基于PI3K/AKT/mTOR信號通路探討大黃煎劑對輕微型肝性腦病大鼠腦組織炎癥損傷的保護機制

張廣發， 蔡穎瑩， 林 龍， 付 蕾， 姚 凡， 王 萌， 張榮臻， 陳月橋， 黃良江， 王 涵， 蘇 運，藍艷梅， 樂瀅玉， 毛德文， 姚 春

1 廣西中醫藥大學研究生院， 南寧 530200

2 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院科研部， 南寧 530011

3 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 a. 肝病科， b. 脾胃科， c. 分子生物學實驗室， d. 腫瘤科， 南寧 530023

肝性腦?。╤epatic encephalopathy，HE）是急慢性肝功能障礙的常見并發癥，以代謝紊亂和神經精神異常為主要特征。其主要機制以氨中毒學說為主導，與炎癥反應損傷協同促進HE 的發生發展。研究［1］表明，輕微型肝性腦病（minimal hepatic encephalopathy，MHE）的發病機制與HE 的發病機制無明顯差異，只是程度不同。炎癥中的炎性細胞因子和氨等有毒物質破壞血腦屏障進入腦組織，導致腦實質改變及腦功能障礙［2］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通過經活化后的蛋白激酶B（AKT）激活底物哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），起到調控下游細胞增殖和炎癥靶基因表達的作用［3］。研究［4］發現，PI3K/AKT/mTOR 信號通路是機體炎癥反應的重要調節途徑，能夠抑制腦損傷后的神經炎性反應及細胞凋亡，發揮一定的腦組織保護作用。

大黃煎劑是中醫藥治療MHE 的經驗處方，臨床與科研應用十余年，卓有成效。本團隊研究［5-6］發現，大黃煎劑保留灌腸后，可以顯著改善HE 患者的臨床癥狀，降低內毒素水平，減少腸道細菌過度增長，調整腸道菌群失衡，發揮顯著的保肝護腦的療效。近期的網絡藥理學研究［7］亦證實，PI3K/AKT 信號通路可能是大黃煎劑治療MHE 的作用靶點通路之一。綜上，本研究旨在探討大黃煎劑對MHE 大鼠模型學習認知能力的影響及其“通腑開竅”理論的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級、雄性成年SD大鼠60只，6～8 周齡，體質量200～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證編號：SYXK（湘）2019-0004，實驗動物使用許可證：SYXK（桂）2019-0001。

按照完全隨機方法取6只大鼠作為空白組（CON組），剩余54只大鼠構建慢性肝硬化模型，經Morris水迷宮實驗測試符合MHE癥狀大鼠40只，造模成功率為76.9%。將40 只大鼠采用完全隨機方法分為模型組（MOD 組）、乳果糖組（LT 組）、大黃煎劑低劑量組（RD1 組）、大黃煎劑中劑量組（RD2 組）及大黃煎劑高劑量組（RD3 組），每組8只。

1.2 主要藥品與試劑 大黃煎劑：醋大黃30 g，烏梅30 g（天江藥業有限公司提供，機配免煎顆粒），CCl4（麥克林，C13385752），ELISA試劑盒（武漢華美），ALT（X22039295）、AST（X23039296）、IL-1β（Z19031282）、IL-6（Z20031283）、TNF-α（X21039294）、ZOL（200 mL）RNA 提取通用（德國MACHEREY-NAGEL，740404），PI3K、AKT、mTOR mRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RIPA高效裂解液（索萊寶科技，HY-K0022），BCA 蛋白定量試劑盒（博士德生物，14J29C46），三鷹生物技術：PI3K（60225-1-Ig）、mTOR（66888-1-Ig），AKT（Cell Signaling，C67E7）。

