不同乳酸菌發酵留蘭香純露的抗氧化活性比較

蔡春靜，李璇，王瑩，張元成，楚杰*

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生物研究所，山東濟南 250013；2.山東昌龍農業科技有限公司，山東濟南 251600）

留蘭香，別名綠薄荷，屬唇形科，多年生草本植物[1]。留蘭香具有疏風清熱、解表和中、理氣止痛的功效，可用于治療感冒頭痛、胃痛、咳嗽、腹脹、吐瀉、痛經、肢麻、跌撲腫痛[2]等。研究表明，留蘭香中含有的香芹酮，不僅具有顯著的抗炎作用[3]，其抗炎機制可能與減少巨噬細胞的產生及炎性遷移、抑制促炎因子表達等炎癥反應進程調控有關[4]；而且留蘭香油還具有明顯的抗氧化作用[5]。目前，留蘭香植株收割后加工提取留蘭香油，在留蘭香精油蒸餾過程中產生的副產物——留蘭香純露，主要包含微量的香精油和水溶性混合物。與精油相比，其中含有豐富的黃酮苷、木脂素苷、萜苷以及酚酸類化合物。由于市場上對純露的價值缺乏認知，加工企業在獲得揮發油后，純露多被作為工業廢水排放，不僅使環境受到污染，也是對留蘭香資源的極大浪費。研究表明，留蘭香純露有較好的自由基清除能力和總抗氧化能力。

近年來，化妝品產業呈現出蓬勃發展的態勢，皮膚問題愈發成為人們關注的熱點，紫外線輻射引起的皮膚氧化是導致皮膚損傷、老化的重要原因[6-7]。研究發現，長期使用添加化學抗氧化劑的化妝品對生物體有潛在的毒副作用[8]。因此，開發以天然成分為主的抗氧化產品是近年來的研究重點。本文選用不同乳酸菌發酵的留蘭香純露作為研究對象，研究其所具有的抗氧化能力，以期為后續其在食品、日用化學品、醫藥等領域的開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）LR-1、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）LP-1、糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）EF-1、嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）LA-1：山東省科學院生物研究所工業微生物實驗室保存；留蘭香純露：山東昌龍農業科技有限公司。

2，2-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）]：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；K2S2O8、Na2HPO4：天津市科密歐化學試劑有限公司；FeSO4、NaH2PO4：國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯三酚、水楊酸：上海麥克林生化科技股份有限公司；MRS 培養基：青島高科園海博生物技術有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

V-5600 分光光度計：上海元析儀器有限公司；HH-3A 數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；HWS-150 恒溫恒濕培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；GZC-30013 智能光照培養箱：合肥右科儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

從保存鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌的甘油管中取50 μL 接種到MRS 培養基中，37 ℃恒溫培養24 h。

1.3.2 不同乳酸菌發酵留蘭香純露

將活化的鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌以3%接種量分別接種到留蘭香純露體積分數分別為20%、40%、60%、80%、100% 的MRS 培養液中，37 ℃恒溫培養24 h，稀釋涂平板，記錄活菌數。

1.3.3 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露的體外抗氧化力測定

1.3.3.1 樣品制備

不同濃度的留蘭香純露：用無菌水將留蘭香純露稀釋成體積分數為20%、40%、60%、80%、100% 的留蘭香純露稀釋液。

不同濃度乳酸菌發酵的留蘭香純露：將1.3.2 制備的不同體積分數發酵后的留蘭香純露用相同濃度純露分別稀釋成相同活菌數，避免活菌數對后期試驗結果造成影響。

1.3.3.2 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露清除DPPH 自由基能力的測定

DPPH 自由基清除力測定參照Bae 等[9]的方法并略作改進。配制0.180 mmol/L DPPH 儲備液，各取2 mL DPPH 儲備液與樣品充分搖勻后37 ℃避光反應30 min，517 nm 測吸光度。空白組以2 mL 無菌水代替DPPH 溶液，對照組以2 mL 無菌水代替樣品，相同方法處理。每組設置3 個平行試驗，結果取其平均值。DPPH 自由基清除率（X，%）計算如式（1）。

