高溫高壓降解制備低分子量水溶性酵母葡聚糖

王寒梅，劉垚，何啟煜，趙雪

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003）

酵母是一種單細胞真菌，被廣泛應用于發(fā)酵產業(yè)如生產面包和啤酒等。我國酵母產量較大且其具有豐富的營養(yǎng)[1]，目前已經開發(fā)出許多新型相關產品如面膜、調味品以及藥品等，但大部分仍被作為飼料使用。酵母細胞壁是一種復雜的多層結構，甘露聚糖位于細胞壁外層，葡聚糖位于細胞壁內層[2]，酵母葡聚糖的主鏈是β-（1，3），支鏈是β-（1，6），其高級結構為三股螺旋的三聚體形式，這種特殊的高級結構使得酵母細胞壁中的葡聚糖是不溶性的[3]。

酵母葡聚糖具有豐富的生物活性，如增強機體免疫能力[4-5]、抗腫瘤[6-7]和抗病毒以及降血壓降血脂等生理活性[8-10]，β-葡聚糖能增強巨噬細胞的吞噬能力，增加細胞因子的分泌，從而調節(jié)全身細胞免疫和體液免疫，發(fā)揮抗腫瘤作用[11]。酵母葡聚糖的生物活性與其溶解性密切相關[12-13]，酵母葡聚糖的不溶性極大地限制了其在醫(yī)藥、美容等領域的開發(fā)應用[14]。水溶性β-葡聚糖通過與Dectin-1 結合從而激活先天免疫和獲得免疫[15]，且低分子量葡聚糖比高分子量葡聚糖具有更強的增強免疫[16]、抗腫瘤[17]的活性，因此制備水溶性酵母葡聚糖可增加酵母葡聚糖的開發(fā)利用范圍。目前主要的降解方法有超聲降解法[18]、酸降解[19]、酶解法[20]、高壓微流態(tài)化法[21]等。而化學法多采用強酸強堿或者化學修飾等方法，不僅會破壞酵母葡聚糖原本的結構，且容易對環(huán)境造成污染[13，19，22]。Ishimoto 等[23]通過135 ℃熱降解葡聚糖制備出大分子量可溶性葡聚糖，但高溫加熱使得葡聚糖出現(xiàn)嚴重褐變現(xiàn)象。高溫高壓降解法操作簡便、重復性好，且回收率高，是一種綠色環(huán)保的降解方法[24]。但該方法會引起褐變，需要進一步優(yōu)化，如何探究出通過控制pH 值來制備低分子量水溶性酵母葡聚糖和葡寡糖的最優(yōu)制備條件目前尚不明確。本研究以啤酒酵母粉為原料，研究高溫高壓降解制備低分子量水溶性酵母葡聚糖和葡寡糖的工藝，探究溫度、pH 值和時間對水溶性酵母葡聚糖得率和分子量的影響，并通過傅里葉變換紅外光譜和核磁共振波譜技術（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）對其結構變化進行研究，以期為制備低分子量水溶性酵母葡聚糖和葡寡糖提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母粉：青島啤酒有限公司。

葡聚糖標準品（重均分子量分別為5 220、11 600、48 600、147 600、273 600 Da）：美國Sigma 公司；乙酸、氫氧化鈉、無水乙醇、無水溴化鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；D2O（純度99.9%，25 g）：上海麥克林生化科技有限公司）；木瓜蛋白酶（80×104U/g）、中性蛋白酶（5×104U/g）：北京索萊寶科技有限公司；0.22 μm 濾膜：杉羽科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

1260 型高效液相色譜儀器：美國安捷倫科技公司；Ohpak SB-804HQ（8 mm×300 mm）、TSKgel G3000SWxl（7.8 mm×300 mm）：日本Shodex 公司；SX-700 高壓滅菌鍋：北京天美科技有限公司；PHS-3C 型pH 計：上海儀電科技儀器股份有限公司；DD5 臺式大容量離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；SCIENTZ 超聲波細胞粉碎機：迅特爾科學儀器有限公司；JEOL JNM-ECP 600M 超導核磁共振波譜儀：日本電子公司；NICOLET Is10 傅里葉變換紅外光譜儀：美國Thermo Fisher Scientific 公司；ZX11-UV-1000 紫外分光光度計：北京東方化玻科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不溶性酵母葡聚糖的制備

