苦竹筍發酵工藝條件優化及成品揮發性成分分析

張長貴，鄭耀偉，潘婉舒，張耕

（1.宜賓學院農林與食品工程學部，四川宜賓 644000；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；3.四川彭州廣樂食品有限公司，四川彭州 611930）

苦竹筍又名涼筍、甘筍，是竹亞科苦竹（Pleioblastusamarus）的幼嫩芽，在我國的南方地區廣泛栽種和分布[1-2]。苦竹筍美味可口，營養豐富，素有“寒土山珍”之美稱，屬于綠色森林蔬菜。苦竹筍味苦，既是一種常見的菜肴，也是一種中藥材，兼具食用和藥用價值[3-4]。苦竹筍中富含生物堿類、酚類、黃酮類等生物活性物質，有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖和增強免疫調節等功能[5-7]，還含有豐富的膳食纖維，具有促進腸胃蠕動、降膽固醇和調節腸道菌群的作用[8-10]。

竹筍的加工和食用方法很多，除了鮮食烹飪，還有許多其他的加工方法，例如罐裝、腌制、發酵、冷凍、干制等[11]，其中腌制和發酵是常見的加工方式。鄭炯等[12]和李梅等[13]分別研究了麻竹筍腌制及其風味物質、毛竹筍在不同預處理方式條件下發酵過程中的營養物質變化；盧宏皓等[14]對竹筍發酵過程中的化學成分變化進行了研究；呂朝燕等[15]研究了鹽度對鹽腌煮干制方竹筍品質的影響；陳雪蓮等[16]研究了益生菌發酵竹筍的發酵液配方和滅青工藝條件。由此可見，目前研究主要集中在對竹筍腌制和發酵過程中理化成分、風味物質變化以及鹽度、竹筍預處理方式對品質的影響，而對竹筍的發酵工藝條件的研究鮮見報道，尤其是對苦竹筍的低鹽發酵工藝技術研究報道鮮少。

低鹽發酵不但可以改善竹筍的風味和品質，而且比非發酵竹筍更加有益于健康，有改善腸道中的微生物菌群、增強免疫力等作用[16]。四川竹資源豐富，特別是有川南竹產業集群核心區域美譽之稱的宜賓具有豐富的苦竹筍資源，因此，本試驗以苦竹筍為原料，通過自然發酵、接種老壇水發酵、接種乳酸菌粉發酵3 種發酵方式的比較，篩選出最優發酵方式，再采用最優的發酵方式對苦竹筍低鹽發酵條件進行優化并對揮發性香氣成分進行分析，旨在為苦竹筍的低鹽發酵生產和加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要材料

苦竹筍、食鹽、蔗糖、高度白酒、八角、香葉等香辛料：市售；乳酸菌粉：北京川秀國際貿易有限公司；老壇水：取自宜賓學院食品工藝學實驗室；無水檸檬酸（食品級）：濰坊英軒實業有限公司；氯化鈣（食品級）：河南石藥集團維生藥業有限公司。

1.1.2 主要試劑

鹽酸、硼酸鈉：四川西隴化工有限公司；氫氧化鈉：重慶川東化工有限公司；2-6-二氯靛酚、亞鐵氰化鉀：上海展云化工有限公司；鹽酸萘乙二胺、鄰苯二甲酸氫鉀、乙酸鋅：天津化學試劑有限公司；亞硝酸鈉、冰乙酸、對氨基苯磺酸：成都科龍化工試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

7890A/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀：安捷倫科技（中國）有限公司；ZB-300×2 真空包裝機：上海至奔包裝機械有限公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭：美國Supelco 公司；SYG-6 水浴鍋：常州朗月儀器有限公司；T6 新世紀紫外分光光度計：北京普析儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

原料選擇→預處理（預煮、護色、保脆等）→冷卻→漂洗→裝壇（加食鹽、蔗糖、香辛料）→密封→發酵→稱量裝袋→真空封口→殺菌→成品。

1.3.2 原料選擇與預處理

選擇新鮮、無病蟲害的苦竹筍，將竹筍剝殼、切分，切分的規格為長40 mm、寬10～20 mm 的條塊狀，然后置于0.2% 檸檬酸和0.3% 氯化鈣的混合溶液中預煮后快速冷卻，瀝干水分備用。

