生物型人工肝支持系統(tǒng)種子細(xì)胞的來源與應(yīng)用

朱雪晶， 黃偉健，2， 鄢和新，2

1 上海賽立維生物科技有限公司， 上海 201210

2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院麻醉科， 上海 200127

肝衰竭是由多種原因引起的嚴(yán)重肝臟損傷，其病死率極高［1］。肝移植術(shù)是目前唯一有效的治療方法。但供肝短缺、等待時(shí)間長、移植費(fèi)用昂貴，故能夠進(jìn)行肝移植治療的患者數(shù)量非常有限［2-3］。人工肝支持系統(tǒng)簡(jiǎn)稱人工肝，包括生物型和非生物型。非生物型人工肝可以短期改善肝衰竭患者的肝臟代謝功能，但不能實(shí)現(xiàn)肝功能恢復(fù)，對(duì)患者的整體生存率無顯著性提高［2-6］。自1987年肝細(xì)胞型人工肝治療暴發(fā)性肝衰竭成功以來，生物型人工肝被認(rèn)為是具有較好治療效果和應(yīng)用前景的新型治療手段［7］。其不僅能夠幫助肝衰竭患者清除體內(nèi)毒素，還具有合成及轉(zhuǎn)化功能，從而達(dá)到緩解肝衰竭、恢復(fù)肝功能的作用［8-9］。目前研究較多的生物型人工肝主要包括美國的ELAD、德國的MELS 以及荷蘭的AMCBAL。國內(nèi)大部分處于臨床前研究階段［10］，截至目前，上海微知卓、蘇州瑞徠、廣東乾暉先后獲得國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心臨床批件，臨床試驗(yàn)啟動(dòng)在即。

生物型人工肝通常由種子細(xì)胞、生物反應(yīng)器和輔助裝置組成。生物反應(yīng)器是儲(chǔ)存細(xì)胞、實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換的重要場(chǎng)所，多以中空纖維反應(yīng)器、微載體或纖維支架反應(yīng)器為主。輔助裝置主要為人工肝提供動(dòng)力、保溫等作用。種子細(xì)胞是生物型人工肝發(fā)揮作用的核心要素，其應(yīng)具備在體外代償肝臟的合成與解毒、生物轉(zhuǎn)化、分泌等功能，并且可持續(xù)、規(guī)模化制備，達(dá)到一定的細(xì)胞數(shù)量。因此，開發(fā)合適的種子細(xì)胞，解決細(xì)胞數(shù)量、提高肝功能成為推動(dòng)生物型人工肝發(fā)展的關(guān)鍵。本文就種子細(xì)胞的研究進(jìn)展綜述如下。

1 種子細(xì)胞來源

目前，生物型人工肝種子細(xì)胞主要來源于豬肝細(xì)胞、人原代肝細(xì)胞、肝前體細(xì)胞、永生化肝細(xì)胞、腫瘤來源細(xì)胞、干細(xì)胞或胎肝細(xì)胞以及重編程的肝樣細(xì)胞等［4］（圖1）。

圖1 生物型人工肝種子細(xì)胞來源Figure 1 Cell sources for bioartificial livers

1.1 人原代肝細(xì)胞 人原代肝細(xì)胞理論上是最好的種子細(xì)胞，不存在跨種屬問題，也無致瘤和感染風(fēng)險(xiǎn)。鄧宏魁團(tuán)隊(duì)［10］利用5C 化學(xué)小分子調(diào)控信號(hào)通路，解決了原代肝細(xì)胞體外功能穩(wěn)定的難題。日本研究團(tuán)隊(duì)［11］利用“YAPC”小分子組合發(fā)現(xiàn)原代肝細(xì)胞CYP450 酶活性可在體外維持達(dá)40天。此外，肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞的共培養(yǎng)對(duì)于保持原代人肝細(xì)胞的功能非常重要。其中共培養(yǎng)中常用的非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞包括人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、血竇內(nèi)皮細(xì)胞以及骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSC）等［12］。然而，人原代肝細(xì)胞的體外增殖能力較差，導(dǎo)致其不能滿足生物型人工肝對(duì)種子細(xì)胞數(shù)量和功能的要求［13-14］。