將粗酵母粉用蒸餾水低速離心（3 000×g，10 min）清洗5 次，加蒸餾水配制0.25 g/mL 懸浮液通過超聲波細胞粉碎機破碎酵母細胞，程序設定為超聲5 s、停5 s，功率450 W。超聲結束后加入0.36% 和6.4% 的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解蛋白質，55 ℃、pH6 條件下水解10 h 后滅活，離心（3 000×g，10 min）取沉淀，用0.5 mol/L NaOH 處理沉淀，80 ℃攪拌2 h，乙酸調節(jié)至中性，用蒸餾水洗滌沉淀3 次，無水乙醇洗滌沉淀3 次，空氣吹干至恒重，研磨過500 目紗得到不溶性酵母葡聚糖[18]。

1.3.2 高溫高壓法制備水溶性酵母葡聚糖

用蒸餾水配制5 mg/mL 不溶性酵母葡聚糖懸浮液，放置12 h 使不溶性酵母葡聚糖吸水膨脹，用30%乙酸分別調節(jié)pH3、4、5，放入高溫高壓滅菌鍋中，分別在120、135 ℃高溫高壓降解0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h，降解產物離心（5 000×g，10 min）取上清液，即為水溶性酵母葡聚糖。

1.3.3 硫酸苯酚法測定多糖含量

1.3.3.1 標準曲線的制作

取一定量的葡萄糖105 ℃烘干至恒重，配制葡萄糖標準液100 μg/mL，取18 支潔凈的試管，設置6個濃度梯度，每個濃度做3 個重復，向試管中依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的葡萄糖標準溶液，加水補足至1 mL，然后向每支試管中加入1 mL 6% 苯酚和5 mL 濃硫酸，振蕩均勻，沸水浴20 min 后冷卻至室溫，在紫外分光光度計上480 nm 處測定吸光度[25]。

1.3.3.2 不溶性酵母葡聚糖的多糖含量的測定

精密稱取10 mg 酵母樣品，加入3 mL 12 mol/L 的硫酸中，振蕩混勻，室溫下水解3 h，然后，向試管中加入15 mL 的去離子水，使水解的硫酸的濃度為2 mol/L，混勻后，在烘箱100 ℃水解4 h，冷卻至室溫后，將試管中的樣品溶液定容至250 mL，配成待測液。按照標準曲線的方法，在試管中依次加入待測液、去離子水、6%的苯酚各1 mL，加入5 mL 的濃硫酸后，沸水浴20 min，冷卻至室溫后測定其吸光度（OD480）。

1.3.3.3 水溶性酵母葡聚糖多糖含量的測定

取1 mL 上清液加入6%苯酚1 mL、5 mL 濃硫酸。沸水浴20 min 后，測定吸光度（OD480）。

1.3.4 蛋白質含量的測定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定蛋白質含量。

1.3.5 高效分子排阻凝膠色譜分析降解產物的分子量測定

不溶性酵母葡聚糖降解產物用0.1 mol/L Na2SO4溶解成5 mg/mL 溶液，過0.22 μm 濾膜后，采用高效分子排阻凝膠色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）進行分子量分析[26]。高效液相色譜儀為 Agilent 1260，分析柱為 Ohpak SB - 804HQ（8.0 mm×300 mm）和色譜柱 TSKgel G3000SWxl（7.8 mm×300 mm），流動相為0.1 mol/L Na2SO4，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL，示差檢測器檢測。使用分子量為5 220、11 600、48 600、147 600、273 600、273 600 Da 的葡聚糖作為標準品，以葡聚糖標準品分子量的對數(shù)（lgM）為Y軸和保留時間（tR）為X軸作圖，得到回歸曲線方程為Y=-0.329 5X+10.349（R2=0.998 1）。根據(jù)標準曲線計算樣品分子量。

