雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留分析方法

郭宏斌，彭侃霖，吳金玲，楊舒嫻，林玲，葉劍芝，劉元靖*，王曉芳

（1.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業農村部農產品加工質量安全風險評估實驗室（湛江），廣東湛江 524001；2.云南農業大學熱帶作物學院，云南普洱 665000）

氟蟲腈及其主要代謝物（氟甲腈、氟蟲腈砜與氟蟲腈亞砜）屬于苯基吡唑類殺蟲劑的一種[1-2]，具有接觸毒性、胃毒性和一定的內吸作用，該類藥物具有慢性神經毒性作用[3]，其中氟蟲腈被定為C 類致癌物質[4-5]。有研究表明，氟蟲腈在正常使用條件下，其代謝產物也有毒性，甚至有的遠高于母體[6-8]。

生產中，經常使用氟蟲腈滅殺蛋雞養殖過程中的蚜蟲和蠅類[9]。鑒于氟蟲腈及其代謝物的高風險及其高破壞性，氟蟲腈在雞蛋中的殘留也已引起世界各國的重視，各國均制定了嚴格的限量標準[10-11]。

Li 等[12]采用液相色譜串聯質譜法測定食品中的農藥殘留，分析方法不僅耗時長，對復雜基質雞蛋提取效率低。美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）[13]在開展雞蛋樣品農殘檢測中必須通過凈化和脫溶劑處理，才能用氣相色譜儀分析，以獲得較寬的農藥檢測譜[14-18]。超臨界流體抽提（supercritical fluid extraction，SFE）法在雞蛋檢測中可以免去后續的凈化過程，具有選擇性強的優勢[19]，但極性范圍窄，超臨界流體抽提法僅適用于檢測雞蛋食品中游離的膽固醇[20]。

本研究以雞蛋為研究對象，采用中性氧化鋁柱進行凈化，其成本顯著低于常規的C18 固相萃取柱、弗洛里矽硅土固相萃取柱，樣品前處理流程簡潔，以期建立一種高效、靈敏、可靠的雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

乙酸乙酯、正己烷、氧化鋁、丙酮等（均為分析純）：廣州化學試劑廠；水為超純水；正己烷、乙腈、甲酸、甲醇、乙酸銨（均為色譜純）：美國賽默飛世爾科技公司；弗洛里矽硅土固相萃取柱：美國Agilent 有限公司；氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜4 種農藥標準溶液：天津環境保護科學研究所，純度大于98%。

雞蛋：市售。

1.1.2 儀器設備

UNIVERAL 32R 離心機：日本Hettich 公司；Waters TQS 超高效液相色譜串聯質譜儀：美國沃特世公司；R-200 旋轉蒸發儀：上海申生；N-EVAP 氮吹儀：美國Organomation 公司；中性氧化鋁柱：農業農村部農產品加工質量安全風險評估實驗室（湛江）自制。

1.1.3 儀器條件

超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）色譜柱：Waters C18 柱（50 mm×2.1 mm×1.7 μm）；流動相：流動相A 為乙腈，流動相B 為5 mmol/L 的乙酸銨溶液；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量1 μL。梯度洗脫比例及流速見表1。

表1 梯度洗脫比例及流速Table 1 Mobile phase gradient and flow rate

質譜條件為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），負離子模式；離子源溫度：110 ℃；毛細管電壓：4.0 kV；脫溶劑氣溫度350 ℃；錐孔反吹氣流量50 L/h；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔電壓：40 V；掃描方式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）。每種農藥優化的去簇電壓和碰撞能量等質譜參數見表2。

表2 氟蟲腈及其代謝物特征離子質譜條件Table 2 UPLC-MS/MS parameters for fipronil and its metabolites

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

按照NY/T 1897—2010《動物及動物產品獸藥殘留監控抽樣規范》的要求，將采集的雞蛋樣品打碎，使用打蛋器進行充分混合和均勻漿化，混勻后的樣品將被存放在聚乙烯瓶中，并在-18 ℃的低溫條件下進行冷凍保存。