1.2 人肝前體細(xì)胞 當(dāng)肝臟持續(xù)暴露于慢性損傷時(shí)，肝細(xì)胞自我更新功能嚴(yán)重受損，可去分化為肝前體細(xì)胞以逃避損傷，并在損傷病因去除后成為再生修復(fù)的重要細(xì)胞來源［15-16］。筆者團(tuán)隊(duì)［17-18］利用小分子重編程技術(shù)模擬體內(nèi)肝再生微環(huán)境，將人原代肝細(xì)胞在特殊培養(yǎng)體系下，去分化為可體外增殖的肝前體樣細(xì)胞（hepatocytederived liver progenitor-like cell， HepLPC），并可在特定條件下重新分化為成熟肝細(xì)胞，成功在體外模擬了肝細(xì)胞再生過程。惠利健團(tuán)隊(duì)［19］通過篩選條件培養(yǎng)液將人原代肝細(xì)胞在低氧環(huán)境下去分化為一種介于肝細(xì)胞和肝前體細(xì)胞的狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了其體外擴(kuò)增10 000 倍的能力。胡惠麗團(tuán)隊(duì)［20］通過類器官技術(shù)實(shí)現(xiàn)人胚胎肝細(xì)胞體外培養(yǎng)及功能維持。雖然研究人員在人原代肝細(xì)胞體外擴(kuò)增與功能維持方面取得了一定的進(jìn)展，但依然受供肝的質(zhì)量及數(shù)量限制，是否可作為生物型人工肝的種子細(xì)胞仍需要更深入的技術(shù)研究。

1.3 永生化肝細(xì)胞 外源永生化基因插入原代肝細(xì)胞可以使肝細(xì)胞獲得長期增殖能力。早期有研究者將SV40LT 聯(lián)合端粒逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，建立了IHH 永生化肝細(xì)胞［21］。高毅團(tuán)隊(duì)［22-23］利用慢病毒載體對(duì)原代肝細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因（H-TERT）和抑制Caspase-3表達(dá)的siRNA，建立了與原代肝細(xì)胞類似形態(tài)和生物學(xué)功能的HepGL。筆者團(tuán)隊(duì)［24］在肝細(xì)胞來源的HepLPC 中過表達(dá)E6E7 基因，建立了具有良好合成、分泌、代謝功能的永生化肝前體樣細(xì)胞（iHepLPC），結(jié)合“液-氣”交互式反應(yīng)器構(gòu)建Aliver 生物型人工肝支持系統(tǒng)，將肝衰竭模型豬的生存率提高至83.3%，未來應(yīng)用前景較好。但如何維持永生化細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，保證臨床應(yīng)用的安全性，是永生化細(xì)胞面臨的主要問題。

1.4 干細(xì)胞/轉(zhuǎn)分化來源的肝細(xì)胞 不同類型分化細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化不會(huì)在自然條件下自發(fā)發(fā)生，隨著細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，目前可以利用技術(shù)手段在體外改變細(xì)胞分化的進(jìn)程，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)化，這種方法稱為“重編程”。“重編程”技術(shù)的發(fā)展為肝細(xì)胞來源提供了新的研究思路［25］。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的人胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞均能夠誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞。這些細(xì)胞具有多向分化潛能、來源穩(wěn)定、無倫理問題、功能接近于原代肝細(xì)胞，在細(xì)胞治療領(lǐng)域具有巨大的研究價(jià)值和應(yīng)用前景［26］。但目前誘導(dǎo)為肝樣細(xì)胞技術(shù)尚不成熟，其分化效率差、誘導(dǎo)周期長、工藝復(fù)雜、成本高，且存在致瘤的風(fēng)險(xiǎn)，安全性在研究過程中備受關(guān)注。

惠利健團(tuán)隊(duì)［27］通過插入轉(zhuǎn)錄因子，在特殊培養(yǎng)體系下，將新生兒皮膚成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為人源性肝樣細(xì)胞hiHep，應(yīng)用于生物型人工肝系統(tǒng)，成功救治了肝衰竭模型豬。謝欣團(tuán)隊(duì)［28］在小鼠成纖維細(xì)胞體外插入1 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，聯(lián)合特定培養(yǎng)體系即實(shí)現(xiàn)了定向肝樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。該轉(zhuǎn)分化條件更為簡(jiǎn)便，移植后的肝樣細(xì)胞可以挽救肝衰竭小鼠的生命。但轉(zhuǎn)分化來源的肝樣細(xì)胞同樣存在殘留宿主細(xì)胞安全性風(fēng)險(xiǎn)、轉(zhuǎn)分化效率不確定、缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)等問題，仍需進(jìn)一步研究。