式中：A0、A1、A2分別為DPPH 自由基清除能力測定反應中配制的對照組、樣品組、空白組反應液在517 nm 波長處測得的吸光度。

1.3.3.3 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露清除ABTS+自由基能力的測定

ABTS+自由基清除能力測定參考李新[10]的方法并略作改進。將ABTS 溶液（7.00 mmol/L）與硫酸二氫銨溶液（2.45 mmol/L）按體積比1∶1 混合，避光放置12～16 h，即為ABTS 儲備液，將其用無水乙醇稀釋40～50 倍，使稀釋液在波長734 nm 處吸光度為0.70±0.02（無水乙醇調零），即ABTS 工作液。加入6 mL ABTS工作液與3 mL 樣品，充分搖勻后25 ℃下避光反應30 min，以無水乙醇調零，735 nm 測定吸光度。空白組以6 mL 無菌水代替ABTS 工作液，對照組以3 mL 無菌水代替樣品，相同方法處理。每組設置3 個平行，結果取其平均值。ABTS+自由基清除率（Y，%）計算如式（2）。

式中：A0、A1、A2分別為ABTS+自由基清除能力測定反應中配制的對照組、樣品組、空白組反應液在735 nm 波長處測得的吸光度。

1.3.3.4 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露清除·OH 能力的測定

·OH 清除能力測定參考張新霞[11]的方法并略作改動。加入6 mmol/L 的FeSO4溶液、樣品及相同摩爾數的H2O2、水楊酸溶液各2 mL，充分搖勻后靜置反應30 min，以去離子水調零，510 nm 測吸光度。空白組以2 mL 無菌水代替水楊酸，對照組以2 mL 無菌水代替樣品，相同方法處理。每組設置3 個平行，結果取其平均值。·OH 清除率（P，%）計算如式（3）。

式中：A0、A1、A2分別為·OH 清除能力測定反應中配制的對照組、樣品組、空白組反應液在510 nm 波長處測得的吸光度。

1.3.3.5 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露清除O2-自由基能力的測定

O2-自由基清除能力測定參照周江菊等[12]的方法并有所修改。加入4.5 mL 50 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液（pH8.2）及1 mL 樣品，充分搖勻后，25 ℃水浴25 min。再加入2 mL 10 mmol/L 鄰苯三酚溶液，25 ℃水浴5 min，最后加入1 滴濃鹽酸終止反應。以去離子水調零，299 nm 測定吸光度。空白組以2 mL 無菌水代替鄰苯三酚溶液，對照組以1 mL 無菌水代替樣品，相同方法處理。每組設置3 個平行試驗，結果取其平均值。·O2-清除率（Z，%）計算如式（4）。

式中：A0、A1、A2分別為·O2-清除能力測定反應中配制的對照組、樣品組、空白組反應液在299 nm 波長處測得的吸光度。

1.3.3.6 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露總還原力的測定總還原力的測定參照Ahmadi 等[13]的方法并稍作修改。加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液、2.5 mL 1% 鐵氰化鉀以及1 mL 樣品，充分搖勻后，50 ℃水浴20 min。再加入2.5 mL 10% 三氯乙酸，4 000 r/min 離心10 min，最后取5 mL 上清液、5 mL 無菌水以及1 mL 0.1% 三氯化鐵，靜置10 min。以去離子水調零，700 nm 測吸光度。空白組以1 mL 無菌水代替樣品，相同方法處理。每組設置3 個平行試驗，結果取其平均值。總還原力（B）計算如式（5）。

式中：A0、A1分別為總還原力測定反應中配制的空白組、樣品組反應液在700 nm 波長處測得的吸光度。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2019 軟件處理數據，數據以平均值±標準差表示，數據采用單因素方程分析——最小顯著性差異（least significant difference，LSD）檢驗進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌發酵留蘭香純露的活菌數

前期研究發現不同乳酸菌抗氧化能力存在差異，但不同乳酸菌的抗氧化機制尚未完全闡明。因此，選取4種不同的乳酸菌對不同體積分數的留蘭香純露進行發酵，通過比較其在不同體積分數的留蘭香純露中的發酵生長情況，分析比較體外抗氧化能力差異，不僅可以挖掘具有優良抗氧化特性的乳酸菌，而且為下一步留蘭香純露的開發應用提供參考。不同乳酸菌發酵的留蘭香純露的活菌數見表1。