1.3.6 酵母葡聚糖的紅外光譜分析

將0.5 mg 酵母葡聚糖與150 mg 無水溴化鉀混合，并在干燥條件下壓制成片。使用傅里葉變換紅外光譜儀，以2 cm-1的數(shù)據(jù)采集速率記錄多糖的傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR），范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.7 NMR 分析水溶性酵母葡聚糖結構

將不同條件下降解的水溶性酵母葡聚糖透析后凍干，取15 mg 樣品用500 μL D2O 反復凍融3 次后，用500 μL D2O 溶解，于25 ℃下測試其1H NMR、13C NMR。

1.3.8 水溶性酵母葡聚糖得率和產率計算

水溶性酵母葡聚糖得率（M，%）計算公式如下。

式中：ω1為不溶性酵母葡聚糖含量，%；ω2為水溶性酵母葡聚糖含量，%。

水溶性酵母葡聚糖產率（C，%）計算公式如下。

C=a/b× 100

式中：a為純化葡聚糖質量，g；b為酵母粉質量，g。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)結果均以平均值±標準差形式表示。根據(jù)多糖出峰時間及峰面積，利用Origin 2018 計算多糖分子量及相對含量，根據(jù)多糖的氫譜和碳譜，通過MestReNova 軟件標定多糖化學位移，并計算各峰面積。

2 結果與分析

2.1 酵母葡聚糖的提取純化

酵母葡聚糖分離過程中各組分的產率和組成見表1。

表1 葡聚糖分離過程中各組分的產率和組成Table 1 Yields and compositions of components of glucan during separation%

由表1所示，該酵母粉中多糖含量占43.67%，蛋白質含量占42.08%。經過酶水解處理后，獲得的葡聚糖中多糖含量為72.72%，蛋白質含量為19.45%；經過0.5 mol/L NaOH 弱堿處理后，葡聚糖純度得到明顯提升，多糖含量可達95.43%，蛋白質含量下降至4.60%。顏色為灰白色，產率為14.75%。說明通過酶解處理和弱堿處理可以明顯提高不溶性酵母葡聚糖的純度。

2.2 0.1 MPa 高溫降解條件對水溶性酵母葡聚糖得率的影響

將不溶性酵母葡聚糖5 mg/mL 濃度懸浮在水中，在120、135 ℃下降解后，采用硫酸苯酚法測得水溶性酵母葡聚糖得率。不同溫度、pH 值和時間條件下降解葡聚糖獲得的水溶性酵母葡聚糖得率見表2。

表2 不同溫度、pH 值和時間對水溶性酵母葡聚糖得率的影響Table 2 Effects of different temperature，pH，and time on yield of water-soluble glucan

由表2 可知，在120 ℃，pH3、4、5 條件下降解0.5、1.0、1.5 h，隨著pH 值降低、降解時間延長，水溶性酵母葡聚糖得率逐漸提高，但是在pH3、1.5 h 條件下，得率依然低于20%，說明120 ℃條件下不溶性酵母葡聚糖降解率很低。而在135 ℃時，在同樣的溫度和時間條件下，水溶性酵母葡聚糖得率超過20%。說明水溶性葡聚糖降解需要135 ℃高溫降解。在135 ℃條件下，水溶性酵母葡聚糖得率隨著pH 值的降低而增加，pH5和pH4 條件下水溶性酵母葡聚糖得率低于pH3。pH3時，降解2.0 h 時水溶性酵母葡聚糖得率上升到71.25%，再延長降解時間到6.0 h，水溶性葡聚糖得率僅僅上升到79.89%。在pH5 時，4.0 h 之內水溶性葡聚糖的得率不足50%，但是時間延長到6.0 h，水溶性葡聚糖的得率升高到77.83%。說明在pH4 和pH5時，延長降解時間，也可以提高水溶性葡聚糖得率。