1.3 儀器 圖像采集軟件Leica Application Suite V4（德國Leica 公司），Mastercycle Nexus PCR 循環儀（Eppendoff 公司），LightCycler?480Ⅱ實時熒光定量PCR儀（羅氏公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 慢性肝硬化大鼠模型的建立 本實驗參考文獻［8］建立慢性肝硬化模型，將CCl4（分析純）、橄欖油按2∶3混合后于大鼠皮下注射（最初8次1.5 mL/kg，而后每次2 mL/kg），每隔3 d 注射1 次，持續12 周；CON 組注射等量生理鹽水。構建慢性肝硬化模型的54 只大鼠在造模期間死亡2 只，余52 只大鼠中隨機取3 只用以觀察造模后大鼠肝功能和血氨水平是否顯著升高，肝組織是否符合慢性肝硬化病理改變，方法為尾靜脈采血0.25 mL，按照說明書操作，離心15 min（2 000 r/min），提取血清，用ELISA 試劑盒檢測大鼠血清ALT、AST 水平；提取0.2 mL血漿，全自動生化檢測儀快速檢測大鼠血氨水平；同時，取大鼠肝組織進行HE染色。

1.4.2 MHE 判定 慢性肝硬化造模成功后結合Morris水迷宮測試結果判定MHE，符合下列3 項條件則可認為MHE 模型構建成功：（1）慢性肝硬化大鼠模型的Morris水迷宮測試值大于CON組；（2）在整個實驗造模過程中，大鼠未出現顯性肝性腦病癥狀，包括自主活動減弱、反應遲鈍、運動失調、昏迷等；（3）血氨水平高于CON組。

1.4.3 干預方法 （1）CON 組和MOD 組：用生理鹽水保留灌腸，2 mL/只，1 次/d，持續10 d。（2）LT 組：用乳果糖按22.5%劑量保留灌腸，2 mL/只，1 次/d，持續10 d。（3）RD1 組、RD2 組、RD3 組：分別用大黃煎劑按2.5、5.0、7.5 g/kg 三種劑量保留灌腸，2 mL/只，1 次/d，持續10 d。

1.4.4 檢測指標

1.4.4.1 Morris水迷宮逃避潛伏期 所有大鼠治療10 d后，進行Morris 水迷宮測試，分析大鼠的空間學習記憶能力。將水池分為1、2、3、4 共四個象限，分別讓大鼠面向缸壁入水，尋找并記錄爬上平臺時間（逃避潛伏期），取每一組次的平均值。

1.4.4.2 肝及腦組織HE 染色 肝、腦組織于4%多聚甲醛固定24 h后進行包埋、切片及染色。

1.4.4.3 ELISA 法檢測大鼠動脈血的肝功能和炎性細胞因子的表達 按照說明書操作，提取血清，用ELISA試劑盒檢測大鼠血清ALT、AST、IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達水平。

1.4.4.4 定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測大鼠腦組織PI3K、AKT 及mTOR 的mRNA 表達 取20～30 mg 腦組織，加入400 μL 裂解液研磨2 min 后，再加入600 μL裂解液。4 ℃冰箱放置15 min，常溫離心機瞬離10 s，加入200 mL 氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5 min。離心（4 ℃，12 000×g，15 min），吸取上水相0.45～0.50 mL。加入異丙醇0.5 mL，顛倒混勻，離心后的沉淀物即為RNA。加入1 mL 的75%乙醇溶液，混勻后離心（4 ℃，12 000×g，10 min），得到白色黏附物。加入75%的乙醇980 μL 洗滌3次，晾干加入50 μL無酶水，混勻后備用。

按試劑盒說明書進行反轉錄（SYBR Green qPCR法），配置qPCR 反應體系，隨后置入LightCycler?480Ⅱ儀器中進行檢測，反應結束后確認qPCR 的溶解曲線和擴增曲線，進行定量、作RNA標準曲線等。其中，目的基因的相對表達量應用2-ΔΔCt法計算結果。以β-actin 作為內參，檢測腦組織PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量。引物設計由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.4.5 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測大鼠腦組織PI3K、AKT 及mTOR 的蛋白表達 取30 mg 腦組織，加入200 μL RIPA高效裂解液提取組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。后續電泳上樣體積為5 μL，蛋白量為30 μg。使用快速凝膠試劑盒配制7.5%電泳凝膠，將樣本轉移至PVDF膜，TBST洗膜及封閉，一抗4 ℃孵育過夜［抗體稀釋比例：β-actin（1∶800），PI3K（1∶2 000），AKT（1∶1 000），mTOR（1∶4 000）］。TBST洗膜，加入對應的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜，加入ECL 顯影液避光反應5 min，顯影后計算相對蛋白表達量。

