鐵皮石斛葉發酵液對酒精性肝炎小鼠模型的影響及其作用機制

周興念， 劉渝洪， 秦玉潔， 張 權， 程明亮， 李 宏

1 貴州醫科大學附屬醫院感染科， 貴陽 550001

2 貴州醫科大學臨床醫學院， 貴陽 550001

酒精性肝炎是常見的肝臟疾病之一，因長期大量飲酒導致，初期通常表現為肝臟中脂質蓄積并伴隨持續的慢性肝損傷和炎癥，進而可發展至酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化，3%～10%可能進展為肝細胞癌［1］，至今尚無較好的治療藥物與手段。細胞焦亡是一種促炎形式的程序性細胞死亡，包括由Caspase-1介導的經典焦亡通路和Caspase-11 介導的非經典焦亡通路，最終激活Gasdermin D 蛋白（GSDMD），使其裂解為22 kD C 端（GSDMD-C）和31 kD N 端（GSDMD-N）片段。被釋放的GSDMD-N 端結構域會在細胞膜的表面聚集，形成孔道，引起膜完整性喪失、胞漿膨脹和細胞內容物的釋放［2］，導致細胞釋放大量促炎性因子，如IL-6、IL-18、IL-1β 等，進而擴大機體強烈的炎癥反應［3］。近年有研究［4］顯示細胞焦亡與酒精性肝炎的發生發展密切相關，干預細胞焦亡可能是治療酒精性肝炎的有效途徑之一。

鐵皮石斛屬蘭科石斛屬多年附生草本植物，其活性成分包括多糖類、生物堿、黃酮類、芪類化合物等多種化學組分［5］，具有抗炎、抗氧化、增強機體免疫力等作用［6-7］。鐵皮石斛葉于2018 年6 月被納入“地方特色食品管理”。研究［8］表明，鐵皮石斛多糖可減少炎癥因子的產生，從而減輕酒精所誘導的急性肝損傷，但鐵皮石斛葉發酵液對酒精性肝炎的保護作用及機制尚未見報道。因此，本研究通過建立酒精性肝炎小鼠模型，探討鐵皮石斛葉發酵液對酒精性肝炎的干預作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥物 鐵皮石斛葉發酵液購自貴州同威生物科技有限公司（批號：18-220201）；威門石斛水購自貴州同威生物科技有限公司（批號：20211009）。水飛薊賓（Silybin）購自天津天士力圣特制藥有限公司（批號：H20040299）。

1.2 動物 70只雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，體質量20～25 g，6～8 周齡，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號與使用許可證號均為SYXK（黔）2023-0002。所有小鼠均飼養于貴州醫科大學實驗動物中心。

1.3 試劑 Lieber-DeCarli 酒精液體飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司；Trizol 試劑（美國Omega Bio-Tek，批號：R6834-01）；SYBR Green Realtime PCR Premix 試劑（日本TaKaRa，批號：RR047A）；R&D Systems 試劑盒（上海優寧維生物科技有限公司，批號：LXSAMSM-06）；RIPA組織/細胞裂解液、BCA試劑盒、DAPI（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：R0010、PC0020、C0085）；ECL超敏發光試劑盒（大連美侖生物技術有限公司，批號：MA0186-1）；NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-18、IL-1β 一抗（美國Abcam，批號：ab263899、ab138483、ab180673、ab219800、ab191860、ab283818）；山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor?647，批號：ab150079）。

1.4 儀器 實時熒光定量PCR（美國伯樂公司，型號：CFX96Toch）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-7C）；電泳槽、轉模儀（北京東方瑞利，型號：2037443753、1002808065）；一體式化學發光成像（上海勤翔，型號：Chemiscope）。