1.2.2 樣品提取

準確稱取經步驟1.2.1 勻漿的雞蛋樣品2 g，置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入2 g 無水硫酸鈉，加入5 mL 乙腈作為粗提取液，均質1 min 后，振蕩10 min，在4 ℃，以8 000 r/min 離心，提取上清液于雞心瓶中，得提取液；沉淀物用5 mL 乙腈重復提取1 次，合并兩次提取液，將2mL 異丙醇加入到溶液中，使用旋轉蒸發儀在50 ℃下進行濃縮，直至溶液接近干燥，得到濃縮液。接著，加入2.0 mL 的甲醇與二氯甲烷混合溶液（體積比為1∶99），將殘渣溶解，并充分混勻。得待凈化溶液。

1.2.3 樣品凈化

將中性氧化鋁柱首先使用5 mL 的甲醇進行預淋洗，接著用5 mL 的甲醇與二氯甲烷混合溶液（體積比為1∶99）進行活化。凈化后，利用15 mL 刻度離心管收集洗脫液。隨后，用5 mL 的甲醇與二氯甲烷混合溶液（體積比為1∶99）沖洗燒杯，并再次洗脫固相萃取柱，此步驟需重復一次。將含有10 mL 洗脫液的刻度離心管放置在氮吹儀上，于50 ℃水浴溫度下使用氮氣進行吹干處理，再使用乙腈與超純水的混合溶液（體積比為1∶1）將其定容至1.0 mL。在旋渦混合器上進行充分混合后，通過0.22 μm 有機濾膜進行過濾，最終供超高效液相色譜串聯質譜儀進行分析測定。

1.2.4 標準溶液配制

1.2.4.1 氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜4 種混合儲備液

分別吸取體積為1.00 mL、濃度為100 μg/mL 氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標準溶液至容量瓶，用甲醇溶解并定容至10.0 mL。此溶液每毫升相當于含氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜10.00 μg。

1.2.4.2 混合標準工作液

分別準確吸取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜4 種混合儲備液，將其稀釋成氟蟲腈及其代謝物含量分別為0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050 μg/mL的混合標準工作液。

1.3 回收率實驗

在篩選出的空白雞蛋液中，添加相應濃度的氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜4 種混合工作液，進行不同提取溶劑以及不同固相萃取條件下的回收試驗。

式中：R為回收率，%；C0為添加待測物的濃度，μg/kg；C1為實際測出待測物濃度，μg/kg；C2為空白基質待測物濃度，μg/kg。

1.4 數據統計

采用SPSS 軟件，對提取雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的6 個平行樣回收率的平均值數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 預處理方法的優化

2.1.1 樣品提取的優化

由于氟蟲腈及其代謝物的分子結構中有較多數量的極性原子，為了實現雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的有效提取，比較了乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲醇和酸化乙酸乙酯（pH2.5）不同提取溶劑的提取效果，并研究了它們對氟蟲腈及其代謝物的凈化效果和回收率的影響，結果見表3。

表3 不同溶劑提取雞蛋樣品中的氟蟲腈及其代謝物回收率Table 3 Recovery of fipronil and its metabolites from egg samples using various solvents

表3 結果表明，甲醇、乙酸乙酯、正己烷與酸性環境（pH2.5）中的乙酸乙酯作為提取溶劑時，雞蛋樣品中的氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜回收率較低，難以滿足殘留檢測要求；當選用乙腈作為雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的提取溶劑時，回收率在84.8%～89.3% 之間；因此，本文選擇乙腈作為提取溶劑，能夠有效提取雞蛋中的氟蟲腈及其代謝物。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

為有效減少雜質對農藥的干擾，比較了3 種不同類型的固相萃取柱，包括中性氧化鋁柱、C18 固相萃取柱與弗洛里矽硅土固相萃取柱。通過氟蟲腈及其代謝物標準溶液過柱試驗，結果見表4。

表4 不同固相萃取柱過柱試驗提取雞蛋樣品中的氟蟲腈及其代謝物回收率Table 4 Recovery of fipronil and its metabolites in egg samples extracted by different solid phase extraction columns

表4 結果表明，中性氧化鋁柱與弗洛里矽硅土固相萃取柱的回收率達到87.2%～96.3%，而C18 固相萃取小柱的回收率僅達70%左右。由于自中性氧化鋁柱填料為普通的試劑中性氧化鋁，價格方面遠低于C18 填料與弗洛里矽硅土，成本更有優勢，故本方法選擇中性氧化鋁柱固相萃取小柱作為凈化小柱。