1.3.3 發酵方式篩選

自然發酵：設定筍水比為1∶2（g/mL），先在泡菜壇中加入飲用水，然后添加飲用水質量的4% 食鹽、3%蔗糖和適量香辛料混勻，再把預處理好的苦竹筍裝入壇中，最后在壇面加適量的高度白酒，蓋上壇蓋，在室溫（20 ℃左右）下自然發酵。

接種乳酸菌發酵（以下簡稱乳酸菌發酵）：設定筍水比為1∶2（g/mL），先在泡菜壇中加入飲用水，然后添加飲用水質量的0.10%乳酸菌粉（含植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌，3 種菌的總含菌量1.0×109CFU/g）、4% 食鹽、3% 蔗糖和適量香辛料混勻，再把預處理好的苦竹筍裝入壇中，最后在壇面加適量的高度白酒，蓋上壇蓋，在室溫（20 ℃左右）下發酵。

接種老壇水發酵（以下簡稱老壇水發酵）：設定筍水比為1∶2（g/mL），先在泡菜壇中加入飲用水，然后添加飲用水質量的6%老壇水、4%食鹽、3%蔗糖和適量香辛料混勻，再把預處理好的苦竹筍裝入壇中，最后在壇面加適量的高度白酒，蓋上壇蓋，在室溫（20 ℃左右）下發酵。

在發酵過程中，定期對以上3 種發酵方式取樣，進行感官評價和理化指標測定，通過比較確定最佳發酵方式。

1.3.4 發酵條件的優化

采用1.3.3 篩選出的發酵方式，利用單因素試驗和正交試驗相結合的試驗方法，篩選最佳發酵工藝條件。

1.3.4.1 單因素試驗

采用1.3.3 方法中的乳酸菌發酵法，基礎條件為食鹽添加量4%、乳酸菌粉接種量0.10%、蔗糖添加量3%、發酵時間5 d。各單因素變量設定為食鹽添加量3%、4%、5%、6%、7%、8%，蔗糖添加量1%、2%、3%、4%、5%、6%，乳酸菌粉接種量0.04%、0.07%、0.10%、0.13%、0.16%、0.19%，發酵時間3、4、5、6、7、8 d。單因素試驗的筍水比為1∶2（g/mL），并以發酵苦竹筍的總酸含量和感官品評分為評價依據，分別確定食鹽添加量、蔗糖添加量、乳酸菌粉接種量、發酵時間。

1.3.4.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，采用L9（34）正交設計，正交試驗的因素水平見表1。

表1 正交試驗的因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 感官評價方法和標準

評價方法：感官評價指標包括色澤、香氣、質地、滋味，感官評價小組由10 名食品專業同學組成，且感官評價小組成員事先接受了科學的感官評價培訓。感官評價人員依照感官評分標準對樣品進行單獨評價，滿分100 分，取平均值作為總評分。感官評價標準[17]見表2。

表2 感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards

1.3.6 理化指標檢測

總酸含量參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中的酸堿指示劑滴定法進行測定；VC含量采用GB 5009.86—2016《食品安全國家標準食品中抗壞血酸的測定》中的2，6-二氯靛酚滴定法進行測定；亞硝酸鹽采用GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法測定。

1.3.7 產品揮發性成分分析

產品揮發性成分分析參考李梅等[18]、蔡玥等[19]的方法，作部分修改，具體如下。

1）樣品的處理：取3 g 粉碎后的苦竹筍樣品于20 mL 萃取瓶中，50 ℃條件下水浴30 min，用DVB/CAR/PDMS 萃取頭頂空吸附30 min，待吸附完成后進行氣相色譜-質譜聯用技術分析。

2）色譜條件：HP-5 色譜柱，載氣為99.999%氦氣，流速控制在0.8 mL/min。升溫程序為初始溫度40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min 升至100 ℃，再以3 ℃/min升至175 ℃，接著以10 ℃/min 升至215 ℃，保持10 min，最后以5 ℃/min 升至250 ℃，總程序61 min。柱箱溫度40 ℃，進樣口溫度250 ℃，進樣方式為分流。

3）質譜條件：離子源為電子電離源，離子源溫度230 ℃，接口溫度230 ℃；溶劑延遲時間2 min，掃描模式為全掃描；質量掃描范圍m/z 45～550。

1.4 數據的相關處理與分析

用Excel、Origin、SPSS19 軟件處理試驗數據和作圖；用Duncan 多重比較，對數據差異顯著性進行分析（P＜0.05，則差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 發酵方式的篩選