1.5 腫瘤來源肝細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞來源廣泛、易獲得，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，從數(shù)量上可以滿足人工肝的需求。HepG2、C3A 是最常用于生物型人工肝研究的腫瘤細(xì)胞［29-30］。美國ELAD 系統(tǒng)自20 世紀(jì)90 年代開始研制生物型人工肝，將C3A 培養(yǎng)于中空纖維反應(yīng)器內(nèi)，早期臨床中取得了較好的效果［31］。但2015 年8 月由于Ⅲ期臨床試驗(yàn)未達(dá)到評(píng)價(jià)終點(diǎn)而宣布失敗［32］。C3A 雖然具有一定的分泌、合成功能，并接近正常肝細(xì)胞，但代謝解毒功能差是其最大缺點(diǎn)，也可能是ELAD臨床試驗(yàn)失敗的原因之一。HepaRG 細(xì)胞來源于人肝祖細(xì)胞系，因?yàn)槠浔Ａ袅烁渭?xì)胞代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核受體相關(guān)基因，在有或無DMSO 的條件下均可分化為成熟肝細(xì)胞。但是，HepaRG體外擴(kuò)增能力差，分化條件復(fù)雜，尚無法獲得大批量細(xì)胞用于臨床前研究［33-34］。另外，腫瘤來源的肝細(xì)胞具有較大的安全風(fēng)險(xiǎn)，在臨床應(yīng)用中若發(fā)生細(xì)胞泄露，將有致癌的風(fēng)險(xiǎn)。

1.6 動(dòng)物源豬肝臟細(xì)胞 豬肝細(xì)胞由于易獲得、高功能活性，是最常用于人工肝研究的種子細(xì)胞。美國Mayo Clinic 醫(yī)學(xué)中心［35-37］將新鮮的豬肝細(xì)胞分離后，制備成懸浮肝細(xì)胞球，用于救治豬肝衰竭模型。四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室［38］利用豬肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞混合成球培養(yǎng)，用于猴肝衰竭模型治療。BLSS 系統(tǒng)［39］是將豬原代細(xì)胞與膠原蛋白混合接種于中空纖維反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建的人工肝系統(tǒng)。將患者血漿先經(jīng)過氧合器和加熱器，再與豬肝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，實(shí)現(xiàn)治療的目的。HepatAssist 2000 系統(tǒng)［40-41］是目前臨床研究最多的人工肝系統(tǒng)。通過體外循環(huán)裝置將患者的血液經(jīng)過置換，再將有毒的血漿通過含有豬肝細(xì)胞的中空纖維管，進(jìn)一步清除有毒物質(zhì)，同時(shí)豬肝細(xì)胞分泌合成的細(xì)胞因子、蛋白等回到患者體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)代償肝功能的作用。早在1999 年已開展了基于HepatAssist 2000 系統(tǒng)的Ⅰ期多中心臨床研究［40］，研究者對(duì)39 例急性肝衰竭患者進(jìn)行了治療，其中35 例患者生存期超過30 天，6 例患者在不需要移植物的情況下恢復(fù)正常。然而隨后的4年隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)［41］顯示，該系統(tǒng)可顯著降低血清總膽紅素的含量，但生存率與對(duì)照組無顯著性差異（71% vs 62%）。目前該系統(tǒng)仍處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段，暫時(shí)沒有數(shù)據(jù)表明患者感染異種病毒。然而，豬源肝細(xì)胞存在跨物種的免疫反應(yīng)、潛在的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）感染的風(fēng)險(xiǎn)［42］，歐洲部分國家已禁止使用原代豬肝細(xì)胞用于生物型人工肝［7］，美國食品藥品監(jiān)督管理局也未予以批準(zhǔn)，其應(yīng)用前景受到限制。