表1 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露的活菌數Table 1 Bacteria counts in the spearmint hydrolates fermented by different lactic acid bacteria CFU/mL

由表1 可知，經4種不同乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露活菌數各有差異，糞腸球菌及植物乳桿菌發酵的20%、40% 純露活菌數均高于0% 純露的乳酸菌發酵液，說明低濃度的留蘭香純露可以促進植物乳桿菌及糞腸球菌的生長。但經鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌發酵的20%、40%純露以及經4 種菌發酵的60%純露中的活菌數與初始菌數相比，雖然有所提高，但均低于0%純露的乳酸菌發酵液，說明不同濃度的留蘭香純露對4 種乳酸菌的生長有一定的影響，這一結論在乳酸菌發酵的80%、100% 純露可以得到驗證，其植物乳桿菌、糞腸球菌及嗜酸乳桿菌發酵后其活菌數均低于接種量。

為了進一步探究以上4 種乳酸菌在留蘭香純露中的發酵生長情況，以0% 純露的4 種乳酸菌發酵液和未經發酵的留蘭香純露為對照，對4 種乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露（20%、40%、60%）進行體外抗氧化試驗評價。

2.2 不同乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露的體外抗氧化能力比較

2.2.1 不同乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露對DPPH 自由基的清除能力

DPPH 在有機溶劑中較為穩定，在517 nm 波長處有強吸收，當自由基清除劑存在時，單電子與抗氧化劑中的質子配對而被還原，溶液變淺，吸光度降低，且這種顏色變淺的程度與配對電子數呈化學劑量關系，即吸光度越低，樣品清除自由基能力越強，從而用于評價樣品的抗氧化能力[14]。因此采用該方法測定不同乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露對DPPH 自由基的清除率，結果見表2 及圖1。

圖1 乳酸菌發酵的不同體積分數留蘭香純露對DPPH 自由基的清除作用Fig.1 DPPH free radical scavenging effects of different volume fractions of spearmint hydrolates fermented by lactic acid bacteria

表2 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露對DPPH 自由基的清除能力Table 2 DPPH free radical scavenging effects of spearmint hydrolates fermented by different lactic acid bacteria%

研究證明，植物乳桿菌NDC 75017、嗜酸乳桿菌NCFM、植物乳桿菌ATCC 14917、鼠李糖乳桿菌LGG發酵液對DPPH 自由基的清除率為22%～55%[15]。由表2 可知，本試驗所用菌株的發酵液對DPPH 自由基清除率明顯較高，這也說明不同菌株的抗氧化能力不同。留蘭香純露、乳酸菌發酵液及不同乳酸菌發酵的留蘭香純露均對DPPH 自由基有清除作用。這與已有研究的許多植物純露都具有一定的抗氧化活性結論相一致[16]，且本研究中留蘭香純露對DPPH 自由基的最高清除率高于文獻報道的玫瑰純露[17]、麩炒枳殼純露、吳茱萸純露、車前子純露和黃梔子純露等[16]。結果顯示，4 種乳酸菌發酵的留蘭香純露對DPPH 自由基清除率要高于留蘭香純露和乳酸菌發酵液的清除率。說明留蘭香純露經乳酸菌發酵后其抗氧化活力有了極大提高，其中鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌發酵的留蘭香純露提升尤為顯著（P＜0.05）。

圖1 結果顯示，相同體積分數，乳酸菌發酵的留蘭香純露對DPPH 自由基的清除率均高于留蘭香純露，且乳酸菌發酵的留蘭香純露對DPPH 自由基清除率隨著體積分數的增加而增加，且呈現一定的濃度依賴性。4 種乳酸菌發酵的留蘭香純露DPPH·清除率均在體積分數為60%時達到最大值，其與相同體積分數留蘭香純露相比分別增加了1.17、1.17、1.15、1.15 倍。研究顯示，乳酸菌具有DPPH 自由基清除活性可能與菌體產生的胞外多糖有關，Xu 等[18]研究顯示DPPH 自由基清除活性與由雙歧桿菌分離出的胞外多糖的濃度呈正相關。乳酸菌發酵的留蘭香純露對DPPH 自由基清除活性可能也與此有關。

