基于響應面法優化柑白蘭地原料酒發酵工藝

胡典綸，余 佶，劉圓圓，麻成金

（吉首大學 食藥兩用資源研究與高值化利用湖南省重點實驗室，湖南吉首 416000）

椪柑（Citrus reticulata 'Ponkan'），蕓香科柑橘屬木本植物果實，原產浙江、湖南等省，現廣泛分布于我國南方地區[1]。我國椪柑資源十分豐富[2]，椪柑果實出汁率高，富含維C、胡蘿卜素、膳食纖維、礦物質等多種成分，具有抗衰老、預防心血管疾病、健脾胃等功效[3]，通常用來鮮食，部分經加工成果汁、果醋及果酒等產品形式[4-5]。然而，由于椪柑產業化加工技術研究不夠，使得椪柑資源難以得到高值化利用而造成浪費。

白蘭地是指將葡萄或其他水果，經發酵、蒸餾、陳釀及調配而成的蒸餾酒；目前，白蘭地原料呈現多元化[6]，但暫時沒有以椪柑為原料。研究利用椪柑汁進行酒精發酵，采用響應面法優化椪柑白蘭地原料酒的發酵工藝條件，制備椪柑白蘭地原料酒，為椪柑白蘭地精深加工提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椪柑鮮果，吉首市優質椪柑基地提供；果酒專用酵母（RW）、生香活性干酵母；果膠酶（20 000 U/g）、橙皮苷酶、柚苷酶；碳酸氫鈉（AR）；蔗糖、檸檬酸，均為食品級。

1.2 儀器與設備

Y966 型多功能榨汁機，上海九陽股份有限公司產品；TDL-40B 型臺式離心機，上海安享科學儀器廠產品；JA-5103N 型高精度電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司產品；PHS-25 數字式pH 計，上海雷磁儀廠產品；WYT-J 型手持糖度計，成都光學廠產品；DK-S28 型電熱恒溫水浴鍋，上海精其儀器有限公司產品；10-20 型精密酒精計，上海醫用儀表廠產品；BSP-250 型生化培養箱，上海博迅醫療生物儀器廠產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程[7]

椪柑鮮果→分選清洗→去皮→榨汁→酶解→離心分離→調節糖酸度→接種酵母→酒精發酵→過濾→椪柑白蘭地原酒→蒸餾→橡木桶貯藏陳釀→椪柑白蘭地。

1.3.2 操作要點

（1）原料篩選與預處理。選用成熟優質椪柑鮮果，清洗后去皮，果肉進行榨汁，制備果漿。

（2）酶解。添加果膠酶40 mg/L，橙皮苷酶0.3 g/L，柚苷酶0.5 g/L，攪拌均勻，于40 ℃水浴中酶解120 min。將酶解后果漿以轉速4 000 r/min 離心10 min，150 目濾布過濾，果汁備用。

（3）調節糖酸度。使用化學法降酸，向果汁中加入碳酸鈉，通過添加蔗糖的方式進行初始含糖量的調節，調整糖度為12%～26%，調整果汁pH 值為3.5～5.5。

（4）接種酵母。將一定量的果酒酵母、生香活性干酵母（質量比2∶1）用10 倍質量分數5%葡萄糖水溶液進行溶解，于35 ℃條件下復水活化40 min，倒入椪柑果汁中混勻，將接種完成后的果汁轉入發酵罐內。

（5）酒精發酵。將接種后的椪柑果汁在恒溫和密封的條件下進行酒精發酵，定時測定糖度、酒精度，觀察發酵液表面變化情況，以保證發酵正常進行，當發酵液殘糖小于4 g/L 時可結束發酵，進入椪柑白蘭地加工的陳釀和蒸餾工序。

1.3.3 單因素試驗

（1）初始糖度。選取酵母添加量0.2%，發酵溫度25 ℃，發酵時間7 d，發酵液pH 值4.0，探討初始糖度（12%，14%，16%，18%，20%，22%，24%，26%，28%）對酒精發酵效果的影響。

（2）酵母添加量。選取初始糖度20%，發酵溫度25 ℃，發酵時間7 d，發酵液pH 值4.0，探討酵母添加量（0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%，0.35%，0.40%）對酒精發酵效果的影響。

（3）發酵時間。選取初始糖度20%，酵母添加量0.2%，發酵溫度25 ℃，發酵液pH 值4.0，探討發酵時間（4，5，6，7，8，9，10 d）對酒精發酵效果的影響。

（4）發酵溫度。選取初始糖度20%，酵母添加量0.2%，發酵時間7 d，發酵液pH 值4.0，探討發酵溫度（18，20，22，24，26，28，30，32 ℃）對酒精發酵效果的影響。