2 種子細(xì)胞培養(yǎng)方式

通常認(rèn)為生物型人工肝需要裝載至少等同于1/10成年人肝臟大小的細(xì)胞數(shù)量才能發(fā)揮其體外代償肝功能的作用。肝細(xì)胞貼壁生長依賴于培養(yǎng)面積，傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)模式很難實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞規(guī)模化制備。目前，生物型人工肝種子細(xì)胞擴(kuò)增多采用生物反應(yīng)器，通過構(gòu)筑3D 培養(yǎng)環(huán)境，模擬肝細(xì)胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)的同時(shí)，增強(qiáng)肝細(xì)胞合成及代謝功能。3D肝細(xì)胞培養(yǎng)方式主要分為2 種，即支架結(jié)構(gòu)培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。

2.1 支架結(jié)構(gòu)培養(yǎng) 3D 支架結(jié)構(gòu)生物反應(yīng)器能夠?yàn)楦渭?xì)胞提供接近三維靜態(tài)生長環(huán)境，可有效降低細(xì)胞所受剪切力，減少細(xì)胞機(jī)械損傷，代表性反應(yīng)器為中空纖維結(jié)構(gòu)。中空纖維生物反應(yīng)器通過將成束的中空纖維進(jìn)行封裝，細(xì)胞可貼附在纖維管內(nèi)、纖維管外等不同空間生長。高毅團(tuán)隊(duì)［43］利用中空纖維生物反應(yīng)器將MSC擴(kuò)增至臨床應(yīng)用數(shù)量級(jí)，并成功應(yīng)用于肝衰竭大動(dòng)物模型的救治實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)有效抑制全身炎癥反應(yīng)，將7天生存率從17%提升到87.5%。作為首個(gè)干細(xì)胞型生物人工肝藥械組合產(chǎn)品，“血液凈化用MSC”正式獲得國家藥品監(jiān)督管理局臨床試驗(yàn)批件，未來有望為肝衰竭患者提供新的治療手段。中空纖維生物反應(yīng)器用于細(xì)胞體外培養(yǎng)的概念最早于1972 年被提出［44-45］，但同時(shí)存在氧合能力較差的缺陷，即使配合目前較完備的氧合裝置與持續(xù)培養(yǎng)基灌注系統(tǒng)，也僅適合特定的細(xì)胞類型，如適應(yīng)低氧環(huán)境、對(duì)液體剪切力不敏感的MSC［45-46］。

2.2 載體懸浮培養(yǎng) 肝細(xì)胞載體懸浮培養(yǎng)，是將肝細(xì)胞自聚集或者貼附載體形成肝細(xì)胞團(tuán)，通過不同方式懸浮分布于生物器內(nèi)。懸浮培養(yǎng)能充分利用生物反應(yīng)器內(nèi)空間，增加肝細(xì)胞生長表面積、提高物質(zhì)交換效率，從而達(dá)到規(guī)模化培養(yǎng)的目的。肝細(xì)胞球技術(shù)是利用非黏附板培養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞聚集成多細(xì)胞小球。南京大學(xué)鼓樓醫(yī)院將一定數(shù)量的肝細(xì)胞球置于自主開發(fā)的多層板生物反應(yīng)器，克服了細(xì)胞球沉降聚集，在肝衰竭豬模型實(shí)驗(yàn)中取得了顯著療效［47］。Lu等［48］利用人成纖維細(xì)胞直接重編程得到肝細(xì)胞樣細(xì)胞和人肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，并制作肝細(xì)胞球類器官結(jié)構(gòu)，由于肝細(xì)胞球本身具有模擬肝臟生理微環(huán)境、促進(jìn)肝功能表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，在生物型人工肝等方面受到越來越多的關(guān)注與研究。