2.2.2 不同乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露對ABTS+自由基的清除作用

ABTS+自由基在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的自由基陽離子，當有抗氧化物質存在時，ABTS+·的產生會被抑制，使反應體系褪色，吸光度變小，在734 nm 處測定吸光度即可計算出藥物的清除能力[19]。本試驗采用該方法測定不同乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露對ABTS+自由基的清除作用，結果見表3 及圖2。

圖2 乳酸菌發酵的不同體積分數留蘭香純露對ABTS+自由基的清除作用Fig.2 ABTS+free radical scavenging effects of different volume fractions of spearmint hydrolates fermented by lactic acid bacteria

表3 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露對ABTS+自由基的清除作用Table 3 ABTS+free radical scavenging effects of spearmint hydrolates fermented by different lactic acid bacteria%

由表3 可知，留蘭香純露、乳酸菌發酵液及不同乳酸菌發酵的留蘭香純露對ABTS+自由基的清除作用均超過50%，證明其均有良好的抗氧化能力。留蘭香純露略低于文獻報道的香榧純露對ABTS+自由基的清除率[20]，但留蘭香純露經4 種乳酸菌發酵后對ABTS+自由基的清除率大大提高，且高于留蘭香純露和乳酸菌發酵液。

由圖2 看出，ABTS+自由基的清除率與留蘭香純露的體積分數呈正相關，隨著體積分數的增加，經鼠李糖乳桿菌、糞腸球菌及嗜酸乳桿菌發酵的20%、40%、60%留蘭香純露對于ABTS+自由基的清除率也隨之增加。4 種乳酸菌發酵的留蘭香純露對ABTS+自由基清除能力與相同體積分數的留蘭香純露相比有較大提升，除植物乳桿菌發酵的留蘭香純露是在體積分數為40%時達到最大值外，其余均是在體積分數為60%時達到最大值。

2.2.3 不同乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露對·OH 的清除作用

在體外實驗體系中，環境中的Fe3+和Fe2+催化過氧化氫和超氧陰離子反應生成羥基自由基，羥基自由基是活性氧中反應能力最強的一種，幾乎可以和細胞內的一切有機物反應，能夠殺死紅細胞，降解細胞膜、DNA 和多糖類化合物，引起組織細胞病變，導致疾病發生和加速機體衰老[21]。采用水楊酸法對·OH 清除能力進行測定的結果見表4 和圖3。

圖3 乳酸菌發酵的不同體積分數留蘭香純露對·OH 的清除作用Fig.3 ·OH scavenging effects of different volume fractions of spearmint hydrolates fermented by lactic acid bacteria

表4 不同乳酸菌發酵的留蘭香純露對·OH 的清除作用Table 4 ·OH scavenging effects of spearmint hydrolates fermented by different lactic acid bacteria%

研究顯示，菌體具有較強的羥自由基清除能力可歸結為在細胞內存在著針對Cu2+和Fe2+的天然螯合物質，Cu2+和Fe2+能夠參與機體多種氧化過程，因此乳酸菌對Cu2+和Fe2+的螯合作用，能夠從根本上減少羥自由基的產生[22]。這可能是乳酸菌發酵液對·OH 具有較高清除率的原因。由表4 可知，留蘭香純露對·OH的清除率在12% 左右，明顯高于報道中高良姜純露對·OH 的清除率[23]。4 種乳酸菌發酵的留蘭香純露對·OH 的清除作用遠高于留蘭香純露及乳酸菌發酵液的清除作用，且相互之間差異顯著（P＜0.05）。其中嗜酸乳桿菌發酵的留蘭香純露的·OH 清除率最高，達到95.48%，與留蘭香純露及乳酸菌發酵液相比分別增加了6.36 倍、23.06%。

如圖3所示，留蘭香純露對·OH 的清除作用相對較低，但經乳酸菌發酵的留蘭香純露對·OH 的清除作用大幅升高，以體積分數60% 尤為顯著，與相同體積分數的留蘭香純露相比，·OH 清除率增加7.18、6.54、6.91、7.67 倍。

2.2.4 不同乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露對O2-自由基的清除作用

·O2-是機體在代謝過程中產生的一種具有很強氧化能力的自由基，抗氧化物質清除·O2-是衡量抗氧化能力的一個重要指標[24]。本試驗釆用鄰苯三酚自氧化方法，在堿性條件下，鄰苯三酚可發生自氧化，產生·O2-等中間產物，·O2-又可加快鄰苯三酚的自氧化速率，所以可通過檢測抗氧化劑對鄰苯三酚自氧化速率的影響，反映抗氧化劑對·O2-的清除能力，結果見表5和圖4。