2.1.1 不同發酵方式對總酸含量的影響

總酸是反映產品發酵程度的特征性指標，發酵方式對總酸含量的影響見圖1。

圖1 發酵過程中總酸含量的變化Fig.1 Changes in total acid content during fermentation

由圖1 可知，總酸含量均隨發酵時間的延長而呈升高趨勢。發酵時間為2 d 時，老壇水發酵方式的總酸比其他2 種方式的總酸含量高，且三者之間的差異顯著（P＜0.05），原因可能是因為老壇水中本來含有乳酸。發酵時間為4 d 時，乳酸菌發酵方式比其他2 種發酵方式的總酸含量高，與自然發酵方式差異顯著（P＜0.05），但與老壇水發酵方式差異不顯著（P＞0.05）；發酵時間為6 d 時，乳酸菌發酵的總酸含量顯著高于老壇水發酵和自然發酵（P＜0.05）；發酵時間超過4 d 時，乳酸菌發酵方式的總酸含量最高；發酵時間超過8 d時，總酸含量增長趨緩，可能是隨著總酸的不斷累積，產酸菌生長繁殖受到一定程度的抑制[20]，所以產酸趨緩。3 種發酵方式相比，乳酸菌發酵更具有優勢，其總體產酸速度更快、產酸量更高。

2.1.2 不同發酵方式對維生素C 含量的影響

維生素C 是發酵過程中穩定性較差的還原性營養物質，是衡量產品營養品質的重要指標之一，發酵方式對維生素C 含量的影響見圖2。

圖2 發酵過程中VC 含量的變化Fig.2 Changes in VC content during fermentation

由圖2 可知，3 種發酵方式的維生素C 含量均呈下降的趨勢，其中自然發酵方式的VC含量下降速度最快，老壇水發酵方式次之，乳酸菌發酵方式的VC含量下降速度最緩慢。發酵時間為2 d 時，老壇水發酵方式的VC含量最高，且與自然發酵方式差異顯著（P＜0.05），原因可能與加入老壇水使得初期總酸含量較其他2 種發酵方式更高有關；發酵時間超過2 d 時，乳酸菌發酵的VC含量顯著高于其他2 種發酵方式（P＜0.05），且3 種發酵方式的VC含量下降速度均隨發酵時間的延長而趨緩，原因可能與總酸含量持續上升有關，因為產品的總酸含量越高VC穩定性越強[21]。3 種發酵方式相比，總體上，乳酸菌發酵方式的VC含量最高。

2.1.3 不同發酵方式對亞硝酸鹽含量的影響

亞硝酸鹽是判斷產品安全性的重要指標，發酵方式對亞硝酸鹽含量的影響見圖3。

圖3 發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes in nitrite content during fermentation

由圖3 可知，亞硝酸鹽含量均隨發酵時間的延長呈先上升后下降的趨勢。發酵時間為4 d 時，自然發酵方式的亞硝酸鹽含量最高，為（5.52±0.31）mg/kg，且含量顯著高于其他2 種發酵方式（P＜0.05）；乳酸菌發酵和老壇水發酵方式則在第6 天出現峰值，分別為（4.22±0.10）、（4.59±0.04）mg/kg，且此時老壇水發酵的亞硝酸鹽含量顯著高于乳酸菌發酵（P＜0.05）。亞硝酸鹽含量隨著發酵時間延長而下降，原因可能是隨著總酸的不斷積累，已生成的亞硝酸鹽在較高的酸性環境中被酸分解，也可能是乳酸菌產的亞硝酸還原酶分解亞硝酸鹽[22]。3 種發酵方式中，乳酸菌發酵的亞硝酸鹽含量在2 d 后比其他2 種方式均更低，所以乳酸菌發酵安全性更高。

2.1.4 不同發酵方式對感官品質的影響

感官評分是產品色澤、香氣、滋味、質地的綜合性評價指標，不同發酵方式對竹筍感官品質的影響見圖4。

圖4 不同發酵方式對感官評分的影響Fig.4 Effects of different fermentation methods on sensory score