1.5 Lieber-DeCarli模型制備與給藥 70只雄性C57BL/6J小鼠采用隨機數字法分為正常組（N組），模型組（M組），液體飼料對照組（CON組），水飛薊賓組（SIL組）（0.250 mL/10 g），鐵皮石斛葉發酵液低（DEN-L 組）（0.125 mL/10 g）、中（DEN-M組）（0.250 mL/10 g）、高（DEN-H組）（0.375 mL/10 g）劑量組，共7 組，每組10 只。正常組食用普通固體飼料，液體飼料對照組喂養液體對照飼料8 周，建立非酒精性肝炎模型；模型組、水飛薊賓組及鐵皮石斛葉發酵液低、中、高劑量組小鼠喂養酒精液體飼料8周，建立酒精性肝炎模型（表1）。造模期間，鐵皮石斛葉發酵液低、中、高劑量組小鼠飲用威門石斛水，其余各組小鼠飲用純凈水；正常組、模型組、液體飼料對照組每日給予生理鹽水灌胃，水飛薊賓組給予水飛薊賓0.25 mL/10 g，鐵皮石斛葉發酵液低、中、高劑量組分別給予0.125 mL/10 g、0.250 mL/10 g、0.375 mL/10 g 鐵皮石斛葉發酵液灌胃，1 次/d。第8 周末，各組小鼠腹腔注射水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，眼球取血，脫頸處死，取肝組織樣本進行后續實驗。

表1 Lieber-DeCarli液體飼料配方Table 1 Lieber-DeCarli liquid feed formula

1.6 肝組織病理學觀察 在肝右葉同一位置留取組織，一部分置入4%中性甲醛緩沖液中固定，用于HE 病理檢測；另一部分肝組織OCT 包埋制作冰凍切片油紅O染色。

1.7 Luminex檢測技術 取各組小鼠血清上清液50 μL，按照R&D Systems試劑盒說明書進行R&D Luminex磁珠實驗，檢測小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α及CCL2水平。

1.8 血清生化指標檢測 各組小鼠眼球取血后，采用低溫離心方法收集血清樣本，利用全自動生化儀檢測小鼠血清內AST、ALT水平。

1.9 實時熒光定量PCR 實驗 Trizol 法裂解肝組織，提取總RNA并檢測其濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒操作說明書對RNA進行逆轉錄，合成擴增前cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Green依次按照95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40 個循環反應條件下進行擴增。各檢測指標引物信息見表2。結果分析方法為相對定量法，計算方法為2-△△CT。

表2 實時熒光定量PCR引物Table 2 Real-time quantitative PCR primers

1.10 Western Blot 實驗 稱取各組肝組織20 mg，經PBS緩沖液沖洗2 遍，RIPA 細胞裂解液冰上裂解，提取總蛋白。依照每孔40 μg將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE內進行電泳。電泳完成后將PVDF膜鋪于凝膠條帶上，置于轉膜槽中300 mA 恒流轉膜2 h，5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。將膜與小鼠NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-18、IL-1β抗體孵育，4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min。二抗室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min。ECL 化學發光試劑盒對蛋白條帶進行曝光，使用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行分析，計算目標蛋白與內參蛋白灰度值比值作為該蛋白表達量。

1.11 免疫熒光實驗 蠟片烘烤2 h，二甲苯洗滌2 次，每次20 min；無水乙醇10 min 1 次，95%乙醇10 min 1 次，85%乙醇10 min 1 次，75%乙醇10 min 1 次，ddH2O 5 min 1 次；Tris-EDTA 抗原修復；免疫組化筆畫圈封閉60 min；一抗GSDMD 4 ℃過夜。PBS 洗滌3 次，每次5 min，熒光二抗避光室溫孵育50 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min；DAPI 染核，避光10 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min；封片后顯微鏡下觀察。

1.12 統計學方法 采用Graphpad 8.3.0 軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，Levene 檢驗判斷方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鐵皮石斛葉發酵液對酒精性肝炎小鼠血清ALT、AST 的影響 與正常組相比，模型組ALT、AST 顯著升高（P值均＜0.001）；與模型組相比，水飛薊賓組和鐵皮石斛葉發酵液高劑量組ALT 和AST 均明顯下降（P值均＜0.01）（圖1）。

圖1 各組小鼠血清AST、ALT的表達水平Figure 1 Expression levels of AST and ALT in serum of mice in each group

2.2 鐵皮石斛葉發酵液對酒精性肝炎小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α及CCL2的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 及CCL2 顯著升高（P值均＜0.01）；與模型組比較，水飛薊賓組和鐵皮石斛葉發酵液高劑量組小鼠血清炎癥因子水平降低，差異均有統計學意義（P值均＜0.05）（圖2）。

圖2 各組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α及CCL2的表達水平Figure 2 Expression levels of IL-6， IL-1β， TNF-α and CCL2 in serum of mice in each group

