黑青稞γ-氨基丁酸提取工藝優(yōu)化及體外降血糖活性

孫康娜，丁紅艷，李巖，院珍珍，2*，韓麗娟，葉英

（1.青海大學農(nóng)牧學院，青海西寧 810016；2.青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海西寧 810016）

青稞（HordeumvulgareLinn.var.nudumHook.f.）屬禾本科大麥屬，因其籽粒裸露、內(nèi)外穎殼分離，所以又被稱為裸大麥[1]。它作為青藏高原最具民族特色的農(nóng)作物，具有“三高兩低”即高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪、低糖的特性，是一種營養(yǎng)價值較高的農(nóng)作物[2]。

近年來國內(nèi)外在青稞的營養(yǎng)價值、活性成分等方面開展了研究，進一步推動了青稞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)、功能性氨基酸，是主要存在于微生物和動植物體內(nèi)的天然活性成分[3]。它是動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一[4]。GABA 在健康和糖尿病動物個體水平口服都具有促進胰島素分泌和降低空腹血糖的功能[5]。GABA 生理功能較多，不僅能抗應激、解毒、抗癌[6]、治療帕金森、促進乙醇代謝、調(diào)節(jié)生殖功能[7]，還是大腦中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在癲癇的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[8]，兼具鎮(zhèn)靜、抗焦慮或抗驚厥作用[9]，可以改善色素沉著過度障礙[10]，在治療重度抑郁癥方面也具有積極作用[11]。此外，GABA 能通過離子型GABA（A）受體和代謝性GABA（B）受體影響多種胰島細胞類型的活性[12]，在干酪乳桿菌對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導的小鼠結腸炎的有益作用中起關鍵作用[13]。在植物中GABA 也具有積極作用，葉面施用GABA 或GABA 的代謝工程產(chǎn)物可以降低作物生產(chǎn)中農(nóng)藥污染風險[14]；外源GABA 通過增強GABA 分流和次生細胞壁生物合成，提高蘋果幼苗對長期干旱脅迫的抵抗力[15]；GABA 能有效緩解蘋果幼苗中的鎘（Cd）毒性[16]；外源GABA 對紫花苜蓿幼苗耐堿脅迫有正向作用[17]。

國內(nèi)外學者在富含GABA 原料的選擇、高產(chǎn)GABA 微生物的分離鑒定等方面取得顯著的進展，目前已有學者研究不同因素對青稞中GABA 含量的影響，通過分析提取時間、提取溫度、料液比、pH 值、青稞種類等因素對GABA 含量的影響，得到最優(yōu)提取工藝，使GABA 含量達到更高[18]。從米糠中提取GABA 所需的條件是用水作為提取介質(zhì)，在50 ℃的溫度下攪拌米糠4 h，該方法可為提取GABA 提供良好的條件[19]。

α-淀粉酶抑制劑可以抑制餐后血糖升高和胰島素的分泌[20]。α-葡萄糖苷酶抑制劑具有抑制腸道細菌、保持血糖平衡等作用[21]，α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑可抑制糖原、淀粉等物質(zhì)水解成葡萄糖，延緩糖原、淀粉等物質(zhì)在小腸中被吸收，能有效降低餐后血糖水平[22]。故可以通過α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率測定降血糖活性。

本試驗研究提取溫度、提取時間、液料比對黑青稞中GABA 含量的影響，在單因素試驗的基礎上，進行響應面試驗探究最優(yōu)提取工藝參數(shù)，并進行體外降血糖活性研究，以期為推進高原健康食品發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑青稞粉：青海漢和生物科技股份有限公司；γ-氨基丁酸標準品：上海源葉生物科技有限公司；四硼酸鈉（分析純）：上海儀電科學儀器股份有限公司；苯酚、次氯酸鈉、可溶性淀粉溶液（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸（分析純）：上海展云化工有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（分析純）：索萊寶生物科技有限公司；α-淀粉酶（酶活力50 U/mg）：合肥博美生物有限公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力70 萬U/mL）：上海吉至生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋（HH-6 型）：上海比朗儀器有限公司；恒溫振蕩器（THZ-82 型）：常州國華電器有限公司；臺式高速離心機（H/T16MN 型）：湖南赫西儀器裝備有限公司；紫外可見分光光度計（UN-2600 型）：日本島津公司；渦旋振蕩器（Xw-80A 型）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；全波長酶標儀（MULTISKAN Sky 型）：北京平利洋經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GABA 標準曲線的繪制