（5）發酵液pH 值。選取初始糖度20%，發酵時間7 d，發酵溫度25 ℃、酵母添加量0.2%，探討發酵液pH 值（3.5，3.8，4.1，4.4，4.7，5.0，5.3）對酒精發酵效果的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

根據Box-behnken 中心試驗設計原理[8-9]和單因素試驗結果，以酵母添加量、初始糖度、發酵溫度為考查因素，酒精度為響應值，設計三因素三水平優化試驗，探究各因素及其交互作用對椪柑白蘭地原料酒發酵效果的影響，最終進行驗證試驗并確定最優發酵工藝條件。試驗重復3 次。

試驗因素與水平設計見表1。

表1 試驗因素與水平設計

1.3.5 理化指標檢測

酒精度測定采用酒精計法；殘糖含量測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；pH 值測定采用酸度計法；糖度測定采用折光計檢測法。重復測定3 次，取平均值。

1.3.6 數據分析

試驗設計與數據處理采用Design Expert 8.0.6，繪圖采用Origin 2021。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵溫度的影響

發酵溫度對酒精度和殘糖含量的影響見圖1。

圖1 發酵溫度對酒精度和殘糖含量的影響

由圖1 可知，隨著發酵溫度的升高，殘糖含量呈先下降后上升的趨勢，酒精度呈先上升后稍有下降的趨勢；當發酵溫度為24 ℃時，殘糖含量達最低值2.18 g/L，酒精度達最高值11.65%Vol。發酵溫度高低與酵母菌生長繁殖關系密切，過低的溫度會抑制酵母菌活性，減緩糖降解過程，導致發酵結束時間延遲且不充分；過高的溫度會加快酵母菌生長繁殖，消耗的糖分不能充分轉化為酒精，發酵不充分，殘糖量偏高，并且酵母由生長對數期提前進入穩定期，發酵結束時間較早，酒精度偏低[10]。為保證原料酒的發酵效果，選擇發酵溫度控制范圍22～26 ℃。

2.1.2 初始糖度的影響

初始糖度對酒精度和殘糖含量的影響見圖2。

圖2 初始糖度對酒精度和殘糖含量的影響

由圖2 可知，隨著初始糖度增大，殘糖含量持續上升，酒精度呈先上升后下降的趨勢。當初始糖度≤22%時，殘糖含量升高平緩，酒精度大幅度升高；當初始糖度為22%～26%時，殘糖含量大幅度升高，酒精度達到最大值12.85%Vol，推測發酵接近完全；當初始糖度＞26%時，殘糖含量繼續升高，酒精度開始降低。原因可能是初始糖度過低，酵母沒有足夠的糖分來轉換成酒精，則酒精度低；過高的初始糖度會增加發酵液的滲透壓，抑制酵母菌發酵，導致殘糖量高、酒精度低[11]。此外，較高的糖度容易引發微生物污染[12]，從而對原料酒品質產生不良影響，故選取初始糖度20%～24%。

2.1.3 酵母添加量的影響

酵母添加量對酒精度和殘糖含量的影響見圖3。

圖3 酵母添加量對酒精度和殘糖含量的影響

由圖3 可知，隨著酵母添加量增大，殘糖含量持續下降，酒精度呈先上升后下降的趨勢；當酵母添加量≥0.20%時，殘糖含量趨于穩定，酒精度達到最大值11.6%Vol 后開始緩慢降低。根據有關文獻報道，在一定范圍內，酵母添加量越大，發酵越充分，進而殘糖量越低、酒精度越高[13]；酵母添加量過高會加快酵母菌自身的呼吸和繁殖，過度消耗營養物質，不利于酒精生成，導致殘糖量和酒精度降低[14]。綜合考量，酵母添加量為0.15%～0.25%。

2.1.4 發酵時間的影響

發酵時間對酒精度和殘糖含量的影響見圖4。

圖4 發酵時間對酒精度和殘糖含量的影響

由圖4 可知，隨著發酵時間延長，殘糖量先大幅度下降、后平緩下降，酒精度快速上升后趨于平穩；發酵時間＞7 d 時，殘糖含量和酒精度變化不明顯；發酵時間為8 d 時，酒精度達最大值11.54%Vol。若發酵時間偏短，酵母菌未充分利用糖分，導致發酵不徹底，造成原料酒的殘糖量高、酒精度低，而當發酵徹底時，酒精度則趨于平穩狀態[15]。考慮到實際生產效率，發酵時間選擇7 d。