2.3 高溫高壓降解條件對水溶性酵母葡聚糖分子量分布的影響

HPSEC 法僅能分析獲得水溶性酵母葡聚糖的分子量，根據(jù)水溶性酵母葡聚糖的吸收峰面積，還可以比較出水溶性酵母葡聚糖的含量差異。圖1 為135 ℃不同pH 值和時間條件下獲得的水溶性酵母葡聚糖分子量，表2 為135 ℃不同pH 值和時間條件下的降解產物分子量分布。

圖1 HPSEC 分析135 ℃不同pH 值和時間對水溶性酵母葡聚糖分子量的影響Fig.1 HPSEC analysis of the effect of different pH and time on molecular weight of water-soluble glucan at 135 ℃

由表3 可知，在135 ℃條件下，隨著降解時間的延長，峰面積逐漸增大，說明上清液的多糖含量逐漸提高，這一結果與硫酸苯酚法測定得率結果相符。

表4 不同降解條件下β-（1，3）和β-（1，6）的比例積分Table 4 Proportional integrals of β-（1，3）and β-（1，6）under different degradation conditions

在pH5 條件下降解0.5～4.0 h 時，僅有少量分子量大于30 kDa 和小于1 kDa 的水溶性酵母葡聚糖溶出。當時間延長至6.0 h 后，從0.2～2 000 kDa 水溶性酵母葡聚糖大量產生，水溶性酵母葡聚糖的得率顯著增加，且分子量分布較廣。在pH4 條件下，降解1.0 h 時就有0.6～300 kDa 的多糖溶出，降解4.0～6.0 h 已經有0.2～2 000 kDa 的水溶性酵母葡聚糖大量產生，葡聚糖分子量分布比較廣。6.0 h 時葡聚糖產率最高。pH 3 條件下降解1.5 h 之后，5 kDa 以下水溶性酵母葡聚糖產生，繼續(xù)降解至4.0 h 和6.0 h，無高分子量葡聚糖產生，只有分子量2～4 kDa 的低分子量水溶性酵母葡聚糖產生，說明pH3 條件劇烈，導致大分子葡聚糖發(fā)生降解，使得在pH3 條件下獲得的水溶性酵母葡聚糖分子量較小，因此135 ℃、pH3 時是獲得分子量小于5 kDa 葡寡糖的最佳條件。Ishimoto等[23]通過加熱至135 ℃降解不溶性酵母葡聚糖，但是所需時間長，僅能獲得大分子量水溶性酵母葡聚糖，且易發(fā)生褐變，而本研究通過高溫高壓控制pH 值的方法可以得到純白的低分子量葡聚糖和葡寡糖。因此，綜合水溶性酵母葡聚糖得率與分子量的結果，選擇135 ℃、pH3條件下降解0.5 h 和2.0 h、pH4 條件下降解2.0 h 和6.0 h、pH5 條件下降解2.0 h 和6.0 h 這6 個條件進行葡聚糖的結構表征，以探究高溫高壓降解對其結構的影響。

2.4 水溶性酵母葡聚糖的紅外結果分析

傅里葉變換紅外光譜是檢測生物大分子結構變化的有效方法，對高溫高壓降解前后的葡聚糖樣品進行紅外光譜分析，紅外光譜結果如圖2所示。

圖2 降解前后酵母葡聚糖的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of yeast glucan before and after degradation