參考劉元等[3]的方法，并稍作修改，稱取一定量的GABA 標準品用去離子水配制成1 mol/L 的GABA 標準溶液，準確吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL 于10 mL 帶蓋離心管中，分別加蒸餾水0.95、0.90、0.85、0.80、0.75 mL 使每個離心管中的溶液達到1 mL，得到不同濃度的GABA 標準液，從配好的標準液中取1.0 mL 到另一個帶蓋離心管中，在離心管中先加入硼酸鹽緩沖液（pH9.18）0.4 mL，然后加入6% 苯酚溶液1 mL，再加入5.25% 次氯酸鈉溶液1.5 mL，將其充分混勻后馬上放入水浴鍋中沸水浴10 min，然后取出冰浴5 min，之后加入60% 乙醇溶液2 mL，在645 nm 處測定溶液的吸光值。

1.3.2 單因素試驗

考察不同提取溫度、提取時間、液料比對GABA含量的影響，并確定各因素的最佳水平。

1.3.2.1 提取溫度對黑青稞中GABA 含量的影響

參考趙大偉等[23]的方法，并稍作修改，稱取（500±5）mg 黑青稞粉放置于10 mL 帶蓋離心管中，在每管中加5 mL 蒸餾水，固定液料比為10∶1（mL/g），將試管放入振蕩器，設置轉速為2 000 r/min，時間為90 min，分別在40、50、60、70、80℃條件下進行振蕩處理。振蕩結束后，離心10 min（6 000 r/min），取1 mL 上清液于另一離心管中，待測。

1.3.2.2 提取時間對黑青稞中GABA 含量的影響

參考趙大偉等[23]的方法，并稍作修改，稱取（500±5）mg 黑青稞粉放置于10 mL 帶蓋離心管中，每個離心管加5 mL 蒸餾水，固定液料比為10∶1（mL/g），將試管放入振蕩器，設置轉速為2 000 r/min，固定溫度為60 ℃，在30、60、90、120、150 min 條件下進行振蕩處理。振蕩結束后，離心10 min（6 000 r/min），取1 mL 上清液于另一離心管中，待測。

1.3.2.3 液料比對黑青稞中GABA 含量的影響

參考趙大偉等[23]的方法，并稍作修改，稱?。?00±5）mg 黑青稞粉放置于10 mL 帶蓋離心管中，固定時間為90 min、溫度為60 ℃，設置液料比分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1（mL/g），將試管放入振蕩器，設置轉速為2 000 r/min，振蕩結束后，離心10 min（6 000 r/min），取1 mL 上清液于另一離心管中，待測。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）為自變量，以GABA 含量（Y）為響應值，利用Box-Behnken 中心設計法則[24]，確定黑青稞中GABA 提取的最佳工藝條件，并進行驗證試驗以檢驗結果的可靠性。

通過單因素試驗結果確定響應面因素水平設計如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 體外降血糖活性測定

1.3.4.1 黑青稞中GABA 對α-淀粉酶的抑制活性試驗參考張燕麗[21]的方法，并稍作修改，根據(jù)響應面試驗的最佳條件提取GABA，取150 μL 未處理青稞粉溶液和富集GABA 溶液并添加0.5 mg/mL 的α-淀粉酶液150 μL，充分混勻后，放入水浴鍋在37 ℃條件下孵育10 min，然后將250 μL 的1% 可溶性淀粉溶液加入到混合液中，并在37 ℃條件下繼續(xù)孵育10 min，加入500 μL 的3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）停止反應，在沸水浴中反應5 min。冷卻后取200 μL 于96 孔板中，使用酶標儀在540 nm 處測吸光值，每組重復測定3 次，取平均值。α-淀粉酶抑制率（X，%）按公式（1）計算。

式中：a為含葡萄糖苷酶溶液與待測樣本時所檢出的吸光值；b為含有待測樣本但不包括葡萄糖苷酶的溶液所測得的吸光值；c為含葡萄糖苷酶溶液但不含待測樣本所測得的吸光值。

1.3.4.2 黑青稞中GABA 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性試驗

參考張燕麗[21]的方法，并稍作修改，根據(jù)響應面試驗的最佳條件提取GABA，取0.05 mol/L（pH6.8）磷酸鹽緩沖液600 μL，加入20 mol/L 的4-硝基苯基-α-D-吡咯葡萄糖苷溶液300 μL 與40 μL 未處理青稞粉溶液和富集GABA 溶液，將其放置于37 ℃水浴條件下孵育10 min，然后加入0.2 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液52 μL，室溫條件下放置10 min 后再加入0.1 mol/L 的Na2CO31.65 mL 終止反應，在405 nm 的條件下測定終止液吸光值。反應體系中采用0.05 mol/L（pH6.8）磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）作為溶液及待測樣品的空白對照。每個樣品做3 個平行，并設置空白對照，取平均值。α-葡萄糖苷酶抑制率（Y，%）按公式（2）計算。