圖4 乳酸菌發酵的不同體積分數留蘭香純露對·O2-的清除作用Fig.4 ·O2-scavenging effects of different volume fractions of spearmint hydrolates fermented by lactic acid bacteria

表5 留蘭香純露及乳酸菌發酵的留蘭香純露對·O2-的清除作用Table 5 ·O2-scavenging effects of spearmint hydrolates fermented and not fermented by different lactic acid bacteria%

由表5 看出，糞腸球菌、嗜酸乳桿菌乳發酵的留蘭香純露對·O2-的清除率要明顯高于留蘭香純露和乳酸菌發酵液，且差異均顯著（P＜0.05）。說明純露與乳酸菌發酵液之間在·O2-的清除作用方面同樣存在疊加效應，可以相互促進其對·O2-的清除。

由圖4 可知，乳酸菌發酵的留蘭香純露對·O2-清除能力相較于其他自由基稍差，為20%～50%，可能是因為菌體內抗氧化酶含量較少。與其他自由基的清除效果相同，4 種乳酸菌發酵的留蘭香純露對·O2-的清除力有了大幅升高。除植物乳桿菌發酵的純露以外，其余3 種菌發酵的留蘭香純露均在60% 時清除效果最佳，與留蘭香純露相比分別增加了4.03、5.84、5.73 倍。

2.2.5 不同乳酸菌發酵的不同體積分數的留蘭香純露總還原力比較

研究表明，一般情況下某些物質的抗氧化性與還原性之間存在正相關性，還原力越強，其抗氧化性越強，因此可通過測定物質的還原力來評估其抗氧化能力，若吸光度越大，則還原性越高，抗氧化活性也就越高[25]。因此本試驗通過測定其總還原力，側面反映其抗氧化性，結果見表6 和圖5。

圖5 乳酸菌發酵的不同體積分數留蘭香純露的總還原力Fig.5 Total reducing power of different volume fractions of spearmint hydrolates fermented by lactic acid bacteria

表6 留蘭香純露及乳酸菌發酵的留蘭香純露的總還原力（A700 nm）Table 6 Total reducing power of spearmint hydrolates fermented and not fermented by different lactic acid bacteria

表6 結果顯示，4 種乳酸菌發酵的留蘭香純露總還原力與留蘭香純露及乳酸菌發酵液具有顯著差異（P＜0.05）。其中以鼠李糖乳桿菌增長幅度最大，分別增長了38.04、3.10 倍；其次為糞球桿菌發酵純露、植物乳桿菌發酵純露、嗜酸乳桿菌發酵純露。

由圖5 可知，4 種乳酸菌發酵的留蘭香純露的總還原力均遠高于留蘭香純露。與上述結論類似，大部分乳酸菌留蘭香純露在體積分數60% 時的總還原力最強。乳酸菌發酵留蘭香純露體積分數在60%時，鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌發酵的留蘭香純露的還原力在A700nm處可達到1.2～1.6。

3 結論

本試驗結果表明，留蘭香純露具有一定的體外抗氧化活性，且在一定范圍內，體積分數越高，抗氧化性越好。與留蘭香純露相比，不同乳酸菌發酵的留蘭香純露在抗氧化方面更具有優勢。留蘭香純露與乳酸菌發酵液有疊加效應，導致乳酸菌發酵留蘭香純露對DPPH 自由基、ABTS+自由基、·OH、·O2-的清除能力及總還原力均有大幅提升，尤其在·OH 清除能力和總還原力方面尤為突出。通過對比不同乳酸菌發酵的不同體積分數留蘭香純露的抗氧化力，多數乳酸菌在留蘭香純露體積分數為60% 時，DPPH 自由基、ABTS+自由基、·OH、·O2-的清除能力以及其總還原力最高。本試驗僅是對不同乳酸菌發酵的留蘭香純露的抗氧化能力做了初步探討，留蘭香純露是否可以作為以天然植物成分為主的抗氧化產品還需要進一步深入研究。