樣品中添加氟蟲腈及其代謝物試驗結果也證明，選用中性氧化鋁柱后試驗的準確度與精密度參數均符合要求，且在氟蟲腈組分保留時間周圍沒有雜質峰的干擾，完全適用于本方法。

2.1.3 色譜條件的優化

分別選擇乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨溶液和甲醇-0.1% 甲酸水作為流動相，對樣品進行分離試驗。

試驗表明，當乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液的比例采用表1 的條件時，氟蟲腈及其代謝物的峰形對稱、尖銳，且與樣品本底分離良好，乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液分離體系優于其他體系，所以選擇乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液作為分離氟蟲腈及其代謝物的流動相。

2.2 空白試驗

稱取雞蛋（不添加氟蟲腈及其代謝物）10.0 g，按照1.2 所述的方法，對樣品進行前處理和凈化過柱后，進行定容處理。隨后，使用超高效液相色譜串聯質譜儀進行檢測，所得的檢測圖譜如圖1所示。

圖1 氟蟲腈及其代謝物標準品總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of fipronil and its metabolite standards

由圖1 可知，在氟蟲腈及其代謝物對照品的出峰保留時間范圍為1.64～1.70 min 時，未出現任何干擾峰。這一結果表明，雞蛋樣品中并未含有氟蟲腈及其代謝物，不影響氟蟲腈及其代謝物的檢測。

2.3 方法的評價

2.3.1 回收率與精密度

稱取2.0 g 的空白雞蛋樣品（精確至0.01 g），添加適量的氟蟲腈及其代謝物標準工作液，以實現加標水平分別為0.005、0.010 mg/kg 和0.020 mg/kg。隨后對樣品按照1.2 方法開展檢測，每個添加水平重復5 次，計算雞蛋樣品中4 種氟蟲腈及其代謝物的殘留量、回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表5。

表5 雞蛋樣品中不同添加水平中的氟蟲腈及其代謝物回收率Table 5 Recovery of fipronil and its metabolites in egg samples with different additions

由表5 可知，4 種氟蟲腈及其代謝物的回收率在81.3%～92.5%之間，相對標準偏差低于5.5%。典型空白雞蛋樣品添加氟蟲腈及其代謝物的超高效液相色譜串聯質譜圖見圖2。

圖2 空白雞蛋加入氟蟲腈及其代謝物總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of add fiproni and its metabolites to blank eggs

由2 可知，該色譜峰形分離度好，周邊無雜質峰干擾。

2.3.2 方法線性與檢出限

針對4 種農藥制備不同濃度梯度的基質標準溶液（濃度分別為 0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.050 μg/mL），并對其進行了進樣分析。以溶液的質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制了標準曲線，得出了4 種農藥的回歸系數，具體數據見表6。

表6 方法的線性范圍及標準曲線的回歸方程Table 6 Linear range and linear equation of the method

由表6 可知，在濃度范圍為0.001～0.050 μg/mL內，這4 種農藥的相關系數均大于0.990 4，顯示出良好的線性關系。根據3 倍信噪比來計算出方法的檢出限，氟蟲腈的檢出限為0.001 mg/kg，而氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的檢出限均為0.002 mg/kg，與GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》規定的雞蛋中氟蟲腈殘留限量0.02 mg/kg 相比，所開發方法中檢出限能夠滿足檢測要求。

3 討論與結論

本研究建立了快速、高效、成本低的一種超高效液相色譜串聯質譜檢測方法，適用于雞蛋中氟蟲腈及其代謝物藥物殘留的分析。對比胡貝貞等[21]采用液相色譜一串聯質譜法測定茶葉中氟蟲腈的含量；安瓊等[22]采用氣相色譜法測定禽蛋中有機氯農藥含量；本研究對雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的藥物殘留進行了全面、詳細的分析，采用了超高效液相色譜串聯質譜法同時測定氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜，樣品前處理成本低，方法檢出限滿足要求，加標回收率范圍為81.3%～92.5%，相對標準偏差均低于5.5%。這表明該方法可應用于雞蛋樣品中4 種農藥的高靈敏度檢測，結果具有準確性和可靠性。