式中：a為含葡萄糖苷酶溶液與待測樣本時所檢出的吸光值；b為含有待測樣本但不包括葡萄糖苷酶的溶液所測得的吸光值；c為含葡萄糖苷酶溶液但不含該樣本時所測得的吸光值；d為不包括葡萄糖苷酶的溶液與待測樣本時所檢出的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

同一處理的樣品組做3 組平行，使用Excel 2016、Origin 2021 軟件進行數(shù)據(jù)處理、分析及作圖，響應面試驗結果利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 GABA 含量分析標準曲線

在室溫條件下，測定處理過的GABA 標準溶液在645 nm 處的吸光值，結果見圖1。

圖1 GABA 標準曲線Fig.1 Standard curve of GABA

由圖1 可知，在645 nm 的條件下GABA 含量和吸光值的線性關系為Y=1.954 2X-0.042 8，R2=0.996 8。為了讓重復性符合要求，本次試驗重復測定3 次，使得其結果穩(wěn)定，準確性高。因此，采用該方法對黑青稞提取液的GABA 含量進行測定可行。

2.2 黑青稞GABA 提取單因素試驗

2.2.1 提取溫度對GABA 含量的影響

提取溫度對GABA 含量的影響見圖2。

圖2 提取溫度對GABA 含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on GABA content

由圖2 可知，當提取溫度從40 ℃升高到60 ℃時，黑青稞中GABA 含量隨著提取溫度的升高而升高，在60 ℃時GABA 含量達到峰值（0.273±0.017）mg/mL；提取溫度進一步升高，黑青稞中GABA 含量呈下降趨勢。提取溫度為40 ℃時，黑青稞中GABA 含量最低，僅為（0.103±0.013）mg/mL。這可能是因為提取溫度未達到60 ℃時，水溶液對GABA 的溶解度較低，從而導致GABA 含量比峰值低，提取溫度高于60 ℃使得GABA 發(fā)生降解，在一定程度上破壞了黑青稞提取液中的GABA，使得GABA 分解、氨基脫離，也可能是因為分子間發(fā)生劇烈碰撞會產(chǎn)生能量，這部分能量使GABA 的氨基解離，所以提取液中的GABA 含量下降[24]。因此選擇提取黑青稞GABA 提取溫度50、60、70 ℃進行響應面優(yōu)化試驗。

2.2.2 提取時間對GABA 含量的影響

提取時間對GABA 含量的影響見圖3。

圖3 提取時間對GABA 含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on GABA content

由圖3 可知，控制其它3 個變量，逐漸延長提取時間，黑青稞中GABA 含量隨著提取時間的延長而升高，在90 min 時黑青稞中GABA 含量達到峰值（0.289±0.007）mg/mL；提取時間進一步延長，黑青稞中GABA 含量呈下降趨勢；當提取時間為150 min 時，黑青稞中GABA 含量最低，僅為（0.218±0.006）mg/mL。這可能是因為提取時間太短，黑青稞中GABA 未完全溶出，導致GABA 含量較少，長時間的浸提使得GABA被破壞，從而導致GABA 含量比峰值低。因此選擇黑青稞GABA 提取時間60、90、120 min 進行響應面優(yōu)化試驗。

2.2.3 液料比對GABA 含量的影響

液料比對GABA 含量的影響見圖4。

圖4 液料比對GABA 含量的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on GABA content

由圖4 可知，隨著溶劑體積增加，黑青稞粉沒有完全浸濕，黑青稞中的GABA 沒有增加，黑青稞中GABA含量先增加后減小，在液料比為3∶1（mL/g）時，黑青稞中GABA 含量達到峰值（0.316±0.015）mg/mL；液料比為6∶1（mL/g）時，黑青稞中GABA 含量最低，僅為（0.144±0.012）mg/mL。這可能是因為溶劑體積過小，黑青稞粉沒有完全浸濕，黑青稞中的GABA 沒有完全被溶出；溶出的GABA 在液料比為3∶1（mL/g）時達到最大，繼續(xù)增加溶劑用量，會溶解出其他物質(zhì)，所以GABA 含量降低。最終選擇液料比2∶1、3∶1、4∶1（mL/g）進行響應面優(yōu)化試驗。

2.3 黑青稞GABA 提取工藝響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果

以提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）為影響因子，以黑青稞中GABA 含量（Y）為響應值，采用Box-Behnken 模型設計出包括17 次試驗的提取方案[25]，測定每組試驗條件下黑青稞GABA 含量，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodology

2.3.2 回歸模型的建立與顯著性分析

將表2 得到的試驗結果進行方差分析，得到Y關于A、B、C的二次多項回歸擬合模型為Y=0.34+9.250×10-3A-5.375×10-3B+0.017C-0.012AB+2.250×10-3AC+5.500×10-3BC-0.11A2-0.096B2-0.075C2。

方差分析結果見表3。

表3 回歸方程試驗方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for regression equations