1.5 統計學方法 應用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，Graphpad Prism 7.0 軟件進行繪圖。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝功能和血氨水平比較 與CON 組相比，MOD 組大鼠ALT、AST 和血氨水平均顯著升高（P值均＜0.01）；與MOD 組相比，各治療組大鼠ALT、AST及血氨水平均明顯降低（P值均＜0.01）。此外，RD3組大鼠的AST水平顯著低于RD1組（P＜0.01）（圖1）。

圖1 各組大鼠肝功能和血氨水平比較Figure 1 Comparison of liver function and blood ammonia levels among groups of rats

2.2 Morris 水迷宮測試結果 與CON 組相比，MOD 組大鼠的逃避潛伏期時間顯著增加（P＜0.01）；與MOD 組相比，各治療組大鼠的逃避潛伏期時間均明顯減少（P值均＜0.01）。此外，LT 組和RD3 組大鼠的逃避潛伏期時間顯著少于RD1組（P值均＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠藥物干預后的逃避潛伏期比較Figure 2 Comparison of escape latency after drug intervention in each group of rats

2.3 肝組織及腦組織病理觀察

2.3.1 肝組織病理 與CON 組相比，MOD 組大鼠肝組織病理損傷嚴重，可見多個完整的肝小葉結構破壞，肝細胞大面積變性壞死，結構排列紊亂，細胞核深染，肝索排列不規整，肝竇擴張明顯，伴有出血和大量纖維組織增生，假小葉形成。與MOD 組相比，各治療組大鼠的肝組織病理損傷得到改善，小部分肝細胞變性壞死，結構排列紊亂減少，細胞核染色較淺，肝索排列稍不規整，肝竇擴張及出血癥狀減輕或消失，可見少量纖維組織，其中以LT組和RD3組效果較好（圖3）。

圖3 光鏡下各組大鼠肝組織HE染色結果（×200）Figure 3 Light microscopy results of HE staining of rat liver tissue in each group （×200）

2.3.2 腦組織病理 與CON 組相比，MOD 組大鼠腦皮質與海馬區內神經元結構模糊，排列稀疏，形狀、大小不規則，數量減少，染色淺，可見較多的神經元變性和核固縮，大量炎癥細胞浸潤。與MOD 組相比，各治療組大鼠的腦皮質與海馬區內神經元改變較輕，形態排列較規則緊密，細胞略微腫脹，形狀與大小稍不規則，數量較少，染色較深，可見少量的神經元變性、核固縮及炎癥細胞浸潤，其中以LT組和RD3組效果較好（圖4）。

圖4 光鏡下各組大鼠腦組織HE染色結果（×200）Figure 4 Light microscopy results of HE staining of rat brain tissue in each group （×200）

2.4 各組大鼠血清炎性細胞因子表達水平比較 與CON組相比，MOD組大鼠血清炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達均明顯升高（P值均＜0.01）；與MOD 組相比，各治療組大鼠血清炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達均顯著降低（P值均＜0.01）。此外，與RD1 組相比，LT組的TNF-α水平、RD2組的IL-1β水平以及RD3組的IL-1β和IL-6水平均明顯降低（P值均＜0.05）（圖5）。

圖5 各組大鼠相關炎性細胞因子水平比較Figure 5 Comparison of levels of relevant inflammatory cytokines among groups of rats

2.5 各組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的mRNA 表達水平比較 與CON 組相比，MOD 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達量均顯著升高（P值均＜0.01）；與MOD 組相比，各治療組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR的mRNA 表達量均顯著降低（P值均＜0.05）。此外，LT組、RD2 組和RD3 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的mRNA 表達量均明顯低于RD1組（P值均＜0.05）；RD3組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達量明顯低于RD2組（P值均＜0.05）（圖6）。

圖6 各組大鼠腦組織中PI3K、AKT、mTOR的mRNA相對表達量比較Figure 6 Relative mRNA expression of PI3K， AKT and mTOR in the brain tissue of rats in each group