2.3 鐵皮石斛葉發酵液對酒精性肝炎小鼠肝臟病理組織學的影響 HE 染色結果顯示，正常組小鼠肝細胞大小一致，排列整齊，肝小葉結構完整，未見病變；液體飼料對照組肝小葉結構清晰，肝竇正常，少量炎性細胞浸潤；模型組和鐵皮石斛葉發酵液低劑量組肝細胞氣球樣變性，肝索排列紊亂，大量中性粒細胞浸潤及少量細胞壞死；鐵皮石斛葉發酵液中劑量組肝小葉結構稍有破壞；水飛薊賓組和鐵皮石斛葉發酵液高劑量組小鼠肝組織結構損傷較輕，大部分肝小葉結構完整（圖3）。

圖3 各組小鼠肝組織油紅O染色及HE染色（×200）Figure 3 Oil red staining and HE staining of liver tissues of mice in each group （×200）

油紅O 染色結果顯示，正常組肝細胞內幾乎未見脂滴，無脂肪變性；液體飼料對照組可見少量散在脂滴；模型組和鐵皮石斛葉發酵液低劑量組油紅O 染色明顯，大量脂滴聚集且相互融合；鐵皮石斛葉發酵液中劑量組少量脂滴聚集；水飛薊賓組和鐵皮石斛葉發酵液高劑量組脂肪變性明顯減輕，多以小脂滴散在存在（圖3）。

2.4 鐵皮石斛葉發酵液對酒精性肝炎小鼠肝組織中NLRP3、GSDMD、GSDMD-N、IL-18 和IL-1β 蛋白表達及IL-18 和IL-1β mRNA 水平的影響 Western Blot 結果顯示，模型組小鼠肝組織中NLRP3、GSDMD、GSDMD-N、IL-18 和IL-1β 蛋白表達水平較正常組均顯著升高（P值均＜0.01）；與模型組相比，水飛薊賓組和鐵皮石斛葉發酵液高劑量組NLRP3、GSDMD、GSDMD-N、IL-18 和IL-1β蛋白表達均明顯降低（P值均＜0.05）（圖4）。實時熒光定量PCR 結果顯示，與正常組相比，模型組肝組織IL-18和IL-1β mRNA表達水平均顯著升高（P值均＜0.01）；鐵皮石斛葉發酵液高劑量組肝組織IL-18 和IL-1β mRNA 表達水平明顯低于模型組（P值均＜0.01）（圖5）。肝組織免疫熒光結果見圖6、7，與正常組比較，模型組胞質中GSDMD 陽性染色面積比顯著增加（P＜0.001）；鐵皮石斛葉發酵液高劑量組細胞質中GSDMD 陽性染色程度較模型組明顯減弱（P＜0.001）。

圖4 各組小鼠肝組織中NLRP3、GSDMD-FL、GSDMD-N、IL-18和IL-1β蛋白表達水平Figure 4 The expression levels of NLRP3， GSDMD-FL， GSDMD-N，IL-18 and IL-1β in liver tissue of mice in each group

圖5 各組小鼠肝組織中IL-18和IL-1β mRNA表達水平Figure 5 The mRNA expression levels of IL-18 and IL-1β in liver tissues of mice in each group

圖6 各組小鼠肝組織中GSDMD的表達（免疫熒光染色，×100）Figure 6 Expression of GSDMD in liver tissues of mice in each group （immunofluorescence staining， ×100）

圖7 各組小鼠肝組織中GSDMD的熒光強度比較Figure 7 Fluorescence intensity of GSDMD in liver tissue of mice in each group

2.5 鐵皮石斛葉發酵液對酒精性肝炎小鼠肝組織中Caspase-1 和Caspase-11 表達的影響 與正常組相比，模型組肝組織中Caspase-1 和Caspase-11 蛋白表達水平均顯著升高（P值均＜0.05）；與模型組相比，鐵皮石斛葉發酵液高劑量組Caspase-1 和Caspase-11 蛋白表達水平均明顯降低（P值均＜0.05），其中Caspase-1 蛋白相對表達量為1.757，較模型組下降26.6%，而Caspase-11 蛋白相對表達量為0.455，較模型組下降70.3%；Caspase-11 較Caspase-1下降幅度更大（圖8）。

圖8 各組小鼠肝組織中Caspase-1和Caspase-11蛋白表達水平Figure 8 Expression levels of Caspase-1 and Caspase-11 proteins in liver tissues of mice in each group