由表3 可知，回歸擬合模型的p＜0.01，說明該模型極顯著。失擬項=0.861 表現(xiàn)出不顯著，說明擬合效果比較好。且R2=0.968 6＞0.9，R2Adj=0.928 3；C.V.=11.77%，可得結論：模型的擬合結果符合實際試驗結果。因此該試驗模型的設計比較合理，可以擬合試驗數(shù)據(jù)，能用于黑青稞中GABA 提取工藝的分析。

2.3.3 交互作用分析

通過影響因素之間的響應面圖和等高線圖來進行分析，響應面圖可以形象直觀地反映出兩因素之間的交互作用。通過Design-Expert 8.0.6 軟件，各試驗因素交互作用對結果影響的響應面及等高線見圖5～圖7。

圖5 提取溫度和提取時間對GABA 含量影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots of the effects of temperature and time on GABA content

由圖5 可知，A與B的交互作用的三維圖最陡峭，曲面變化最為明顯，等高線圖呈橢圓，說明A、B的交互作用對黑青稞中GABA 含量在三者中影響最大。

由圖5、圖6、圖7 的等高線圖可知，提取溫度和提取時間對黑青稞中GABA 的提取量的影響顯著大于提取溫度和液料比與提取時間和液料比對黑青稞中GABA 的提取量的影響。其中，圖6 的等高線比圖5、圖7 的等高線更接近于圓形。因此，兩因素相互作用對黑青稞中GABA 的含量影響最小的是提取溫度和液料比。根據(jù)表3 的數(shù)據(jù)可以看出，AB相互作用的p值最小，數(shù)值為0.368；AC相互作用的p值最大，數(shù)值為0.859；BC相互作用的p值介于兩者之間，數(shù)值為0.666。所以兩因素相互作用對黑青稞中GABA 含量影響大小依次排序為AB＞BC＞AC[26]。

圖6 提取溫度和液料比對GABA 含量影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots of the effects of temperature and liquid-material ratio on GABA content

圖7 提取時間和液料比對GABA 含量影響的響應面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots of the effects of time and liquid-material ratio on GABA content

2.3.4 響應面驗證試驗

響應面分析得到，在提取溫度為60 ℃、提取時間為90 min、液料比3∶1（mL/g）條件下，預測的最優(yōu)黑青稞GABA 含量為0.341 mg/mL。為了檢驗響應面法得到的優(yōu)化數(shù)據(jù)的可靠性，進行驗證試驗，做3 次平行試驗，取平均值，最后計算GABA 含量為（0.338±0.012）mg/mL，與理論上預測的最優(yōu)值0.341 mg/mL 基本相符，驗證了黑青稞中GABA 含量回歸模型的有效性，所以黑青稞γ-氨基丁酸含量可以采用該模型進行分析。

2.4 黑青稞GABA 體外降血糖活性研究結果

體外降血糖活性分析見表4。

表4 體外降血糖活性分析Table 4 Hypoglycemic activity in vitro

由表4 可知，根據(jù)響應面試驗的最佳條件提取GABA，取未處理青稞粉溶液和富集GABA 溶液進行α-淀粉酶的抑制活性試驗，富集GABA 溶液對α-淀粉酶的抑制效果更佳，其抑制率為（72.41±0.43）%，未處理青稞粉溶液的抑制率為（22.82±0.33）%。

由表4 可知，根據(jù)響應面試驗的最佳條件提取GABA，取未處理青稞粉溶液和富集GABA 溶液進行α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗，富集GABA 溶液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果更佳，其抑制率為（82.29±0.38）%，未處理青稞粉溶液的抑制率為（41.46±0.43）%。

以上試驗結果表明，黑青稞中GABA 對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶能夠產(chǎn)生抑制效果，具有良好的體外降血糖作用，為研發(fā)功能性食品和研究以青稞為原料的產(chǎn)品提供了理論基礎。

3 結論

本試驗以黑青稞為原料，以黑青稞中GABA 含量為響應指標，探究提取溫度、提取時間、液料比對GABA 含量的影響，并進行體外降血糖活性研究。以單因素試驗為基礎，進行響應面試驗，結果表明黑青稞提取GABA 最佳工藝參數(shù)：提取溫度為60 ℃、提取時間為90 min、液料比3∶1（mL/g），在此條件下，黑青稞中GABA 含量為（0.338±0.012）mg/mL，與模型預測值0.341 mg/mL 基本相符。根據(jù)響應面試驗的最佳條件提取黑青稞中GABA，結果發(fā)現(xiàn)富集GABA 溶液的體外降血糖效果更佳，黑青稞中GABA 對α-淀粉酶的抑制率為（72.41±0.43）%，對α-葡萄糖苷酶抑制率為（82.29±0.38）%，具有良好的降血糖效果。