采用水凝膠包被的方式將肝細(xì)胞制成微囊包裹，是懸浮高密度培養(yǎng)肝細(xì)胞的重要方法。筆者團(tuán)隊(duì)［49］利用可生物降解的海藻酸鹽包裹iHepLPC 與內(nèi)皮細(xì)胞形成共培養(yǎng)3D 結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)異種肝樣細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)存活和肝功能維持的作用，有效治療化學(xué)誘導(dǎo)劑引起的小鼠急性肝損傷模型。但肝細(xì)胞球體積不易控制、中央?yún)^(qū)域營養(yǎng)物質(zhì)傳輸受限、中心細(xì)胞容易壞死，影響肝細(xì)胞球發(fā)揮作用的效率。為了解決上述缺點(diǎn)，筆者團(tuán)隊(duì)以網(wǎng)織纖維載體結(jié)合“液-氣交互式”動(dòng)力裝置構(gòu)建新型生物反應(yīng)器，為iHepLPC 提供3D 結(jié)構(gòu)培養(yǎng)的固定場(chǎng)所，實(shí)現(xiàn)了血漿與細(xì)胞之間的高效物質(zhì)交換，使得生物型人工肝性能大幅提升，并成功在大動(dòng)物模型中驗(yàn)證了有效性［24］。由此可見，下一步應(yīng)當(dāng)通過優(yōu)化生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，以適配不同細(xì)胞的生物學(xué)特性，從而達(dá)到增強(qiáng)肝細(xì)胞活性，提高生物型人工肝療效的目的。

3 生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)

生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)是指以生物反應(yīng)器為核心，通過載體懸浮或者支架貼壁的方式在生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建3D培養(yǎng)環(huán)境，采用工程技術(shù)手段對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)的環(huán)境參數(shù)實(shí)時(shí)在線測(cè)控，并輔以循環(huán)或連續(xù)灌注的手段，加強(qiáng)營養(yǎng)傳輸和物質(zhì)交換，從而構(gòu)建適合肝細(xì)胞生長、增殖的培養(yǎng)條件［50］。肝細(xì)胞作為生物型人工肝的活性成分，按藥品的質(zhì)量要求進(jìn)行生產(chǎn)，而培養(yǎng)過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與控制是細(xì)胞治療行業(yè)發(fā)展的監(jiān)管趨勢(shì)。只有構(gòu)建多參數(shù)（pH 值、溶解氧濃度、溫度以及關(guān)鍵生化指標(biāo)如葡萄糖、乳酸和銨離子等）實(shí)時(shí)在線檢測(cè)、協(xié)同控制的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，才能保證培養(yǎng)過程可控，獲得可靠的預(yù)期結(jié)果。以最早實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)和反饋控制的pH 值和溶解氧濃度為例，電化學(xué)傳感器仍然是理想的選擇。得益于早期電化學(xué)傳感器的發(fā)展及其在生物發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用，電化學(xué)傳感器可直接安裝在生物反應(yīng)器內(nèi)實(shí)現(xiàn)原位監(jiān)測(cè)，具有數(shù)據(jù)即時(shí)、檢測(cè)可靠穩(wěn)定、精度高、響應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)［51-52］。在連續(xù)監(jiān)測(cè)葡萄糖的乳酸濃度方面，Renneberg 等［53］首次通過接入測(cè)量葡萄糖和乳酸濃度的酶?jìng)鞲衅鳎?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中葡萄糖和乳酸實(shí)時(shí)在線測(cè)量裝置。搭載不同的電化學(xué)和酶?jìng)鞲衅骺蓪?shí)現(xiàn)細(xì)胞外環(huán)境參數(shù)實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)和反饋控制，筆者開發(fā)的貼壁細(xì)胞工業(yè)化大規(guī)模、自動(dòng)化生產(chǎn)設(shè)備，實(shí)現(xiàn)了研發(fā)至下游應(yīng)用的全流程、封閉式、自動(dòng)化、模塊化、可擴(kuò)展的智能制造系統(tǒng)。細(xì)胞生產(chǎn)的智能制造和智慧工廠，為生物型人工肝的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化和行業(yè)發(fā)展提供了硬件基礎(chǔ)。

4 小結(jié)

綜上所述，生物型人工肝作為新技術(shù)具有廣泛而確切的應(yīng)用前景。在日益完善的集成化、智慧型制造系統(tǒng)支持下，生物型人工肝種子細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增技術(shù)也日漸成熟。然而，如何獲取理想的種子細(xì)胞并維持其肝功能的穩(wěn)定、可靠、持續(xù)，滿足在臨床長時(shí)間使用過程中的活性與效力不丟失，仍是研究者們亟需解決的難題。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：朱雪晶、黃偉健負(fù)責(zé)文獻(xiàn)資料搜集和分析，撰寫論文；鄢和新負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。