3 討論

酒精性肝炎是酒精（乙醇）相關性肝病的急性臨床表現［9］，全球超過50%的肝臟疾病負擔與過度飲酒有關［10］，嚴重危害人類健康。乙醇的毒性代謝物，特別是乙醛，會對肝細胞造成直接的氧化損傷，并通過形成蛋白質或DNA 加合物而造成間接損傷。線粒體功能障礙及脂質過氧化干擾碳水化合物和脂類代謝導致肝細胞脂肪變性。長期大量飲酒可造成腸道菌群失調、腸黏膜屏障受損及腸壁通透性的增加，大量的內毒素進入門靜脈系統導致腸源性內毒素血癥［11］。而內毒素血癥是激活焦亡經典與非經典通路的最初信號。細胞焦亡是一種由Gesdermin 家族介導的促炎性程序性死亡方式。焦亡細胞中Gesdermin 家族蛋白被激活，使細胞質膜穿孔，細胞發生滲漏，釋放炎癥因子促進肝細胞死亡、脂肪變性、炎癥及纖維化。細胞焦亡主要有依賴Caspase-1的經典通路與依賴Caspase-4/5/11 的非經典通路。酒精性肝炎時，腸道來源的脂多糖通過膜外泡內吞入巨噬細胞，其直接結合Caspase-4/5/11 激活GSDMD，破壞細胞膜的完整性，導致肝細胞裂解死亡并釋放大量的IL-1β 等炎癥介質［12］。Khanova等［13］發現Caspase-11（鼠）/4（人）、IL-18、IL-1β和CCL2等炎性細胞因子及炎性趨化因子的表達水平在酒精性肝炎中顯著升高；當Caspase-11 缺陷時可以抑制GSDMD 蛋白的激活，減輕肝臟炎癥反應。Heo 等［14］發現乙醇通過使TXNIP 過表達促進細胞焦亡，而miR-148a 可抑制TXNIP 表達以改善乙醇誘導的肝細胞NLRP3 炎癥小體激活和細胞焦亡，減輕酒精性肝炎。通過調控焦亡通路中的炎癥因子水平可能是未來酒精性肝炎治療的靶點之一。

目前臨床上應用的護肝藥物種類繁多，但并無針對酒精性肝炎的特效藥物。鐵皮石斛是我國傳統中藥材，富含多糖、生物堿、氨基酸、酚類等多種藥理學活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及解酒護肝等作用。石斛花提取物能降低酒精性肝損傷小鼠血清AST 和ALT水平，減輕肝細胞變性和脂滴積聚［15］。袁慧琦等［16］研究發現鐵皮石斛通過上調Bcl-2 蛋白抑制肝細胞凋亡，減輕小鼠酒精性肝炎。鐵皮石斛多糖可降低IL-1β、IL-6和TNF-α 等炎癥因子的產生，從而減輕酒精所誘導的急性肝損傷［8］。但鐵皮石斛葉發酵液對酒精性肝炎的干預效果及機制目前尚無相關研究報道。

本研究采用經典的Lieber-DeCarli 液體飼料飼養小鼠8周，成功建立酒精性肝炎模型。與模型組相比，鐵皮石斛葉發酵液高劑量組小鼠肝組織HE 染色及油紅O 染色顯示小鼠肝細胞脂肪變性及氣球樣變范圍減少，炎癥細胞浸潤減輕；肝組織焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、GSDMD-N 及炎癥因子IL-1β、IL-18表達均降低（P值均＜0.05），其中介導非經典焦亡通路的Caspase-11蛋白表達下降幅度較Caspase-1更大。

綜上，本研究表明鐵皮石斛葉發酵液可減輕小鼠酒精性肝炎，其機制可能與抑制細胞焦亡通路，尤其是抑制Caspase-11 介導的非經典焦亡通路表達，從而減少TNF-α、IL-1β、IL-18 和CCL2 等炎性細胞因子、趨化因子的釋放，減輕肝細胞炎癥反應及脂肪變性有關。鐵皮石斛葉發酵液可作為防治酒精性肝炎的安全有效藥食同源的新方法。

倫理學聲明：本研究方案于2021 年12 月24 日經由貴州醫科大學實驗動物倫理委員會審批，批號：SYXK（黔）2018-0001，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：周興念負責課題設計，撰寫文章；劉渝洪負責資料分析；秦玉潔、程明亮、張權參與修改論文；李宏負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。