由圖4 可知，3 種發酵方式的感官評分變化趨勢一致，均為先上升后下降，原因是發酵時間小于6 d時，苦竹筍發酵時間短，酸味弱、風味物質積累少，口感和風味均不佳；發酵時間超過6 d 時，苦竹筍發酵時間過長，總酸含量升高，使得苦竹筍過酸，且質地較軟、口感和風味變差。發酵時間為6 d 時，3 種發酵方式的感官評分均達到最高值，感官評分大小依次為乳酸菌發酵＞老壇水發酵＞自然發酵，且三者差異顯著（P＜0.05）。因此，3 種發酵方式相比，乳酸菌發酵的苦竹筍感官品質最優。

綜上，以總酸、VC、亞硝酸鹽含量和感官評分4 項指標作為評判標準，對比3 種發酵方式對苦竹筍發酵的影響，最終確定最優發酵方式為乳酸菌發酵。

2.2 乳酸菌發酵條件的確定

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 食鹽添加量對發酵苦竹筍品質的影響

食鹽添加量對發酵苦竹筍品質的影響見圖5。

圖5 食鹽添加量對感官評分和總酸含量的影響Fig.5 Effects of salt addition on total acid content and sensory score

食鹽在苦竹筍發酵過程中既影響產品的咸淡口味，又影響乳酸菌的生長繁殖。由圖5 可知，食鹽添加量越大，發酵苦竹筍的總酸含量越低，而感官評分隨食鹽添加量增加呈現先升高后降低趨勢。若食鹽添加量過大，不僅造成發酵苦竹筍口感偏咸，風味不協調，還抑制乳酸菌生長，影響發酵產酸速度，致使發酵時間延長。綜合考慮，食鹽添加量在5%較好，故選擇食鹽添加量4%、5%、6%進行正交試驗。

2.2.1.2 乳酸菌粉接種量對發酵苦竹筍品質的影響

乳酸菌粉接種量對發酵苦竹筍品質的影響見圖6。

圖6 乳酸菌粉接種量對感官評分和總酸含量的影響Fig.6 Effects of lactic acid bacteria powder addition on total acid content and sensory score

由圖6 可知，隨著乳酸菌粉接種量的增大，發酵苦竹筍的感官評分呈先升高后降低態勢，而總酸含量則一直呈上升趨勢，在乳酸菌粉接種量為0.10%時感官評分達到最大值。乳酸菌粉接種量過小，發酵速度緩慢，乳酸菌生長周期延長且受雜菌影響；乳酸菌粉接種量過大，乳酸菌產酸的速度快，發酵苦竹筍太酸、產品風味不佳。綜上所述，結合發酵苦竹筍感官評分和總酸含量，乳酸菌粉接種量0.10%為最佳發酵條件，因此選擇乳酸菌粉接種量0.07%、0.10%、0.13% 進行正交試驗。

2.2.1.3 發酵時間對發酵苦竹筍品質的影響

發酵時間對發酵苦竹筍品質的影響見圖7。

圖7 發酵時間對感官評分和總酸含量的影響Fig.7 Effects of fermentation time on total acid content and sensory score

由圖7 可知，發酵時間為3～5 d 時，其感官評分和總酸含量均隨發酵時間的延長而升高，而且在第5 天時，產品的酸味最適口，其感官評分最高；發酵時間超過5 d 時，隨著總酸含量繼續增加，發酵苦竹筍的酸味逐漸增強，適口性變差，感官評分逐漸降低。由此可見，發酵時間對發酵苦竹筍感官品質和總酸含量影響較大，因此綜合考慮，選擇發酵時間4、5、6 d 進行正交試驗。

2.2.1.4 蔗糖添加量對發酵苦竹筍品質的影響

糖是微生物生長所需的碳源，適量的添加蔗糖有助于發酵的順利進行，蔗糖添加量對發酵苦竹筍品質的影響見圖8。

從圖8 可以得出，發酵苦竹筍的感官評分和總酸含量隨著蔗糖添加量的增加，呈先升高后降低趨勢，可能是因為隨著蔗糖添加量的增加，供乳酸菌利用的碳源增多，其發酵速度加快，總酸含量增大，但是過多的加糖會使滲透壓過大，從而出現抑制發酵的負面效果，對發酵苦竹筍的風味也有一定的影響。綜合考慮，選擇蔗糖添加量2%、3%、4%進行正交試驗。