由圖2 可知，3 389 cm-1處為多糖的羥基伸縮振動，2 983 cm-1處為糖類的特征峰C—H 伸縮振動，1 646 cm-1處為C—O 伸縮振動，降解產物與不溶性酵母葡聚糖相比，該峰吸收強度大幅度減小，可以看出高溫高壓降解是通過斷裂其糖苷從而減小酵母葡聚糖分子量。1 373 cm-1處為C—H 的變角振動，是糖類的特征吸收峰，1 160、1 078、1 036 cm-1處吸收峰為C—O—C 非對稱伸縮振動、C—OH 伸縮振動和C—O、C—C伸縮振動[27]。892 cm-1處的吸收峰證明其為β-葡聚糖[28]。不同降解條件下樣品和水溶性酵母葡聚糖的紅外光譜結果十分相似，表明葡聚糖雖然經過降解后分子量發(fā)生了改變，但未影響其主要官能團。

2.5 水溶性酵母葡聚糖NMR 分析

對不同條件下降解的水溶性酵母葡聚糖進行1H NMR 和13C NMR 分析見圖3 和表3。

圖3 酵母葡聚糖的NMR 譜圖Fig.3 NMR spectra of yeast glucan

如圖3A所示，C-1 峰化學位移在102～103，且圖3B 中H-1 特征峰化學位移在4.5～4.8，可以判斷出葡聚糖的糖苷鍵構型為β 型[29-30]。在1H 譜中4.2～4.3 歸屬為側鏈β-（1，6）鏈接的H-1 特征峰[31]，可以看出降解前后的葡聚糖主要類型為β-（1，3）鏈接。根據(jù)4.5～4.8 的β-（1，3）鏈接的H-1 與4.2～4.3 之間的β-（1，6）鏈接的H-1 峰面積可大致計算出β-（1，6）鏈接的比例，如表3所示，不同降解條件β-（1，3）和β-（1，6）的比例積分在0.5～1.0 之間，這一結果與Ishimoto 等[23]結論一致。pH 值越低，比值越小，β-（1，6）葡聚糖支鏈所占比例下降，說明在降解過程中，部分β-（1，6）葡聚糖被降解。pH 值越低，β-（1，6）葡聚糖降解損失越多。對圖3A碳譜中的峰進行歸屬，發(fā)生取代的C-3 向低場偏移，特征峰位于83.99 處[32]，化學位移73.26、68.04、75.57、60.63 處觀察到的化學鍵分別歸屬于β-（1，3）-D-葡聚糖的C-2、C-4、C-5 和C-6[33-34]。而68～70 為β-（1，6）-D-葡聚糖鏈接的單元上的C-6，其中69.54 處為與β-（1，3）主鏈直接鏈接的β-（1，6）-D-葡聚糖上的C-6[35]。

3 結論

酵母葡聚糖具有豐富的生物活性，本研究以啤酒酵母粉為原料通過超聲輔助酶法結合弱堿處理，制備出純度高達95.43%、產率14.75% 的灰白色不溶性酵母葡聚糖。探究高溫高壓降解制備水溶性啤酒酵母葡聚糖和葡寡糖的降解條件，結果表明在120 ℃條件下增溶效果不明顯，在135 ℃條件下，pH 值在3～5 之間降解0.5～6.0 h 可以有效地降解不溶性酵母葡聚糖，定向制備水溶性酵母葡聚糖和葡寡糖，高溫高壓降解在135 ℃，pH3 降解3.0～6.0 h，主要得到葡寡糖，得率可達79.89%。pH5 條件下降解4.0～6.0 h，pH4 降解1.0～6.0 h，有0.2～2000 kDa 的高分子量的水溶性酵母葡聚糖大量產生。傅里葉變換紅外光譜和核磁共振波譜結果發(fā)現(xiàn)，高溫高壓熱降解后該葡聚糖仍以β-（1，3）為主鏈、以β-（1，6）為支鏈，但是pH 值越低，β-（1，6）為支鏈含量越低。本方法制備出水溶性酵母葡聚糖和葡寡糖，可以獲得顏色純白且純度較高的水溶性酵母葡聚糖。

研究結果證明，高溫高壓熱降解法綠色環(huán)保，操作簡單可控，適用于工業(yè)化生產，且不會破壞其原本結構，可為酵母葡聚糖的開發(fā)利用提供技術參考。