2.6 各組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 蛋白表達水平比較 與CON 組相比，MOD 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR的蛋白表達量均顯著升高（P值均＜0.01）；與MOD組相比，各治療組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的蛋白表達量均顯著降低（P值均＜0.01）。此外，LT 組、RD2 組和RD3 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的蛋白表達量均明顯低于RD1 組（P值均＜0.01）；LT 組、RD3 組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 的蛋白表達量均顯著低于RD2組（P值均＜0.05）（圖7）。

圖7 各組大鼠腦組織中PI3K、AKT、mTOR的蛋白免疫印跡結果及蛋白表達量比較Figure 7 Comparison of protein expression of PI3K， AKT，and mTOR in brain tissues of rats from various groups

3 討論

有研究［9］通過正電子發射型計算機斷層顯像技術發現，HE 患者腦部相關區域的膠質細胞11C-PK11195和18F-DPA-714 結合顯著增加，這為HE 存在腦神經炎癥反應提供了直接的影像學證據。神經炎癥級聯反應持續存在誘導神經元細胞凋亡，影響神經遞質傳遞，造成星形膠質細胞水腫/腦水腫等腦神經病理改變，這與HE的臨床特征性癥狀重疊［10］。因此，深入研究腦神經炎癥出現的原因及其誘發MHE 的機制，將為慢性肝硬化并發MHE的防治提供新的思路及手段。

傳統醫學并無與HE 相對應的病名，根據其臨床表現可歸屬“肝厥”“神昏”等范疇。此病的核心病機是腑氣不通，蒙蔽神竅，治法多用通腑開竅，方選大黃煎劑［5］。大黃煎劑由醋大黃和烏梅兩味中藥組成，方中醋大黃善瀉下涼血、清熱解毒，烏梅有澀腸生津止渴之效。二者共奏酸苦涌泄之妙，蕩滌腸胃，逐邪外出，增加腦氧供應，以達到通腑開竅之效［6］。

本研究結果顯示，大黃煎劑改善MHE 大鼠肝功能主要表現在：與模型組比較，大黃煎劑低、中、高劑量組大鼠肝臟中肝細胞變性壞死、炎性細胞浸潤、組織增生程度均得到不同程度改善，ALT、AST 水平均顯著降低。大黃煎劑改善MHE 大鼠腦功能表現在：與模型組比較，大黃煎劑低、中、高劑量組大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期時間均明顯縮短，血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低，這可能與大黃化學成分及單體化合物具有顯著的抗神經炎癥，穿透血腦屏障發揮抗炎功能，減輕炎癥反應，抑制白三烯B4，減少炎性因子IL-6、TNF-α的釋放，下調血小板激活因子，抑制白細胞、促炎因子基因的甲基化等有關［11-13］。腦組織病理結果顯示，大黃煎劑低、中、高劑量腦神經元形態排列紊亂、腫脹壞死、炎癥細胞浸潤減輕，且腦組織相關PI3K/AKT/mTOR 炎癥通路的mRNA 與蛋白表達水平均顯著低于模型組，以大黃煎劑高劑量組效果最佳。有研究［14-15］表明，多種藥物可激活PI3K/AKT/mTOR 通路以減輕相關疾病的神經炎癥。類似的，本研究結果表明，大黃煎劑可能激活PI3K/AKT/mTOR 通路，抑制MHE 大鼠腦組織炎癥，有效改善腦組織炎性損傷。

綜上，大黃煎劑可以降低MHE 大鼠腦內炎癥反應，改善MHE的神經精神癥狀，這些保護作用可能通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路進而減少炎性細胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 合成及釋放來實現。大黃煎劑是含有多種有效成分的中藥復方，未來筆者團隊將繼續探究并篩選出復方中治療MHE的主要有效成分。

倫理學聲明：本研究方案于2022年4月10日經由廣西中醫藥大學動物倫理委員會審批，批號：DW20220410-133，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：張廣發負責擬定寫作思路，撰寫文章；蔡穎瑩、林龍負責設計論文框架；付蕾、姚凡、王萌負責指導實驗技術；張榮臻、陳月橋負責推進實驗進度和實驗質量；黃良江、王涵、蘇運負責構造動物模型；藍艷梅、樂瀅玉負責行為學實驗。姚春、毛德文負責研究選題，指導文章撰寫和修改。