2.2.2 苦竹筍乳酸菌發酵的正交試驗

正交試驗結果用多指標加權綜合評分法計算[23]，感官評分與總酸含量2 個指標的權重系數分別為70%和30%，試驗結果的最終綜合評分=[各試驗組的感官評分均值/感官評分最大值）×70%×100+（各試驗組的總酸含量均值/總酸含量最大值）×30%×100]，每組做3 次平行試驗，計算平均值，試驗的加權評分結果及方差分析見表3、表4。

表4 正交試驗的方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test results

由表3 的R 值可知，各因素對綜合評分的影響程度順序為C＞A＞D＞B，各因素的最佳組合為A2B3C3D3。

由表4 可以看出，乳酸菌粉接種量無顯著性影響（P＞0.05），發酵時間、食鹽添加量和蔗糖添加量有極顯著性影響（P＜0.01）。

2.2.3 驗證試驗結果

因2.2.2 中的A2B3C3D3組合不在試驗組合內，需做驗證試驗，將A2B3C3D3與A2B2C3D1比較驗證，結果表明：A2B3C3D3綜合評分為93.51±2.03，A2B2C3D1綜合評分為95.43±2.31，因此，最優組合為A2B2C3D1，即食鹽添加量5%、乳酸菌粉接種量0.10%、發酵時間6 d、蔗糖添加量2%。

2.3 產品的揮發性成分分析

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）對發酵苦竹筍產品揮發性成分進行檢測，結果見表5，揮發性化合物種類見圖9。

圖9 揮發性化合物種類Fig.9 Categories of volatile compounds

表5 主要揮發性成分Table 5 Main volatile components

由表5 和圖9 可知，發酵苦竹筍產品共檢出25 種揮發性成分，其中包括烯烴類7 種，醇類5 種，酮類1 種，酯類7 種，酸類1 種，醚類1 種，其他3 種。

醇類物質具有芳香味，由表5 可知，芳樟醇、4-萜烯醇是本試驗發酵苦竹筍產品的主要醇類物質，芳樟醇具有花香、木香等多種香味，香味豐富，鄭炯等[24]也在腌制麻竹筍中檢測到這種物質，4-萜烯醇具有胡椒香和較淡的泥土香。酯類物質具有復合香味，由表5可知，發酵苦竹筍中揮發性成分中有辛酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯和水楊酸甲酯等化合物，其中辛酸乙酯為白蘭地酒香，正己酸乙酯為水果香，庚酸乙酯為菠蘿香，水楊酸甲酯為藥草清香[25]，水楊酸甲酯一般存在于天然品的各種精油中。由圖9 可知，發酵苦竹筍中烯烴類和酯類物質種類最多，由表5 可知，烯烴類物質包括D-檸檬烯、萜品油烯等7 類，其中D-檸檬烯和萜品油烯都具有檸檬的香味，松油烯具有柑橘香味，含量雖然不多，但對發酵苦竹筍風味有一定的影響。此外，在產品中檢測出的酸類物質只有乙酸一種，可能是因為產品發酵的時間短所致。醚類物質也只有一種，通過查閱相關文獻，發現這類物質可能是因為發酵過程中加入的香辛料帶來的。

發酵苦竹筍中不同揮發性化合物的相對含量見圖10。

圖10 不同揮發性化合物的相對含量Fig.10 Relative content of different volatile compounds

由圖10 可知，醇類、酯類、烯烴類、醚類、酸類、酮類和其他物質的相對含量依次為48.13%、33.69%、11.99%、4.16%、0.22%、0.19%和1.62%，相對含量最高的是醇類，說明醇類物質對發酵苦竹筍的風味有較大的影響，其次是酯類、烯烴類和醚類，而酸類和酮類的含量相對較少。

3 結論

通過對3 種不同發酵方式的比較，發現乳酸菌發酵方式的亞硝酸鹽含量較其他2 種發酵方式低，VC含量和感官評分更高，發酵產酸速度更快，故最佳發酵方式為乳酸菌發酵；最優工藝參數是食鹽添加量5%、乳酸菌粉接種量0.10%、發酵時間6 d、蔗糖添加量2%，加工的發酵苦竹筍經殺菌后測定其揮發性成分，檢出25 種成分，包括醇類物質5 種，酯類物質7 種，烯烴類物質7 種，醚類物質1 種，酸類物質1 種，酮類物質1 種，其他物質3 種，其相對含量依次為48.13%、33.69%、11.99%、4.16%、0.22%、0.19%、1.62%。