[3，17-18]。綜上，紫甘藍花青素在金屬離子的影響下最穩定。

2.2.5 氧化劑對花青素穩定性的影響

氧化劑對4 種原料花青素穩定性的影響見圖6。

圖6 氧化劑對藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素穩定性的影響Fig.6 Effects of oxidants on the stability of anthocyanins from blueberry，purple sweet potato，purple cabbage，and black bean

由圖6 可知，隨著H2O2濃度的遞增，花青素的色素保存率下降更快，說明氧化劑加快花青素的降解，并且濃度越高對穩定性的影響越大。花青素的高度不飽和結構使其對氧化劑頗為敏感，并且H2O2可能會轉化為其他活性氧（如羥自由基）引發脂質過氧化，對DNA造成損傷[19-20]，從而影響花青素的穩定性及抗氧化性。不同氧化劑（H2O2）濃度下4 種原料花青素穩定性從大到小依次為紫薯＞黑豆＞紫甘藍＞藍莓。

2.2.6 還原劑對花青素穩定性的影響

還原劑對4 種原料花青素穩定性的影響見圖7。

圖7 還原劑對藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素穩定性的影響Fig.7 Effects of reductants on the stability of anthocyanins from blueberry，purple sweet potato，purple cabbage，and black bean

由圖7 可知，還原劑（Na2SO3）濃度越大，色素保存率越低，其原因可能是花青素碳骨架的C4 位與水合SO2發生加成反應而褪色[19，21]，Na2SO3濃度越大，這種作用越強烈。藍莓在不同濃度還原劑下的色素保存率差距較大，第7 天為43.16%～80.41%，說明藍莓花青素對還原劑的濃度變化較敏感。相反，黑豆在不同濃度還原劑的條件下色素保存率較接近，第7 天為45.67%～53.15%。紫薯穩定性最強，這可能與它的花青素主要以酰基化形式存在有關。不同還原劑（Na2SO3）濃度下4 種原料花青素穩定性從大到小依次為紫薯＞藍莓＞黑豆＞紫甘藍。

2.2.7 葡萄糖對花青素穩定性的影響

葡萄糖對4 種原料花青素穩定性的影響見圖8。

圖8 葡萄糖對藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素穩定性的影響Fig.8 Effects of glucose on the stability of anthocyanins from blueberry，purple sweet potato，purple cabbage，and black bean

由圖8 可知，葡萄糖溶液濃度越高，色素保存率降低得越慢。第7 天（葡萄糖溶液濃度為10 g/mL）時花青素保存較完好，藍莓、紫薯、紫甘藍和黑豆花青素的色素保存率分別為87.32%、92.91%、95.28%、89.08%，說明高濃度的葡萄糖有利于提高花青素的穩定性，這可能是因為花青素與葡萄糖發生共色素沉著，或者通過與葡萄糖的糖基化而提高花色苷的穩定性[22]。葡萄糖也可通過破壞花青素與多酚聚合物的聚合，達到增強花青素穩定性的作用[16]。不同濃度的葡萄糖溶液下4 種原料花青素穩定性從大到小依次為紫甘藍＞紫薯＞黑豆＞藍莓。

2.2.8 蛋白質對花青素穩定性的影響

蛋白質對4 種原料花青素穩定性的影響見圖9。

圖9 乳清蛋白對藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素穩定性的影響Fig.9 Effects of whey protein on the stability of anthocyanins from blueberry，purple sweet potato，purple cabbage，and black bean

由圖9 可知，加入乳清蛋白可以提高花青素的穩定性，此結果與已有研究結果一致[23]，這是因為花青素可以通過氫鍵與乳清蛋白形成絡合物，從而增強其穩定性[24]。但是隨著加入乳清蛋白體積的增大，不同原料花青素的色素保存率變化趨勢有較大的不同。其中紫薯、紫甘藍隨著時間的延長色素保存率波動較小；藍莓花青素在2 d 內變化較小，2 d 后色素保存率急劇增大，與乳清蛋白體積沒有明顯關聯；而黑豆的色素保存率先急劇增加，在1 d 后波動幅度減小。

2.3 4 種原料花青素抗氧化性的比較

4 種原料花青素抗氧化性比較見圖10。

圖10 4 種原料的抗氧化性比較Fig.10 Comparison of antioxidant activities of anthocyanins from four sources

花青素可以通過氫原子轉移和單電子轉移兩種一般機制對活性氧表現出直接的抗氧化活性，通過向自由基提供質子和電子，將其轉化為更穩定的產物[25]。由圖10 可知，VC對自由基的清除效果最好。4 種原料花青素的羥自由基清除率、DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率及總還原能力排序為藍莓＞紫甘藍＞紫薯＞黑豆。通常情況下，吡喃環周圍的自由羥基數量（羥基數量越多=抗氧化能力越強）、羥基的相對位置、化合物的基本結構取向、環結構的共軛都是決定花青素抗氧化能力的重要因素[26]，不同原料花青素的抗氧化活性不同可能與其含有的花青素種類有關。

3 結論

本研究比較藍莓、紫薯、紫甘藍、黑豆花青素的含量、穩定性和抗氧化能力。研究結果表明，4 種原料花青素含量排序為紫甘藍＞紫薯＞藍莓＞黑豆。光照、pH值、溫度、氧化劑對花青素穩定性的影響較大；還原劑對花青素穩定性的影響較小；金屬離子對花青素穩定性的影響較復雜；糖和蛋白質有利于花青素的保留，提高花青素的穩定性。4 種食品原料中，紫甘藍花青素在不同光照、溫度、金屬離子、葡萄糖、蛋白質條件下穩定性最好；藍莓在不同pH 值條件下穩定性最好；紫薯在氧化劑和還原劑存在下穩定性最好；而黑豆花青素的穩定性無論在任何條件下都處于較中水平。綜上所述，花青素含量最高和穩定性最佳的食品原料是紫甘藍，抗氧化性最強的食品原料是藍莓。這些數據能為不同原料花青素的研究以及對最佳加工方式和儲存條件提供參考，以便提高在工業上的應用。