2.1.5 發酵液pH 值的影響

發酵液pH 值對酒精度和殘糖含量的影響見圖5。

圖5 發酵液pH 值對酒精度和殘糖含量的影響

由圖5 可知，隨著發酵液pH 值增大，殘糖含量先下降后趨于平穩，酒精度呈先上升后下降的趨勢；當發酵液pH 值4.1 時，酒精度達最大值11.62%Vol。相關研究表明，較低發酵液pH 值會嚴重抑制酵母菌，使得發酵減緩，導致殘糖量高且酒精度低，而較大發酵液pH 值對于雜菌的抑制效果減弱，造成原料酒的品質下降為劣質[16]。因此，選擇發酵液pH 值4.1 左右為宜。

綜上，椪柑白蘭地原料酒的適宜發酵溫度22～26 ℃，初始糖度20%～24%，酵母添加量0.15%～0.25%，發酵時間7 d，發酵液pH 值4.1。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 試驗設計方案與結果

基于上述單因素試驗結果，選取初始糖度、酵母添加量、發酵溫度因素進行Box-behnken 試驗設計，以酒精度為響應值。

響應面優化試驗設計方案及結果見表2。

表2 響應面優化試驗設計方案及結果

2.2.2 建立回歸模型和方差分析

方差分析及顯著性檢驗結果見表3。

表3 方差分析及顯著性檢驗

使用Design Expert 對表2 中的響應值進行分析，建立回歸方程預測模型：

由表3 可知，該回歸模型極顯著（p＜0.000 1），能較好反映椪柑白蘭地原料酒的酒精度與各影響因素之間的線性關系（R2=0.986 6）；調整系數R2Adj=0.969 4，說明該模型擬合程度較高；失擬項不顯著（p=0.360 4＞0.050 0），表明該模型可適用于對椪柑白蘭地原料酒發酵工藝條件優化的分析預測。一次項A，B，C 和二次項A，B，C 影響均達到極顯著水平（p＜0.01），說明考查的3 個因素對椪柑白蘭地原料酒的酒精度影響較大。交互項AB，BC 對響應值影響顯著（p＜0.05），而AC 項影響不顯著（p＞0.05）。從F 值大小可知，3 個因素對椪柑白蘭地原料酒酒精度的影響程度依次為初始糖度＞酵母添加量＞發酵溫度。

2.2.3 各因素交互作用分析

各因素交互作用的響應面圖見圖6。

圖6 各因素交互作用的響應面圖

由圖6 可知，隨著各因素水平的升高，酒精度呈先上升后下降的整體趨勢。曲面坡度越陡，說明其對響應值的影響越大，故各因素對酒精度的影響由大到小依次是A＞B＞C。同時，等高線的形狀能反映出各因素交互作用所產生的影響程度，等高線越接近橢圓形，說明交互作用越顯著[17]。據圖6 分析可得，AB，BC 線較密集且呈橢圓狀，表明初始糖度和酵母添加量、發酵溫度和酵母添加量交互作用較強，影響顯著（p＜0.05）；AC 線接近圓形，表明初始糖度和發酵溫度交互項影響不顯著。響應面分析與方差分析結果相一致。

2.2.4 驗證試驗

通過Design Expert 分析優化，以酒精度為評價指標，椪柑白蘭地原料酒發酵工藝優化條件為酵母添加量0.22%，初始糖度23.55%，發酵溫度24.93 ℃，此條件下的酒精度為13.072 9%Vol。結合單因素試驗和實際可操作性，調整工藝參數為酵母添加量0.22%，初始糖度24%，發酵溫度25 ℃，發酵時間7 d，發酵液pH 值4.1，驗證試驗取3 次重復試驗的平均值，酒精度為13.05%Vol，且接近模型理論預測值，表明該理論模型與試驗實際結果的吻合度較高，采用響應面法優化后的椪柑白蘭地原料酒發酵工藝條件具有較高參考價值。

3 結論

以椪柑果汁為原料，在開展椪柑白蘭地原料酒發酵的單因素試驗基礎上，通過Box-behnken 試驗設計對發酵工藝條件進行優化，試驗結果表明酵母用量、初始糖度、發酵溫度等3 個因素對椪柑白蘭地原料酒的發酵效果影響較大，影響大小依次為初始糖度＞酵母添加量＞發酵溫度，確定椪柑白蘭地原料酒發酵工藝優化條件為酵母添加量0.22%，初始糖度24%，發酵溫度25 ℃，發酵時間7 d，發酵液pH 值4.1。在此優化條件下，得到椪柑白蘭地原料酒的酒精度為13.05%Vol。綜上，響應面法用于椪柑白蘭地原料酒發酵工藝條件優化為可行方法。